一种生物转化纤维素水解液生产D‑1,2,4‑丁三醇的方法

摘要

本发明公开了一种生物转化纤维素水解液生产D‑1,2,4‑丁三醇的方法。该方法为构建克隆表达2‑酮酸脱羧酶和D‑木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶和醇脱氢酶的基因，并将构建好的基因转入敲除木糖异构酶的宿主菌的细胞内得基因工程菌，培养基因工程菌并接种至纤维素水解液中发酵生产D‑1,2,4‑丁三醇。本发明方法简单易行，产量高，适合产业化。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种生物转化纤维素水解液生产D-1,2,4-丁三醇的方法。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇是一种重要的非天然多元醇，是许多天然产物合成中的重要底物，也是许多手性化合物的合成前体。在军事上，D-1,2,4-丁三醇可以用来合成作为火箭推进剂的丁三醇三硝酸酯(BTTN)。在医药方面，D-1,2,4-丁三醇可以用来制备降胆固醇类药Movinolin、抗癌药物compatin、治疗皮肤病药物羟基二十碳四烯酸(12-HETE)及艾滋病药物3-羟基-四氢呋喃等。

目前1,2,4-丁三醇的商业生产多采用化学合成法，如Adkins 等报道利用苹果酸还原的方法，使用不同的催化剂(Cu-Cr, Cu-Al, Ru-Re)，在2900-5000 psi 的H2压力下和60-160 ºC的条件下，可将苹果酸以60%-80%的转化率转化为1,2,4-丁三醇。该方法存在反应条件苛刻，环境污染严重，生产危险性大，副产物多等弊端。近年来，以生物法合成丁三醇的研究受到广泛关注。

生物丁三醇传统生产方法会消耗大量农产品，为此研究利用多种生物基废料生产丁醇的新技术，解决与人争粮的问题，以非粮作物为原材料生产生物丁三醇是未来发展的方向。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅改善了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。

目前国内外丁三醇发酵方面的研究多集中在直接以木糖为原料上，且产量不高，一般在0.88-3.96g/L，以纤维素为原料的还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物转化纤维素水解液生产D-1,2,4-丁三醇的方法，降低了生产成本的同时提高了1,2,4-丁三醇的产量。

为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案：

一种生物转化纤维素水解液生产D-1,2,4-丁三醇的方法，构建克隆表达2-酮酸脱羧酶和D-木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶和醇脱氢酶的基因，并将构建好的基因转入敲除木糖异构酶的宿主菌的细胞内得基因工程菌，培养基因工程菌并接种至纤维素水解液中发酵生产D-1,2,4-丁三醇。

作为优选的是，所述的2-酮酸脱羧酶（mdlC）,GenBank: AY143338.1 ；D-木糖脱氢酶（xylB）,Gene ID: 7329904；木糖酸脱水酶（yjhG）,Gene ID: 946829；醇脱氢酶（adhP）,Gene ID:00 946036；木糖异构酶（xylA）,Gene ID: 948141。

作为优选的是，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。

作为上述方法优选的是，具体包括以下步骤：

步骤1，构建克隆表达2-酮酸脱羧酶（mdlC）,D-木糖脱氢酶（xylB）,木糖酸脱水酶（yjhG）和醇脱氢酶（adhP）,敲除宿主菌木糖利用和D-BT 合成中间代谢物分解途径中木糖异构酶（xylA）的基因，得基因工程菌；

步骤2，木质纤维素的水解及预处理

将稀硫酸与玉米芯混合后的悬浮水解液经高温灭菌后，加入Ca(OH)₂溶液调节pH至7.2，过滤后向滤液中加入活性炭，再过滤得玉米芯水解液；

步骤3，发酵培养基的制备

每升玉米芯水解液中加入10g/L Nacl, 5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，灭菌备用；

步骤4，将基因工程菌接种至发酵培养基中，加入IPTG诱导发酵得产物D-1,2,4-丁三醇。

作为步骤2优选是，所述步骤2中稀硫酸的体积分数为2%，玉米芯与稀硫酸的质量体积比为1:5，活性炭与滤液的质量体积比为2%。

作为步骤4优选的是，发酵72h。

有益效果

本发明以纤维素为原料，通过构建基因工程菌的方法来生产D-1,2,4-丁三醇，减少了支路途径，提高了1，2，4-丁三醇的产率，同时节约了成本，提高了产物的纯度，可大规模生产。

附图说明

图1为培养温度对以玉米芯水解液为底物生产丁三醇的影响；

图2为培养温度37℃加入缓冲液后以玉米芯水解液为底物生产丁三醇。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1 构建基因工程菌

构建克隆表达2-酮酸脱羧酶（mdlC）,D-木糖脱氢酶（xylB）,木糖酸脱水酶（yjhG）和醇脱氢酶（adhP）,敲除宿主菌木糖利用和D-BT 合成中间代谢物分解途径中木糖异构酶（xylA）的基因，得基因工程菌，其中，2-酮酸脱羧酶（mdlC）,GenBank: AY143338.1 ；D-木糖脱氢酶（xylB）,Gene ID: 7329904；木糖酸脱水酶（yjhG）,Gene ID: 946829；醇脱氢酶（adhP）,Gene ID:00 946036；木糖异构酶（xylA）,Gene ID: 948141。

实施例2 不同的发酵温度对以玉米芯水解液为底物生产丁三醇的影响

2%（v/v）的硫酸与玉米芯水解液比例为1:5（w/v）混合后的悬浮水解液，在高压灭菌锅121℃灭菌20min。加入碱性试剂Ca(OH)₂中和硫酸，加入的Ca(OH)₂的浓度等于相同硫酸浓度的摩尔数，再加入NaOH调节PH至7.2。最后用滤纸过滤掉玉米芯水解液预处理方法中的固体物质，再分别加入2%（w/v）活性炭至玉米芯水解液中，50℃加热30分钟，再用滤纸过滤掉活性炭，得到澄清的玉米芯水解液。得到的玉米芯水解液中木糖的浓度为44g/L，每升玉米芯水解液中加入10g/L>

实施例3 缓冲液对以玉米芯水解液为底物生产丁三醇的影响

2%（v/v）的硫酸与玉米芯水解液比例为1:5（w/v）混合后的悬浮水解液，在高压灭菌锅121℃灭菌20min。加入碱性试剂Ca(OH)₂中和硫酸，加入的Ca(OH)₂的浓度等于相同硫酸浓度的摩尔数，再加入NaOH调节PH至7.2。最后用滤纸过滤掉玉米芯水解液中的固体物质，再加入2%（w/v）活性炭至玉米芯水解液中，50℃加热30分钟，再用滤纸过滤掉活性炭，得到澄清的玉米芯水解液。测得澄清玉米芯水解液中木糖的浓度为44g/L，每升玉米芯水解液中加入10g/L>3调节PH，37℃200rmp发酵72h，得到4.52g/L的D-1,2,4-丁三醇。

检测结果

D-1,2,4-丁三醇的高效液相色谱检测方法：

D-1,2,4-丁三醇的检测条件为：Agilent 1200 高效液相色谱；Biorad HPX-87H 有机酸分析柱；流动相为 0.005 M 硫酸；柱温为 60℃；流速 0.6 mL/min；示差检测器。

将实施例2和实施例3的发酵产物按照上述方法检测，结果分别如图1和图2所示，其中，发酵温度为37℃时产量最高，另外，缓冲液的加入提高了D-1,2,4-丁三醇的产量，同等条件下D-1,2,4-丁三醇的量为4.52g/L。