一种测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯浓度的方法

摘要

本发明公开了一种测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯的浓度。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法。

背景技术

8-表黄独素E乙酸酯(8-epidiosbulbin E acetate)是从薯蓣科薯蓣属多年生草本植物黄独(Dioscorea bulbifera L.)的干燥块茎中分离得到的呋喃正二萜类新化合物。体外实验证明8-表黄独素E乙酸酯具有显著的抗肿瘤、抗真菌、抗炎等生物活性，是一种具有良好开发前景的新药源化合物。其结构式如下：

目前尚未关于8-表黄独素E乙酸酯体内测定方法的文献报道。本发明建立了8-表黄独素E乙酸酯在大鼠体内的测定方法，通过该方法对8-表黄独素E乙酸酯的药物代谢情况进行探索性研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：

(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；

(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱；流动相：体积比为70∶30的甲醇与0.1％甲酸水溶液；流速：0.2-0.5mL·min^-1；柱温：30-40℃；进样量5μL；洗脱方式为等度洗脱；

(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，Fragmentor 110，Collision Energy 10；

(4)计算：采用内标法，以8-表黄独素E乙酸酯和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算8-表黄独素E乙酸酯的浓度。

步骤(1)中，取血浆样品50μL，加入内标800ng·mL^-1替硝唑甲醇溶液10μL和190μL甲醇或乙腈，振荡3min，12000rpm离心10min，离心后取上清液。

步骤(2)中，色谱柱长度为100mm，内径为2.0mm，填料粒径为3μm。

其中，所述的血浆为给予了含8-表黄独素E乙酸酯药物的血浆。

其中，所述血浆为人或动物的血浆。

其中，所述血浆为大鼠血浆。

有益效果：本发明方法与现有技术相比具有如下优势：

(1)预处理方法简便：一步有机溶媒蛋白沉淀法，适用于常规测定。

(2)专属性强：采用Phenomenex Gemini C18色谱柱作为固定相，甲醇和水的混合液作为流动相，等度洗脱，8-表黄独素E乙酸酯保留时间为1.5min左右，内标替硝唑保留时间为1.3min左右，2min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。

(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1ng·mL^-1。

(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为8-表黄独素E乙酸酯的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1～1000ng·mL^-1，日内和日间精密度RSD均小于8.4％。

附图说明

图1为甲醇加入8-表黄独素E乙酸酯和内标对照品的质谱图。

图2为大鼠空白血浆的质谱图。

图3为大鼠空白血浆加入8-表黄独素E乙酸酯和内标对照品的质谱图。

图4为大鼠给予8-表黄独素E乙酸酯后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图。

注：图1～图4中离子通道1为8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，保留时间为1.5min左右；离子选择通道2为内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，保留时间为1.3min左右。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例：大鼠血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的测定

一、实验材料与仪器

8-表黄独素E乙酸酯：分离自黄独的干燥块茎；替硝唑(内标)：购于中国药品生物制品检定所，批号：100336-200703；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(Merck Company)。

Agilent G6430LC-MS/MS液质联用仪(美国Agilent公司，所配高效液相仪为Agilent 1290)；MassHunter数据处理系统(version B.05.00)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5纯水机(法国Millipore公司)；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。

二、液质条件

1.液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(dp 3μm，100mm ID×2.0mm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液(70∶30，v/v)；流速：0.2mL·min^-1；柱温：35℃。

2.质谱条件

离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，Fragmentor 110，Collision Energy 10。

三、实验过程：

1.8-表黄独素E乙酸酯标准溶液的配制：

精密称取8-表黄独素E乙酸酯10.14mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.014mg·mL^-18-表黄独素E乙酸酯的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释，配成浓度分别为5、25、50、100、250、500、1000、2500、5000ng·mL^-1的8-表黄独素E乙酸酯标准溶液。

2.大鼠血浆样品的采集与处理：

大鼠尾静脉注射8-表黄独素E乙酸酯溶液，给药量为1mg·kg^-1，于注射前及注射后5、10、20、30、45min、1、2、2.5、3、4h眼眶采血200μL，注入肝素管内，3000rpm离心10min，制备血浆。取大鼠血浆50μL，加入800ng·mL^-1内标替硝唑甲醇溶液10μL，甲醇190μL，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。

3.专属性：

取没有给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠空白血浆50μL，加入200μL甲醇，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。

取1.5mL塑料离心管数支，加入8-表黄独素E乙酸酯标准溶液10μL，40℃氮气吹干，加入没有给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠空白血浆50μL，旋涡30s混匀，加入替硝唑甲醇溶液(内标，800ng·mL^-1)10μL，甲醇190μL，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。

结果显示，在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰，8-表黄独素E乙酸酯保留时间在1.5min左右，内标替硝唑保留时间在1.3min左右。8-表黄独素E乙酸酯和内标互不干扰，峰形良好，基线平稳。

4.线性试验

大鼠血浆标准曲线：取1.5mL塑料离心管数支，分别精密加入不同浓度的8-表黄独素E乙酸酯标准溶液10μL，40℃氮气吹干，加入没有给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠空白血浆50μL旋涡30s混匀，配成含8-表黄独素E乙酸酯的浓度分别为1、5、10、20、50、100、200、500、1000ng·mL^-1的含药血浆。加入替硝唑甲醇溶液(内标，800ng·mL^-1)10μL，甲醇190μL，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。计算8-表黄独素E乙酸酯和内标峰面积的比值f，以峰面积比值f对血药浓度C作回归计算，得回归方程：f＝0.0025×C-0.0012(r＝0.997)，W＝1/cc，8-表黄独素E乙酸酯血浆浓度在1～1000ng·mL^-1范围内线性关系良好。最低定量限为1ng·mL^-1。

5.准确度和精密度

按照大鼠血浆标准曲线方法配制含8-表黄独素E乙酸酯浓度为2、50、500ng·mL^-1的低、中、高的含8-表黄独素E乙酸酯血浆样品，按“大鼠血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天，每天每个浓度各做5份样品，计算8-表黄独素E乙酸酯峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的血浆标准曲线中求得8-表黄独素E乙酸酯实测浓度，由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD)，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示，日内和日间精密度RSD均小于8.4％，准确度符合要求。

6.测定结果

上述6只给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠血浆中8-表黄独素E乙酸酯含量(给药后30min)分别为35.58、40.27、78.37、48.19、43.38、50.33ng·mL^-1。