一种衍生化‑色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法

摘要

本发明公开了一种衍生化‑色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，包括以下步骤：(1)利用氨基脲与衍生化试剂反应，用HPLC/UV检测，绘制得到以氨基脲浓度为横坐标，以衍生化产物特征峰面积为纵坐标的标准曲线；(2)取待测样品，用萃取剂超声萃取，离心取上清液；向上清液中加入衍生化试剂、沉淀剂，离心后取上清液，并经过有机滤膜过滤，得到滤液；(3)样将步骤(2)中的滤液用HPLC/UV检测，读取衍生化产物特征峰面积，对照标准曲线，得到待测样品中氨基脲的含量。相对于现有技术，通过衍生化试剂，增强衍生化物的紫外吸收，方便检测；并且检测仪器简单普遍，检测成本低，并有利于氨基脲的快速检测，可用于大规模的样品检测，适于标准化。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全监测领域，尤其涉及一种衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，能准确检测面粉或者面制品中残留的氨基脲。

背景技术

氨基脲属于酰肼系化合物，通常被作为一种标识物来检测非法使用的违禁类的呋喃西林类抗生素。最近研究发现，在玻璃瓶的瓶盖中用于密封的使用偶氮甲酰胺作为增塑剂的橡胶垫圈中含有氨基脲，而以偶氮甲酰胺作为增筋剂的面粉加工成面制品的过程中也会产生氨基脲。

氨基脲(semicarbazide，SEM)是一种经研究表明具有致癌性、致突变和可能的遗传毒性的倍受食品安全关注的高风险物质。食品中的氨基脲来源主要有3个，一是动物源性的氨基脲，主要来自于兽药中的呋喃西林药物的代谢产物；二是食品包装袋和罐装塑料盖中的发泡剂；三是面粉、面制品中增筋剂偶氮甲酰氨的受潮、受热分解。

动物源性食品中的氨基脲主要来自所使用的硝基呋喃类抗生素的代谢产物。硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因。由于硝基呋喃类抗生素及其代谢物氨基脲具有较强的致癌、致突变、致畸形等毒副作用，已被大多数国家禁止，欧盟已于1995年禁止在食品中使用该类药物，根据欧盟指令，硝基呋喃代谢物残留检测方法的检出限性能要求(MRPL)为1μg/kg。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃的禁令。

面粉或面制品中的氨基脲主要来自其增筋剂偶氮甲酰胺(azodicarbonamide，ADA)的分解产物，其分解过程是ADA在湿润或高温的条件下分解产生氨基脲，ADA还可以经过小麦蛋白还原转化为联二脲(biurea，HDC)，HDC进一步降解转化为氨基脲(SEM)。偶氮甲酰胺在中国、加拿大、美国等国家作为一种被允许添加最大量不超过45mg/kg的添加剂。而我国并没有对面粉或者面制品中的偶氮甲酰胺的代谢产物氨基脲的相关检测标准和限量要求。

根据文献报道，国内外通常采用高效液相串联质谱法检测氨基脲。用甲醇-水溶液进行提取，加入同位素内标液，加入衍生化试剂2-硝基苯甲醛进行衍生反应，用磷酸缓冲盐调PH，离心，过SPE小柱，用乙酸乙酯洗脱，氮吹，复溶，过膜，经高效液相色谱串联质谱检测(Ye,J.,et al.,Assessment of the Determination of Azodicarbonamide and Its Decomposition Product Semicarbazide:Investigation of Variation in Flour and Flour Products.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011.59(17):p.9313-9318.)。使用高效液相串联质谱法检测氨基脲，使用的仪器价格昂贵，且同位素内标物价格同样昂贵，样品前处理过程复杂，仪器操作专业性强，方法不易普及。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺点和不足，提供一种衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，所述方法能够简便、准确的测定残留氨基脲的含量。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的绘制：配制浓度为0.01mg/L-2mg/L的一系列的氨基脲标准溶液，然后配制浓度对应为氨基脲标准溶液的100-1000倍的一系列衍生化试剂标准溶液；取一定体积的氨基脲标准溶液，对应加入0.1倍体积的衍生化试剂标准溶液，反应得到衍生化产物，用HPLC/UV检测，绘制得到以氨基脲浓度为横坐标，以衍生化产物特征峰面积为纵坐标的标准曲线；

(2)样品预处理：取待测样品，用萃取剂超声萃取，离心取上清液；向上清液中加入衍生化试剂、沉淀剂，离心后取上清液，并经过有机滤膜过滤，得到滤液；

(3)样品中氨基脲浓度测定：将步骤(2)中的滤液用HPLC/UV检测，检测条件与步骤(1)相同，读取衍生化产物特征峰面积，对照标准曲线，得到待测样品中氨基脲的含量。

相对于现有技术，本发明的衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，通过衍生化试剂，增强衍生化物的紫外吸收，方便检测；并且检测仪器简单普遍，检测成本低，并有利于氨基脲的快速检测，可用于大规模的样品检测，适于标准化。

进一步，所述衍生化试剂为4-硝基苯甲酰氯。氨基脲的紫外吸收很弱，难以通过HPLC/UV直接测定，而通过与衍生化试剂4-硝基苯甲酰氯反应，生成的衍生化产物具有较好的紫外吸收，便于检测。

进一步，所述步骤(2)中的衍生化试剂浓度为5.4mmol/L。

进一步，所述HPLC/UV的检测条件为：色谱柱为C18柱或ODS反相色谱柱；流动相为体积分数0.2％的乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；UV的检测波长为λ＝261nm。

进一步，所述梯度洗脱程序为：在时间为0min、13min、14min、16min、17min、22min时对应的流动相0.2％的乙酸溶液与乙腈的体积比分别为95:5、70:30、40:60、40:60、95:5、95:5。

进一步，所述步骤(1)中向氨基脲中加入的4-硝基苯甲酰氯的物质的量为氨基脲物质的量的50倍。

进一步，所述步骤(2)中萃取剂为超纯水；所述离心条件为4200r/min，离心5min。用超纯水提取样品中的氨基脲，减少了有机试剂的使用。

进一步，所述步骤(1)中氨基脲标准溶液为纯水中性溶液，4-硝基苯甲酰氯标准溶液为乙腈溶液，且二者混合后于室温下反应。

进一步，所述步骤(2)中的沉淀剂为亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液。

进一步，所述亚铁氰化钾的浓度为106g/L，所述乙酸锌溶液的浓度为220g/L。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是本发明的标准曲线，其中，横坐标为氨基脲的浓度，纵坐标为氨基脲衍生化产物的峰面积。

图2是实施例1中以油条作为待测样品的衍生化产物的HPLC-UV检测图谱，其中，a为1mg/L的氨基脲标准样品；b为油条样品加标处理后的衍生化产物；c为油条样品处理后的衍生化产物。

图3是实施例2中以牛耳仔作为待测样品的衍生化产物的HPLC-UV检测图谱，其中，a为1mg/L的氨基脲标准样品；b为牛耳仔样品加标处理后的衍生化产物；c为牛耳仔样品处理后的衍生化产物。

具体实施方式

本发明公开了一种衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的绘制：配制浓度为0.01mg/L-2mg/L的一系列的氨基脲标准溶液，然后配制浓度对应为氨基脲标准溶液的100-1000倍的一系列衍生化试剂标准溶液；取一定体积的氨基脲标准溶液，对应加入0.1倍体积的衍生化试剂标准溶液，反应得到衍生化产物，用HPLC/UV检测，绘制得到以氨基脲浓度为横坐标，以衍生化产物特征峰面积为纵坐标的标准曲线；

其中，所述衍生化试剂为4-硝基苯甲酰氯，所述4-硝基苯甲酰氯与氨基脲的反应方程式如下：氨基脲的紫外吸收很弱，难以通过HPLC/UV直接测定，而通过与衍生化试剂4-硝基苯甲酰氯反应，生成的衍生化产物具有较好的紫外吸收，便于检测；

(2)样品预处理：取待测样品，用超纯水超声萃取，离心取上清液；向上清液中加入衍生化试剂、沉淀剂，离心后取上清液，并经过有机滤膜过滤，得到滤液；

(3)样品中氨基脲浓度测定：将步骤(2)中的滤液用HPLC/UV检测，检测条件与步骤(1)相同，读取衍生化产物特征峰面积，对照标准曲线，得到待测样品中氨基脲的含量。

其中，所述步骤(1)中向氨基脲中加入的4-硝基苯甲酰氯的物质的量为氨基脲物质的量的50倍。即所述一系列的4-硝基苯甲酰氯标准溶液浓度分别为0.01mg/L-2mg/L的一系列的氨基脲标准溶液的500倍。

在本发明中，氨基脲与衍生化试剂4-硝基苯甲酰氯衍生化的优化条件为：在室温下，中性溶液中反应，且4-硝基苯甲酰氯的物质的量是氨基脲的物质的量的50倍。

实施例1

在本实施例中，以油条样品作为待测样品，所述油条中残留氨基脲的具体分析方法如下。

(1)标准曲线的绘制：准确称量氨基脲0.0500g，用超纯水定容于50mL容量瓶中，配制成1000mg/L的氨基脲储备液。用超纯水逐级稀释配制0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的一系列氨基脲标准溶液。准确称量4-硝基苯甲酰氯0.0500g，用乙腈定容于50mL容量瓶中，配制成1000mg/L的4-硝基苯甲酰氯储备液，用乙腈逐级稀释配制5mg/L、25mg/L、50mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L的一系列4-硝基苯甲酰氯标准溶液。分别取1mL的氨基脲标准溶液加入2mL的进样瓶中，对应加入100μL的4-硝基苯甲酰氯标准溶液，常温反应后得到衍生化产物，用HPLC/UV检测，绘制得到以氨基脲浓度为横坐标，以衍生化产物特征峰面积为纵坐标的标准曲线。请参阅图1，其是本发明的标准曲线，所述标准曲线的关系式为：Y＝107660.55*X-31.10，RSD<1.9％，检出限为：1.8μg/L，相关系数R²＝0.9991线性良好，可用于定量样品中氨基脲的含量；

其中，所述HPLC/UV的检测条件为：色谱柱为C18柱或ODS反相色谱柱；流动相为体积分数0.2％的乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；UV的检测波长为λ＝261nm。所述梯度洗脱对应流动相的体积比如下表1：

表1 梯度洗脱程序不同洗脱时间对应的流动相的体积比

(2)样品预处理：准确称量2.0000g(精确到0.1mg)油条于50mL的离心管中，加入超纯水20mL，涡旋均匀，超声30min，在4200r/min条件下离心5min，移取16mL上层液，向上层液加入2mL的5.4mmol/L的4-硝基苯甲酰氯，加入浓度为106g/L的1mL的K₄Fe(CN)₆和浓度为220g/L的1mL的Zn(CH₃COO)₂，在4200r/min条件下离心5min，取离心之后的上清液1mL过0.22μm有机滤膜，得到滤液。在步骤(2)中，油炸类面制品所用的沉淀剂为浓度为106g/L的1mL的K₄Fe(CN)₆和浓度为220g/L的1mL的Zn(CH₃COO)₂，面粉及非油炸类的面制品所用的沉淀剂为浓度为106g/L的0.5mL的K₄Fe(CN)₆和浓度为220g/L的1mL的Zn(CH₃COO)₂。

(3)样品中氨基脲浓度测定：将滤液进行HPLC-UV测试，测试条件与步骤(1)相同。请参阅图2，其是本实施例中以油条作为待测样品的衍生化产物的HPLC-UV检测图谱。读取衍生化物产物特征峰面积，对照标准曲线，计算得到油条样品中氨基脲的含量。在本实施例中，计算得到油条中氨基脲含量为8.19-9.18mg/kg，加标回收率为95.5％-105％。

相对于现有技术，本发明的衍生化-色谱分析面粉及面制品中残留氨基脲的方法，用超纯水提取样品中的氨基脲，减少了有机试剂的使用，通过衍生化试剂，增强衍生化物的紫外吸收，方便检测；并且检测仪器简单普遍，检测成本低，并有利于氨基脲的快速检测，可用于大规模的样品检测，适于标准化。

实施例2

本实施例与实施例1大致相同，其不同之处主要在于待测样品不同，本实施例中，所述待测样品为牛耳仔，所述牛耳仔中残留氨基脲的具体分析方法如下。

(1)标准曲线的绘制：准确称量氨基脲0.0500g，用超纯水定容于50mL容量瓶中，配制成1000mg/L的氨基脲储备液。用超纯水逐级稀释配制0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的一系列氨基脲标准溶液。准确称量4-硝基苯甲酰氯0.0500g，用乙腈定容于50mL容量瓶中，配制成1000mg/L的4-硝基苯甲酰氯储备液，用乙腈逐级稀释配制5mg/L、25mg/L、50mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L的一系列4-硝基苯甲酰氯标准溶液。分别取1mL的氨基脲标准溶液加入2mL的进样瓶中，对应加入100μL的4-硝基苯甲酰氯标准溶液，常温反应后得到衍生化产物，用HPLC/UV检测，绘制得到以氨基脲浓度为横坐标，以衍生化产物特征峰面积为纵坐标的标准曲线。请参阅图1，其是本发明的标准曲线，所述标准曲线的关系式为：Y＝107660.55*X-31.10，RSD<1.9％，检出限为：1.8μg/L，相关系数R²＝0.9991线性良好，可用于定量样品中氨基脲的含量。其中，所述HPLC/UV的检测条件为：色谱柱为C18柱或ODS反相色谱柱；流动相为体积分数0.2％的乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；UV的检测波长为λ＝261nm。所述梯度洗脱对应流动相的体积比如下表2：

表2 梯度洗脱程序不同洗脱时间对应的流动相的体积比

(2)样品预处理：准确称量2.0000g(精确到0.1mg)牛耳仔于50mL的离心管中，加入超纯水20mL，涡旋均匀，超声30min，在4200r/min条件下离心5min，移取16mL上层液，向上层液加入2mL的5.4mmol/L的4-硝基苯甲酰氯，加入浓度为106g/L的1mL的K₄Fe(CN)₆和浓度为220g/L的1mL的Zn(CH₃COO)₂，在4200r/min条件下离心5min，取离心之后的上清液1mL过0.22μm有机滤膜，得到滤液。

(3)样品中氨基脲浓度测定：将滤液进行HPLC-UV测试，测试条件与步骤(1)相同。请参阅图3，其是本实施例中以牛耳仔作为待测样品的衍生化产物的HPLC-UV检测图谱。读取衍生化物产物特征峰面积，对照标准曲线，计算得到牛耳仔样品中氨基脲的含量。在本实施例中，计算得到牛耳仔中氨基脲含量为1.27-1.37mg/kg，加标回收率为76.6％-92.1％。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。