两个纹枯病菌诱导的新顺式作用元件的鉴定及其应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了两个受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件及其应用，这两个元件来源于纹枯病抗病相关基因GRMZM2G315431上游的启动子序列，具体应用时将绿色荧光蛋白基因和这两个元件的顺式串联重复融合后得到重组DNA，转化水稻得到新的转基因植物。在转基因水稻中绿色荧光蛋白基因的表达受纹枯病菌侵染的调控；这样就可以利用本发明顺式作用元件构建植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了两个玉米纹枯病菌诱导顺式作用元件，可用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。

背景技术

由真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来巨大影响。植物拥有两套不同的抗性机制：一是被动防御机制，是指一些抗性相关的形态结构，如表皮和坚硬的细胞壁(Brady JD,Fry S.Formation of di-isodityrosine and loss of isodityrosinein the cell walls of tomato cell-suspension cultures treated with fungalelicitors or H₂O₂.Plant>

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。

目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子，为后来的启动子研究奠定了基础。烟草的Sar8.2b基因受水杨酸(SA)诱导，在其启动子上发现了几个顺式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof结合序列。SA诱导Sar8.2b基因表达可能存在于-728至-927bp和-197至-351bp的区域的顺式因子中(Song F,GoodmanRM.Cloning and identification of the promoter of the tobacco Sar8.2b gene,agene involved in systemic acquired resistance.Gene 2002,290:115-124.)。玉米蔗糖合成酶I只在韧皮部细胞中表达(Yang NS,Russell D.Maize sucrose synthase-promoter directs phloem cell specific expression of gus gene in transgenictobacco plants.Proc Natl Acad Sci 1990,87:4144-4148.)。PsGNS2启动子只在种子中特异表达(Buchner P,Rochat C,Wuilleme S,Boutin JP.Characterization of atissue-specific and developmentally regulated beta-1,3-glucanase gene in pea(Pisum sativum).Plant Mol Biol 2002,49:171-186.)。

玉米是最重要的粮食作物之一，玉米的真菌病害以及细菌病害都会造成产量减少及品质下降。玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。因此如何利用玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。

发明人在ZL201410104914.2中公开了一个玉米病原菌诱导启动子pGRMZM2G315431，该启动子能够被玉米纹枯病菌YWK-196,水稻白叶枯病病菌及细菌性条斑病病菌激活，但是针对该启动子的具体功能分析现有技术中还未做出，无法揭示其更深层的性质和功能。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，特别是在ZL201410104914.2中公开技术的基础上，获得了两个受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件，这两个元件均能够响应纹枯病菌侵染而不能被水稻白叶枯病病菌和细菌性条斑病菌激活,可见这两个元件是纹枯病菌特异性诱导调控元件，可以利用本发明调控元件构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。

发明人在ZL201410104914.2公开的技术上，针对GRMZM2G315413启动子-1243至-1228区域进行截短，确定了-1243至-1239和-1232至-1228这两段序列均为响应纹枯病菌侵染的作用元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将其在水稻中稳定表达后发现，这两个作用元件仅能够被纹枯病菌激活，而不能被白叶枯病菌和细菌性条斑病菌激活。

在此基础上，发明人利用绿色荧光蛋白基因和这两个元件的顺式串联重复融合后得到重组DNA，转化水稻得到新的转基因植物，实验证实在转基因水稻中绿色荧光蛋白基因的表达受纹枯病菌侵染的调控；由于本领域中绿色荧光蛋白基因作为一种可视化的标记基因，在启动子及调控元件研究中是一种普遍使用的标记基因，可以根据其验证调控元件的功能，基于这一情况，可证明完全可以利用本发明顺式作用元件构建植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。

综上所述，本发明的发明人提供了两个受纹枯病菌特异诱导的作用元件，其功能研究有助于揭示GRMZM2G315431基因的表达调控机理，并拓宽了启动子及作用元件在基础研究和抗病基因工程中的应用。

附图说明

图1为GRMZM2G315413启动子-1243至-1228区域截短片段在烟草中瞬时表达后受到纹枯病菌诱导GFP荧光观察及定量分析结果灰度图；

图中a为-1243至-1228截短示意图；b为各截短片段病原诱导活性GFP荧光检测结果；c为各截短片段病原诱导活性GFP定量分析结果；

其中不接菌为对照，接种24h后进行荧光观察及定量检测，结果发现-1243至-1239和-1232至-1228片段能够被纹枯病菌激活，说明这两段序列为纹枯病菌诱导元件；

图2为本发明所述作用元件在烟草中瞬时表达后受到纹枯病菌诱导GFP荧光观察及定量分析结果灰度图，图中a为调控元件病原诱导活性GFP荧光观察结果；b为调控元件病原诱导活性GFP定量分析结果；

其中不接菌为对照，接种24h后进行荧光观察及定量检测，结果发现将GTTGA串联重复两次后其病原诱导活性基本与全长GRMZM2G315431启动子相当，而TATTT串联重复两次后的诱导活性与单个元件的活性相当；

图3为本发明所述作用元件转化水稻中花11受到玉米纹枯病菌诱导后GFP荧光观察及定量结果灰度图，图中a为转基因水稻接种纹枯病菌后GFP荧光检测结果；b为转基因水稻接种纹枯病菌后GFP定量检测结果；

每个元件选取3个T₁代转基因株系，以不接菌为对照，发现将GTTGA串联重复两次后其病原诱导活性基本与全长GRMZM2G315431启动子相当，而TATTT串联重复两次后的诱导活性与单个元件的活性相当，说明稳定表达与瞬时表达结果一致；

图4本发明所述作用元件转化水稻中花11受到白叶枯病菌(a)和细菌性条斑病菌(b)诱导后GFP定量检测结果；

以不接菌为对照，结果发现接种白叶枯病菌和细菌性条斑病菌后均没有检测到显著的荧光信号，说明这两个元件不能响应白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的侵染；

图5为图1的彩色示意图；

图6为图2的彩色示意图；

图7为图3的彩色示意图。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1构建-1243bp至-1228bp不同截短序列与GFP基因的重组载体并在本生烟上瞬时表达

本实施例中涉及截短的启动子来源于GRMZM2G315413启动子序列，具体可根据ZL201410104914.2公开的技术获得的，该技术中已经获得了-1243至-1228这一截短了的序列，在本实施例中则是对-1243至-1228这一区域的进一步研究和分析。

为鉴定-1243至-1228这一区域响应纹枯病菌的作用元件，对这一区段进行了再次截短。以35S基础启动子为模板，分别用正向引物，其序列如SEQ ID NO.3，4，5，6所示

(5-GTTGAGGCACTTATTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3，

5-GGCACTTATTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3，

5-TATTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3,

5-CGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3)和反向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示

(5-GGGACTGACCTACCCGGG-3)扩增启动子片段；

PCR反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃30s，反应35个循环，后延伸72℃7min，获得序列SEQ ID NO.8，9，10，11的片段，其中SEQ ID NO.8是-1243至-1228加35S基础启动子的序列，SEQ ID NO.9是-1238至-1228加35S基础启动子序列，SEQ ID NO.10是-1232至-1228加35S基础启动子的序列，SEQ ID NO.11是35S基础启动子的序列；

反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物与经XcmI酶切的植物表达载体pCXGFP-P(含绿色荧光蛋白基因)连接，用电激法将重组载体转化农杆菌GV3101。

将培养好的农杆菌GV3101和p19K用10mM MgCl₂重悬，调OD₆₀₀＝1.0，等体积混合后注射本生烟叶片，注射3-5d后用于瞬时表达检测。

实施例2检测-1243bp至-1228bp不同截短启动子在本生烟上瞬时表达后对纹枯病菌的响应

将注射农杆菌5d后的本生烟叶片剪下，平铺在接种盘中，将培养好的玉米纹枯病菌YWK196用打孔器取下圆形菌块，倒扣在烟草叶片上，保湿25℃处理24h后取接种点叶片进行分析。

经上述接种的烟草叶片GFP荧光强度结果如图1所示，接种YWK196 24h后，与-1243至-1228相比，缺失GTTGA后荧光强度减弱了一半，而缺失GGTGAGGCACT的荧光强度与缺失GTTGA的荧光强度相当，并且剩余序列TATTT保持了这个荧光强度，说明GTTGA和TATTT这两个序列均是参与纹枯病菌响应的。

实施例3构建GTTGA和TATTT串联重复序列与GFP基因的重组载体并在本生烟上瞬时表达

为验证单独的GTTGA和TATTT能否响应纹枯病菌的侵染，将这两个元件串联重复两次，以35S基础启动子为模板，分别用正向引物，其序列如SEQ ID NO.12，13，6所示

(5-GTTGAGTTGACGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3，

5-TATTTTATTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3，

5-CGCAAGACCCTTCCTCTATATAA-3)和反向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示

(5-GGGACTGACCTACCCGGG-3)扩增启动子片段；同时以玉米B73基因组为模板，分别用正向引物，其序列如SEQ ID NO.14所示(5-TTCTATGGCAAAATCAATGAAGG-3)和反向引物，其序列如SEQ ID NO.15所示(5-TGGCGGTGACGATGGTAA-3)扩增GRMZM2G315431全长启动子片段；

PCR反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃60s，反应35个循环，后延伸72℃7min，获得序列SEQ ID NO.16，17，11，18的片段，其中SEQ IDNO.16是GTTGA重复2次加35S基础启动子的序列，SEQ ID NO.17是TATTT重复2次加35S基础启动子的序列，SEQ ID NO.18是pGRMZM2G315431全长序列；

反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物与经XcmI酶切的植物表达载体pCXGFP-P连接，用电激法将重组载体转化农杆菌GV3101。

将培养好的农杆菌GV3101和p19K用10mM MgCl₂重悬，调OD₆₀₀＝1.0，等体积混合后注射本生烟叶片，注射3-5d后用于瞬时表达检测。

实施例4检测GTTGA和TATTT串联重复在本生烟上瞬时表达后对纹枯病菌的响应

将注射农杆菌5d后的本生烟叶片剪下，平铺在接种盘中，将培养好的玉米纹枯病菌YWK196用打孔器取下圆形菌块，倒扣在烟草叶片上，保湿25℃处理24h后取接种点叶片进行分析。

经上述接种的烟草叶片GFP荧光强度结果如图2所示，接种YWK196 24h后，GTTGA串联重复两次后(SEQ ID NO.16)其病原诱导活性基本与全长启动子相当，而TATTT串联重复两次后(SEQ ID NO.17)其病原诱导活性大约为全长启动子的一半，说明单独的GTTGA和TATTT就能够响应纹枯病菌的侵染。

实施例5利用稳定的水稻转基因验证烟草瞬时表达结果

为验证实施例4中烟草瞬时表达的结果，将实施例3中构建好的表达载体(SEQ IDNO.11,16-18)用电激法转入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformationof indica rice，2005，Plant Cell Rep.23：540-547)将各表达载体导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株分别被命名为GTTGA、TATTT、pGRMZM2G315431和35S mini。本发明共分别获得独立转化阳性植株6、5、9、7株。分别对GTTGA和TATTT T₁代3个转基因株系进行玉米纹枯病菌的接种鉴定。结果表明，接种纹枯病菌24h后，在GTTGA和TATTT转基因植株中均能够检测到较强的荧光信号(图3)，这一结果与烟草瞬时表达结果一致。

同时，为了验证这两个元件是否能够响应其他病原菌，上述转基因植株又进行了白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的接种鉴定。结果发现，在GTTGA和TATTT转基因植株接种这两种病原菌后均没有检测到明显的荧光信号(图4)，说明这两个元件是特异性响应纹枯病菌侵染的，而不能够响应白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的侵染。

实施例6两个作用元件的应用前景

利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示病原诱导作用元件与植物纹枯病抗病相关基因(如Os2H16、OsACS2、OsJERF1等)融合，构建转基因植物材料；

发明人发现在不影响植物本身生长发育的前提下，当纹枯病菌侵染时，这两个作用元件对纹枯病菌作出响应，从而激活下游抗病相关基因的表达，提高植物对纹枯病的抗性，对开展植物纹枯病抗性研究具有重要意义。