一种热致相分离纳米纤维管状支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种脱细胞基质增强的热致相分离纳米纤维小口径管状支架及其制备方法。所述制备方法为：取健康动物主动脉，进行脱细胞处理；将脱细胞处理所得的基质放在表面皿中，滴加超纯水至淹没全部基质，放入冰箱冷冻；将模具的不锈钢轴芯上纺入纳米纤维，纳米纤维和轴芯整体纺入真空干燥箱干燥；将管状基质套在纳米纤维的外层，作为力学增强层；将复合的连同轴芯的双层支架装配到模具中，进行溶液浇铸、处理，得到管状支架。本发明制备的管状支架具有很好的力学性能、爆破强度和生物相容性，在移植手术时对人体无超敏反应，同时与人体内的血液及周边组织具有亲和力，在心脏内、外科修复手术中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小口径管状支架及其制备方法技术领域，特别是涉及一种脱细胞基质增强的热致相分离纳米纤维小口径管状支架及其制备方法。

背景技术

小口径血管(SDVG，D＜6mm)在临床上用在诸如冠状动脉和外周血管病变等心血管疾病治疗方面需求量很大，全球人工血管的需求量为100万条/年，而目前的实际用量为30万条/年，仅在美国，年均开放性血管再生手术的数量就达到25万例/年。但人造血管，特别是小口径血管在移植到人体后不仅缺乏生长活性，而且还不易随宿主周围环境进行适应性调整匹配，很容易导致血栓。通过组织工程与再生医学技术制备内层能够快速内皮化、外层具有能够促使平滑肌细胞长如的微观结构同时又具有很好的力学顺应性的血管支架，才能够满足临床上对小口径血管支架生物相容性、通畅性优异的力学性能的要求。单纯的合成高分子材料制备的血管有很多缺点，如：容易形成血栓、内膜增生、钙化及引起慢性炎症，同时不具有生长的潜能。

脱细胞异种移植物是在血管再生重建中最常用的一种组织工程替代物，其有效成分是胶原蛋白和弹性蛋白，为人体所具有的天然材料成分。静电纺丝技术制备的纳米纤维管状支架虽然会有一定的力学性能，但由于具有太小的孔隙，平滑肌细胞无法长入，仅仅通过物理黏附很容易脱落，这就需要通过编织技术和热致相分离技术结合静电纺丝技术，分模块功能化赋予血管支架，使其具有多层结构，各司其职，达到临床移植要求。

静电纺丝技术被广泛应用于制备组织工程支架，而编织技术被应用与制备管状支架的报道也已有文献报道。由于热致相分离技术在制备纳米纤维时，可选择的材料有限制，虽不如前两者那么广泛应用，但与其他材料共混制备支架领域也有好很好的应用。但迄今为止，采用静电纺丝技术、编织技术和热致相分离技术结合的方法制备小口径管状支架的报道却尚未出现。因此通过此三种技术制备出一种成熟的集力学性能和生物相容性于一体的多级功能化结构管状支架，将具有巨大的经济效益。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种脱细胞基质增强的热致相分离纳米纤维小口径管状支架及其制备方法。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种热致相分离纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：取健康动物主动脉，进行脱细胞处理，并浸泡在0.85％～0.9％的生理盐水中备用；

步骤2)：将步骤1)中脱细胞处理所得的基质放在表面皿中，滴加超纯水至淹没全部基质，放入-80℃～-60℃冰箱冷冻48～72小时，取出后冷冻干燥48～60小时；

步骤3)：将模具的不锈钢轴芯上纺入0.06～0.1mm厚的纳米纤维，纳米纤维和轴芯整体纺入真空干燥箱干燥；

步骤4)：将步骤2)中所得的管状基质套在步骤3)制得的纳米纤维的外层，作为力学增强层；

步骤5)：将步骤4)中复合的连同轴芯的双层支架装配到模具中，进行溶液浇铸、处理，得到管状支架。

优选地，所述步骤1)中脱细胞处理具体为：内径为1～6mm、长30～40mm的主动脉从健康动物的腹部取出后用含有0.5％～1％青霉素/链霉素双抗的PBS缓冲溶液喷洗10～20次，至表面无血渍等污染物。

优选地，所述主动脉取自8个月大的健康动物。

优选地，所述脱细胞流程具体为：清洗干净的腹主动脉浸泡在装有50mL PBS混合溶液的锥形瓶中，保鲜膜封口，放入CO₂摇床中恒温震荡7天，每隔一天换一次脱细胞溶液。

更优选地，所述PBS混合溶液由以下按重量份数计的原料制备的：

优选地，所述步骤3)中纳米纤维纺丝溶液由以下重量份数计的原料组成：

六氟异丙醇100份；

乳酸-己内酯共聚物(PLCL) 7～9.8份；

聚癸二酸甘油酯(PGS) 0.2～3份。

优选地，所述步骤5)中用于浇铸的溶液由以下重量份数计的原料组成：

优选地，具体步骤如下：

在分析天平上称取一定质量的PLLA、PGS和PLCL材料混合，在50～60℃条件下溶于四氢呋喃(THF)中，搅拌溶解至获得质量体积比为8～10(g/mL)的澄清均一溶液；随后将混合溶液迅速浇铸到之前装配好的带有纳米纤维层和脱细胞基质层的特定型号的聚四氟乙烯模具内，迅速放置在-80℃条件下使其相分离，放置时间24小时以上；之后取出模具，退去模具的外壳后浸泡在0℃超纯冰水混合物中，5分钟后将管状支架从模具的轴心上褪下继续浸泡在0℃超纯冰水混合物中，每隔6小时换一次水交换溶剂48～96小时，从去离子水中取出管状支架后冷冻干燥48小时以上，即得到三层管状支架。

本发明还提供了一种采用上述热致相分离纳米纤维管状支架的制备方法制备的热致相分离纳米纤维管状支架。

通过静电纺丝技术制备具有仿生细胞外生长基质的纳米纤维作为与血液接触的内层，中层是由脱细胞基质组成的支撑层，外层由PLLA、PGS、PLCL三种可降解材料通过热致相分离技术制备的大孔纳米纤维组成。

与现有技术相比，本发明的有益效果是所用纺丝材料PGS对内皮细胞的黏附、增殖和迁移有很好的促进作用，更有利于内皮细胞快速长满人工支架，从而实现快速内皮化，同时和PGS共混的PLCL能够在PGS降解后起到支撑内皮层的作用；中层的脱细胞基质为天然的人体固有的胶原蛋白和弹性蛋白，作为管状支架的总体力学支撑层；外层为热致相分离制备的大孔纳米纤维层，引导、促进平滑肌快速生长，从而达到仿生。这种具有很好的组织相容性和生物力学性能的复合型组织工程血管的制备为发展小口径血管支架提供了一种简单且有效的制备技术思路。

附图说明

图1为本发明制备的热致相分离纳米纤维管状支架的剖视图；

图2为可完全拆卸管状支架制备模具的示意图；

图3为不同纳米纤维制备的小口径管状支架的扫描电镜图；

其中，1为热致相分离纳米纤维，2为静电纺丝纳米纤维。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1和实施例2采用的制备模具如图2所示，包括用于接收的模具轴芯1以及套于其外侧的模具外鞘管4，模具轴芯1的两端分别设有模具防漏塞一2和模具防漏塞二3。

实施例1

取8个月大的口径为3mm左右的健康猪胸主动脉，进行脱细胞处理，并浸泡在0.9％的生理盐水中备用；将处理后所得的脱细胞基质放在表面皿中，滴加超纯水至淹没全部基质，放入-80℃冰箱冷冻60小时，取出后冷冻干燥60小时，-20℃冷藏备用。在分析天平上分别称取0.4gPLLA、0.2gPGS和0.4gPLCL材料混合在一起，加入10mL四氢呋喃溶剂，封口膜密封螺口反应瓶，置于60℃水浴锅中，磁力搅拌至获质量/体积分数为10％澄清均一溶液。随后将混合溶液迅速浇铸到之前装配好的带有纳米纤维层和脱细胞基质层的特定型号的聚四氟乙烯模具内，迅速放置在-80℃条件下使其相分离，放置时间24小时。之后取出模具，退去模具的外壳后浸泡在0℃超纯冰水混合物中，5分钟后将管状支架从模具的轴心上褪下继续浸泡在0℃超纯冰水混合物中，每隔6小时换一次水交换溶剂48小时，从去离子水中取出管状支架后冷冻干燥24小时。通过细胞种植技术，在支架内部种植内皮细胞，支架外部种植平滑肌细胞，经过一段时间的培养即得到内径为3mm、管壁后为1mm的三层管状支架。

实施例2

取8个月大的口径为2.2mm左右的健康SD腹主动脉，进行脱细胞处理，并浸泡在0.9％的生理盐水中备用；将处理后所得的脱细胞基质放在表面皿中，滴加超纯水至淹没全部基质，放入-80℃冰箱冷冻48小时，取出后冷冻干燥48小时，-20℃冷藏备用；将模具的内径为2mm不锈钢轴芯上纺上0.1mm厚的纳米纤维，纳米纤维和轴芯整体放入真空干燥箱干燥；将冷藏的脱细胞管状基质取出套在纺有纳米纤维轴芯上，作为力学增强层；在分析天平上分别称取0.3gPLLA、0.1gPGS和0.6g PLCL材料混合在一起，加入10mL四氢呋喃溶剂，封口膜密封螺口反应瓶，置于60℃水浴锅中，磁力搅拌至获质量/体积分数为10％澄清均一溶液。随后将混合溶液迅速浇铸到之前装配好的带有纳米纤维层和脱细胞基质层的特定型号的聚四氟乙烯模具内，迅速放置在-80℃条件下使其相分离，放置时间48小时。之后取出模具，退去模具的外壳后浸泡在0℃超纯冰水混合物中，5分钟后将管状支架从模具的轴心上褪下继续浸泡在0℃超纯冰水混合物中，每隔6小时换一次水交换溶剂48小时，从去离子水中取出管状支架后冷冻干燥48小时。通过细胞种植技术，在支架内部种植内皮细胞，支架外部种植平滑肌细胞，经过一段时间的培养即得到内径为2mm、管壁后为1mm的三层管状支架。

采用本发明制得的热致相分离纳米纤维管状支架如图1所示，内层为静电纺纳米纤维，中间层为脱细胞基质，外层热致相分离纳米纤维。