热致相分离法制备组织工程血管支架及生物学评价

摘要

热致相分离技术是一种制备纳米纤维组织工程支架的有效手段，采用该技术制备的管状支架可用于小口径血管缺损的修复。但采用左旋聚乳酸(PLLA)单一材料制备的纳米纤维血管支架由于缺乏柔性和弹性，力学强度与天然血管有很大差距，无法满足临床需要。为克服这一难题，本论文采用PLLA与弹性体聚（ε-己内酯）(PCL)或左旋聚乳酸-聚ε-己内酯共聚物(PLCL，50∶50)的混合体系来制备相分离管状支架。并通过交联剂将肝素与纳米纤维血管支架表面共价结合，提高支架的抗凝血能力。通过培养猪髂动脉内皮细胞(PIECs)和人血管平滑肌细胞(HVSCs)对材料的生物相容性进行评价。主要研究分为三个部分:
　　 1.采用PLLA/PCL及PLLA/PLCL复合体系制备纳米纤维管状支架。结果显示:当PLLA/PCL混合体系进行相分离时，支架具有大孔结构，并且孔径及孔隙率随着PCL的比例的提高而增大。由于PLLA和PCL不相容，混合聚合物溶液在-80℃发生相分离。PLLA处于不稳定状态而发生旋节分解相分离，形成均一的纳米纤维结构;体系中PCL处于亚稳状态而发生成核-生长相分离，PCL形成微球并分布于PLLA的纳米纤维结构中。部分PCL微球在相分离过程中从支架中逃逸出来，使制备的纳米纤维支架具有“海岛”状结构。而在PLLA/PLCL混合体系中，由于两者具有较好的相容性，发生相分离时，能够形成均一的纳米纤维结构，因此制备的血管支架的拉伸力学性能得到很大提高。
　　 2.将PLLA/PLCL混合比例为40∶60的纳米纤维管状支架进行肝素化，肝素与纳米纤维支架能够通过交联剂共价结合。由于支架表面接有肝素，提高了材料的亲水性，降低了蛋白吸附能力。通过甲苯胺蓝染色法定量分析，得出支架上肝素的含量为3.0±0.13μg/cm2，体外凝血实验表明，表面肝素化支架提高了抗凝血能力。
　　 3.分别采用PIECs和HVSCs细胞与支架共培养，评价血管支架的生物相容性。结果表明PIECs细胞能在PLLA/PLCL支架表面增殖和生长，细胞与支架结合紧密，并且细胞形态良好。相分离纳米纤维材料能够为细胞提供更多的附着和生长位点，并能维持细胞表型。HVSCs细胞共培养结果也表明细胞能够在支架表面上粘附生长。因此，相分离制备的PLLA/PLCL小口径纳米纤维血管支架有望用于损伤血管的修复。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 血管组织工程

1．2 天然材料组织工程血管支架

1．3 功能聚合物为基础的血管组织工程支架

1．4 血管细胞及生长因子

1．5 制备血管支架的方法

1．5．1 无支架的全细胞生物血管

1．5．2 静电纺丝法

1．5．3 脱细胞血管基质

1．5．4 快速成型法

1．5．5 生物反应器的设计和组织培养的调控

1．5．6 热致相分离／冷冻干燥

1．6 本论文的研究内容、创新点及意义

1．6．1 研究内容

1．6．2 创新点及意义

2 复合纳米纤维管状支架的制备与表征

2．1 前言

2．2 实验内容

2．2．1 材料与仪器

2．2．2 PLLA／PLCL、PLLA／PCL复合纳米纤维支架的制备

2．2．3 形貌表征

2．2．4 孔径及孔隙分析

2．2．5 力学性能测试

2．2．6 化学结构分析

2．2．7 X射线衍射(XRD)

2．2．8 热学性质分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 混合不同材料对血管支架的影响

2．3．2 支架密度和孔隙率分析

2．3．3 力学测试结果分析

2．3．4 红外图谱分析

2．3．5 X-射线衍射分析

2．3．6 热学性能分析

2．4 本章小结

3 PLLA／PLCL复合纳米纤维血管支架的肝素化

3．1 引言

3．1．1 血液凝固的原理

3．1．2 血液与材料接触导致的凝血

3．2 实验内容

3．2．1 材料与仪器

3．2．2 PLLA／PLCL40：60纳米纤维支架的肝素化

3．2．3 甲苯胺蓝染色测试

3．2．4 红外图谱鉴别

3．2．5 接触角测试

3．2．6 血管支架表面的肝素含量分析

3．2．7 血管支架表面的蛋白吸附测试

3．2．8 体外抗凝血测试

3．3 结果与讨论

3．3．1 甲苯胺蓝染色分析

3．3．2 红外图谱鉴别分析

3．3．3 亲疏水性测试

3．3．4 PLLA／PLCL40：60纳米纤维膜上肝素量的测定

3．3．5 PLLA／PLCL40：60纳米纤维膜体外蛋白吸附测试

3．3．6 体外抗凝血测试

3．4 本章小结

4 PLLA／PLCL复合纳米纤维血管支架的生物学评价

4．1 前言

4．2 实验内容

4．2．1 材料与仪器

4．2．2 材料准备及处理

4．2．3 复苏细胞

4．2．4 细胞观察

4．2．5 消化细胞

4．2．6 细胞种植

4．2．7 黏附细胞形貌观察

4．2．8 细胞黏附与增殖测试

4．2．9 PIECs细胞染色及共聚焦观察

4．2．10 HVSMCs细胞染色及共聚焦观察

4．2．11 PIECs细胞特异表达蛋白染色及共聚焦观察

4．3 结果与讨论

4．3．1 细胞在培养板上的形貌观察

4．3．2 细胞SEM形貌观察

4．3．3 细胞增殖

4．3．4 PIECs细胞染色及共聚焦观察

4．3．5 HVSMCs细胞染色及共聚焦观察

4．3．5 PIECs特异蛋白的表达染色

4．4 本章小结

5 结论与展望

5．1 本论文主要结论

5．2 存在问题与展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间科研及发表论文情况

致谢