用于纯化多糖的新的下游方法

摘要

本发明涉及用于纯化细菌多糖的新方法。其是用于从脑膜炎奈瑟茵(Neisseria meningitidis)血清组C(Men‑C)多糖中去除杂质的高效且可扩展的方法，所述多糖能够以衍生化形式原样使用或与其他分子相连接以用于制备疫苗(更特别地，针对脑膜炎奈瑟茵感染的缀合物疫苗)。

说明书

技术领域

本发明涉及用于纯化脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)多糖的快速方法。更具体地，本发明涉及制备脑膜炎奈瑟菌血清组C型(N.meningitidis serogroup typeC，MenC)多糖的方法，所述多糖能够原样使用或能够被衍生化或与其他血清组相组合以制备针对脑膜炎奈瑟菌的疫苗。

背景技术

多糖(尤其是抗原性多糖)被用于制备疫苗。含有一种、两种或更多种多糖及其缀合物的单价、二价和多价疫苗市售可得，用于预防由多种微生物(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脑膜炎奈瑟菌)引起的某些疾病或感染，并且已证明在预防各疾病中有显著程度的价值。引进疫苗沛儿(Prevenar)后数年间收集的监测数据已清楚地证明，美国婴儿中的侵袭性肺炎球菌疾病如所预期地降低。尽管进行了若干关于这些多糖及缀合物的研究，但持续性研究证明，在行业中总是存在改善该多糖产率以及质量(纯度)的需求。

脑膜炎被认为是全球性的威胁，并且该疾病负担仍然保持在公共健康的首要位置。脑膜炎的临床定义为脑膜(脑的膜)的炎症。如未治疗，该疾病可导致致命性结果。已经确定了脑膜炎奈瑟菌的总共十三个血清组，并且在这十三个血清组中的六个血清组(A、B、C、W135、X和Y)为引发全球性的感染主要原因。脑膜炎奈瑟菌具有广泛范围的临床表现，范围从短暂的轻度喉痛到致命性的脑膜炎或脑膜炎球菌败血症。脑膜炎和败血症为该疾病最常见的表现。

从许多研究发现中收集的证据限定了多糖缀合物疫苗的免疫原性方面。此外，有研究论文和专利描述了Men C荚膜多糖的生产和纯化，但其中没有一篇限定了稳健、可扩展且可重复的时间流程(time line)极度缩短的纯化方法。

纯化Men C的生产是与载体蛋白质的有效缀合及其作为缀合物疫苗开发的首要需求。Men C的培养和纯化的成本通常很高，并且因为其涉及一系列生产和纯化步骤而涉及较长的工作时间。多糖生产中一个或更多个步骤的改善将为整体的缀合物疫苗生产带来显著变化，并因此使该方法变得相对成本有效。

然而，尽管关于这些多糖有几项研究已在进行，总是存在为了生产高质量疫苗而改善该多糖产率和质量/纯度的需求。

有一些专利描述了用于纯化Men-C多糖的方法。描述于美国专利no7,491,517,B2中的用于以CTAB沉淀Men-C多糖的现有技术已被发现涉及在4℃孵育过夜。此外，去除污染物需要使用高成本的酶蛋白酶K。除此以外，该方法还需要用于纯化Men-C多糖的凝胶过滤。所述整个过程需要大量时间用于纯化，并且该方法也因酶的使用变得成本很高。

另外，专利申请No.WO 2011/148382 A1描述了制备纯荚膜多糖的方法，此方法使用带有醇的磷酸铝用于纯化流感嗜血杆菌b、脑膜炎奈瑟菌(例如血清组A、C、Y、W-135)的荚膜多糖和其他产自革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物的类似荚膜多糖。所述已发表的现有技术公开的用于多糖纯化的时间为16-20小时。

另一个专利EP 0658118B1描述了平均时间为16小时的血清组C脑膜炎球菌多糖(Group C Meningococcal Polysaccharide，GCMP)的O-脱乙酰化方法。该方法也要求大量时间用于纯化。

目前，用于生产和纯化MenC多糖的多种方法都占用相对长的培养和纯化时间，并且也涉及使用高成本的酶。尽管这些种类的方法产出纯多糖，但它们在按比例扩大(scale-up)期间会同时提高生产成本。

此外，上述公开的现有技术教导的方法在低温中更加高效，从而需要受控的环境，导致研究和生产中的额外成本。

发明目的

因此，本发明的主要目的是提供用于纯化Men C多糖的新方法。

本发明的另一目的是提供用于纯化Men C多糖同时在非常短的时间内通过简单、高效、改进且商业上可扩展的方法清除杂质的快速方法。

然而本发明的另一个目的是生产达到相关WHO规格的高质量多糖。

发明概述

本发明涉及用于纯化Men C多糖的方法。所述方法描述了新的、迅速、成本有效且可扩展的方法，其中Men C多糖以显著缩短的时间纯化。

本发明所述方法涉及选择免疫活性的细菌菌株，制备用于繁殖所述免疫活性菌株的培养基，以及接种在甘油贮液培养物中的所选择的细菌菌株，以及在预设的温度下以预设的每分钟转速(revolution per minute，rpm)孵育最佳时间。所选择的细菌菌株在发酵罐中在优化的培养基上培养，并且所述方法继续将发酵收获物离心以清除发酵液(fermentationbroth，FB)中的细胞碎片，随后通过利用分子量截留膜超滤将FB浓缩。

随后，在高温下在高浓度碱性溶液存在下，将经超滤浓缩的上清液或经处理的FB脱乙酰化。使经脱乙酰的粗制多糖经受通过正切流动过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)的缓冲液交换。通过疏水相互作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography，HIC)将经渗滤脱乙酰化的粗制多糖进一步纯化，随后通过渗滤和浓缩以获得最终纯化的多糖。特别相关的是，根据本发明的方法包括用碱性溶液处理浓缩的提取物和/或分离的细菌细胞。除了提取CPS，该碱提取还引起N-乙酰基的脱乙酰化。可通过调整反应条件使该脱乙酰化的程度变化。随后从细胞组分中分离所提取的CPS以获得CPS(优选通过色谱分离)。

该方法展现出优于现有技术的一些优势，例如提供了制备Men C多糖的新的且快速的方法。该方法因其降低了步骤总数目且需要单次色谱筛选，所以是成本有效的。另一个优势是该方法为整体可扩展的。

附图简述

图-1描述了用于MenC-PS纯化和回收的工艺流程(process flow)。

图-2描述了MenC-PS的HPLC色谱图。

图-3描述了MenC-PS的NMR谱。

发明详述

如图1所示，本发明公开了两个步骤，其已经被优化以使得能够在更短时间内纯化MenC多糖(MenC polysaccharide，MenC-PS)。

将细菌多糖的菌株接种于含有细菌生长所需的合适培养基的发酵罐中。在达到最大光密度后(范围为8至10，其说明大量的细菌生长)，通过添加预先确定浓度的甲醛将其终止，并获得所产生的FB。随后将FB高速离心以清除FB中的细胞碎片，随后利用分子量截留膜渗滤并浓缩。

将经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用NaOH在高温(例如高达80℃)下处理以脱乙酰化。将粗制多糖用聚醚砜(polyether sulfone，PES)膜，用milliQ水(milliQ water，MQW)，随后通过Tris HCl缓冲液(pH7.4±0.1)进行浓缩和渗滤。在渗滤后将粗制多糖浓缩并以0.22μm滤器过滤。

将脱乙酰化的粗制多糖通过疏水相互作用色谱法(HIC)技术进一步纯化。

基于极性差异将混合物中两种或更多种组分分离是本领域技术人员公知的。例如，使用疏水相互作用色谱，具有相对较大疏水性的化合物相对于更加亲水的化合物在柱上保留时间更长。相反，使用亲水相互作用色谱，亲水化合物相对于更疏水的化合物保留在柱上的时间更长。连续使用这两种方法允许将相对于目标化合物极性更弱和极性更强的两类杂质除去。

可将存在于碱性提取试剂中的所提取的CPS通过色谱法从来自于细胞组分的杂质中分离。色谱分离方法的非限制性实例是离子交换(阳离子或阴离子)、亲水相互作用、疏水相互作用或凝胶渗透色谱法。更优选为在苯基琼脂糖凝胶(phenyl sepharose)上的疏水相互作用色谱法(HIC)，其会从碱性提取物中除去大多数高分子量、紫外活性的(uv-active)污染物。荚膜多糖从一开始会被洗脱，而更疏水的蛋白质和核酸会被保留。本发明中的优选方法是疏水相互作用色谱法。

对多糖进行进一步的浓缩和渗滤以促进蛋白质和其他杂质的去除，并且随后将多糖样品用MQW洗涤。

随后进行无菌过滤以获得图2和图3所描述的纯化Men C多糖。

可从表1中方便地理解以上所使用操作的确证，表1清楚地示出了所纯化多糖的规格满足WHO标准。

表-1：以下示出所纯化的Men-C多糖规格符合WHO规范

鉴于本发明的特征(hallmark)为新的、迅速且可扩展的纯化工艺方案，其可于6±1小时内完成并且如此生产的PS符合WHO所设标准，因而特别感兴趣的观察结果是纯化Men C多糖所需时间显著少于现有技术中所公开的时间。

分析操作：

持续监测在不同步骤中所获得的多糖并分析其纯度和产率。已经报道了不同的分析操作，但优选方案总结如下：

通过比色法确定MenC-PS的总唾液酸。该测定基于在100℃下，在盐酸和铜(II)离子存在下，唾液酸与间苯二酚反应30分钟；这导致形成蓝紫色络合物，其表现出在564nm的强吸光度。该总唾液酸浓度通过使用一系列唾液酸标准所获得的校准曲线确定[(Svennerholm，1957)]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)使用紧凑且简单的-PTS^TM设备确定。蛋白质杂质通过Lowry方法[(Lowry等，1951)]，利用牛血清白蛋白作为标准并记录750nm吸光度来确定。核酸(nucleic>

HibPRP的相对平均分子大小(Mw)通过利用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)来确定(Alliance，Waters)。所使用的柱为PWXL-4000和PWXL-5000联用(TosohBioscience)。此外，一系列5kD至800kD的短梗霉聚糖(pullulan，Shodex)用作MenC-PS的标准。利用0.1M硝酸钠以30分钟的运行时间、1ml/分钟的流量进行该HPLC。通过¹H-NMR谱验证MenC-PS的身份。NMR产生磁敏感的原子核(例如¹H)谱。

通过与针对每种多糖的参考抗血清组合，从血清学上确定MenC-PS。根据WHO规格[WHO，2004]，基于干重确定纯度并表征多糖，先将MenC-PS冻干并随后检测。水分含量被如此减除，从而获得精确的干重。冻干块状物的水分含量通过来自于Perkin Elmer的热重分析仪(ThermoGravimetric Analyzer，TGA)确定。MenC-PS的分析结果在表-1中给出，并且其符合WHO的规定。

所述Men C多糖可用于制备多糖-蛋白质缀合物疫苗。

如上所详述的本发明多个方面现通过一些非限制性实施例来举例说明。

实施例-1

利用阴离子去垢剂以tris缓冲液和疏水相互作用色谱法(HIC)进行多糖纯化：

经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用阴离子去垢剂(例如浓度为0.3％至0.6％(w/v)的脱氧胆酸钠)处理并在50℃至60℃下孵育1小时。随后将其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖用0.1m²的聚醚砜(PES)膜，用6至8倍体积的milliQ水(MQW)浓缩并渗滤。

随后将粗制多糖用0.5M氢氧化钠(NaOH)在50℃下进行脱乙酰化10小时。随后将其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖同时用6至8倍体积的MQW和20mM Tris HCl缓冲液，利用0.1m²的PES膜渗滤并浓缩。随后该多糖通过疏水相互作用色谱法(HIC)(例如苯基琼脂糖凝胶6快流速(Fast>2的PES膜、用6至8倍体积的MQW进行浓缩和渗滤。相应地，以0.22μm滤器进行无菌过滤，并将最终纯化的多糖储存于-20℃。利用上述方法纯化多糖(包括HIC色谱法)所用的总时间为16至18小时。

实施例-2：

利用阴离子去垢剂以HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液

和疏水相互作用色谱法(HIC)进行多糖纯化：

经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用阴离子去垢剂处理(例如浓度为0.3％至0.6％(w/v)的脱氧胆酸钠)并在50℃至60℃下孵育1小时。随后将其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖用0.1m²的聚醚砜(PES)膜，用6至8倍体积的MQW浓缩并渗滤。

随后将粗制多糖用0.5M氢氧化钠(NaOH)在50℃下进行脱乙酰化10小时。随后将其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖同时用6至8倍体积的MQW和含有3M NaCl的20mM HEPES缓冲液，利用0.1m²的PES膜渗滤并浓缩。随后该多糖通过疏水相互作用色谱法(HIC)(例如苯基琼脂糖凝胶6快流速)进一步纯化。将纯化的多糖用0.1m²的PES膜，用6至8倍体积的MQW进行浓缩和渗滤。随后，用0.22μm滤器进行无菌过滤，并将最终纯化的多糖储存于-20℃。利用上述方法纯化多糖(包括HIC色谱法)所用的总时间为16至18小时。

实施例-3：

利用氢氧化钠以HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液和疏水相互作用色谱法(HIC)进行多糖纯化：

经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80℃下进行脱乙酰化6小时。随后将其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖同时用6至8倍体积的MQW和含有3M NaCl的20mM HEPES，利用0.1m²的PES膜渗滤并浓缩。随后该多糖通过疏水相互作用色谱法(HIC)(例如苯基琼脂糖凝胶6快流速)进一步纯化。将纯化的多糖用0.1m²的PES膜，用6至8倍体积的MQW进行浓缩和渗滤。随后，以0.22μm滤器进行无菌过滤，并将最终纯化的多糖储存于-20℃。利用上述方法纯化多糖(包括HIC色谱法)所用的总时间为10至12小时。此外，用上文中所述方法部分地纯化多糖。该方法可需要几个更多的步骤以完成多糖纯化，并且可能不是成本有效的方法。

实施例-4：

利用氢氧化钠以Tris缓冲液和疏水相互作用色谱法(HIC)进行多糖纯化：

经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80℃下进行脱乙酰化6小时。随后使其冷却至低于40℃，随后将粗制多糖同时用6至8倍体积的MQW和20mM Tris HCI缓冲液，利用0.1m²的PES膜渗滤并浓缩。随后该多糖通过疏水相互作用色谱法(HIC)(例如苯基琼脂糖凝胶6快流速)进一步纯化。将纯化的多糖用0.1m²的PES膜，用6至8倍体积的MQW进行浓缩和渗滤。相应地，用0.22μm滤器进行无菌过滤，并将最终纯化的多糖储存于-20℃。利用上述方法纯化多糖(包括HIC色谱法)所用的总时间为10至12小时。此外，用上文中所述方法部分地纯化多糖。该方法可需要几个更多的步骤以完成多糖纯化，并且可能不是成本有效的方法。

实施例-5：

利用氢氧化钠以Tris缓冲液和疏水相互作用色谱法(HIC)进行多糖纯化：

经渗滤和浓缩的具有粗制多糖的FB用1M NaOH在75±5℃下进行脱乙酰化2小时。随后将脱乙酰化的多糖冷却至低于40℃的温度。冷却之后，将粗制经脱乙酰化多糖用100KDa的PES膜(0.1m²)，用20至25倍体积的MQW、随后8至10倍体积的Tris>2)进行无菌过滤。

将经渗滤脱乙酰化的多糖以疏水相互作用色谱法(HIC)，通过用苯基琼脂糖6快流速(Fast Flow，FF)填装的XK-16柱，利用色谱系统进一步纯化。将该柱用含有20％硫酸铵的20mM Tris HCl缓冲液(pH7.4±0.1)平衡。该材料以60cm/小时的速度加载，并收集流经的含有纯化多糖的流。最后，用20mM Tris HCl缓冲液(pH 7.4±0)将柱再生，并在20％的乙醇中保存以备用。将纯化的多糖用100KDa的PES膜(0.1m²)，用6至8倍体积的MQW进行浓缩和渗滤，并以0.22μm滤器进行无菌过滤，并将最终纯化的多糖储存于-20℃。纯化多糖所用的总时间为6±1小时，并且该PS质量达到WHO规格要求。