香菇多糖新的分离纯化方法

摘要

本发明系多糖提取分离纯化方法由香菇热水提取浓缩、乙醇沉淀、沉淀物溶介后透析，乙醇沉淀所得粗品DEAE—纤维素吸附，不同浓度碱液洗脱，糖反应阳性的洗脱液合并酸中和，超过滤，未透过部分浓缩，冻干即单一香菇多糖，本方法易工业化且成本低产品质量好。

说明书

本发明涉及天然产物化学，更具体涉及多糖分离纯化方法。

香菇多糖，商品名力提能，英文名Lentinan，为一种免疫调节型抗肿瘤辅助药物。

香菇多糖系从人工培养的伞菇科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的多糖。各国科学家早在七十年代初就对各类多糖进行广泛的研究，发现多糖不但能治疗机体免疫系统受到严重损伤的癌症，又能治疗多种免疫缺损疾病，如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病，还能治疗诸如风湿病之类的自身免疫疾病。近年来发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，它能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，除此之外，多糖在医药上又是一种很好的佐剂。

由于多糖是极性大分子化合物，酸性条件下能引起多糖甙链的断裂。它的提取分离十分复杂，大多采用沸水，碱溶液提取。提取液中的游离蛋白质主要用Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法等三种方法去除，前二种方法多应用于微生物多糖中，后者多应用于植物多糖中，结合蛋白质的除去可用蛋白酶，小分子杂质除去可用透析法，国外采用连续透析仪透析，还可用超过滤法得到一定分子量范围的多糖。多糖的纯化方法很多，有分部沉淀法、盐析法、金属络合法、季胺盐沉淀法。DEAE-纤维素法和其他各种不同类型的凝胶柱层析法。用硫酸-苯酚法等比色方法来测定多糖。

香菇多糖系从香菇子实体中获得的单一组分(I)

它的提取分离十分复杂且得率很低，成本高。日本专利昭48-6767(1973)；昭49-484(1974)。近来曾有报导采用凝胶柱层析法，但该法只能获得少量供研究用样品，无法应用于生产，而且由于凝胶价格昂贵使成本很高，由于现有技术尚存在诸多缺点。本发明目的为了寻找一种新的较为简便易于生产，成本低的香菇多糖的分离纯化方法。

本发明通过下列步骤实施：

浓缩---→浓缩物冷冻干燥。

取原料香菇，用热水提取，提取液减压浓缩至小体积，搅拌下缓缓加入乙醇，使其产生沉淀，沉淀经水溶介，将其置于透析袋中透析，透析液浓缩，乙醇沉淀，沉淀再经乙醇洗涤后，真空干燥得粗制品。所得粗香菇多糖溶于水中，经DEAE-纤维素吸附后，用水洗涤，用稀碱溶液洗脱，所用的碱可为Na₂CO₃、K₂CO₃、NaHCO₃、KHCO₃、NaOH、KOH，碱洗脱液的浓度可为1～2mole/L，洗脱液分部收集，取糖反应阳性部份，用盐酸中和，置于超滤器上过滤，取未透过液浓缩，冷冻干燥，即得香菇多糖单一组份。

实施例1：

取合格的原料干香菇10公斤，粉碎后，置于带夹套的反应锅中，加入清水，水的加入量约为原料体积的1.5倍，夹套蒸汽加热至沸腾，然后在沸腾下保持6小时，过滤，残渣再用上述方法提取三次，合并全部滤液，减压浓缩至小体积，搅拌下缓缓加入等体积的95％以上浓度的乙醇，静置放置4小时，沉淀产生，倾去上清液，下层沉淀经离心得到沉淀，沉淀经乙醇冼涤后，溶于水中，置于透析袋中对自来水透析3天，透析液减压浓缩至小体积，搅拌下加入等体积之浓度为95％以上的乙醇，静止4小时后，离心得沉淀，沉淀经乙醇，乙醚相继洗涤后，在60℃的真空干燥器中干燥，得香菇多糖粗品约100克。

粗品100g溶于水中，并注入到1500g DEAE-纤维素中首先用水冼涤，然后用NaOH 1mole/L溶液洗脱，收集NaOH洗脱的糖反应阳性部分的洗脱液HCl中和。在超过滤器上超过滤，超过滤之膜孔经为10万，取未透过部分，浓缩至小体积，冷冻干燥，得单一组份香菇多糖2g，总收率为0.02％，香菇多糖含量97.3％。

实施例2：

取合格的原料干香菇12Kg，粉碎后，置于带夹套的反应锅中，加入清水，水的加入量约为原料体积之1.8倍，夹套蒸汽加热至沸腾，然后在沸腾下保持7小时，过滤，残渣再按上述过程提取2次，合并所有滤液，减压浓缩至小体积，搅拌下加入等体积之浓度为95％以上之乙醇，静止放置5小时，倾倒去上清液，下层沉淀经离心得到沉淀，沉淀经乙醇洗涤后，溶于水中，置于透析袋中对水透析3天，透析液减压浓缩至小体积，搅拌下加入等体积之乙醇，静止4小时，倾倒去上清液，下层沉淀经离心，得到沉淀，沉淀再经乙醇，乙醚相继洗涤，在60℃下真空干燥得香菇多糖粗品约126g，粗品126g溶于水中，加到DEAE-纤维素中(1500g)，废液弃去，含有香菇多糖的DEAE-纤维素先用水洗涤，然后用稀NaOH溶液洗脱收集碱洗脱液并作糖反应试验，收集糖反应阳性的部份，将糖反应阳性部作超过滤。过滤膜的阻滤值分子量为10万，取未被排除部分，浓缩到小体积冷冻干燥得单一组份的香菇多糖2.64g，总收率为0.022％，产品经刚果红反应，然后紫外测定，发现在480～495nm处呈最大吸收峰。中和后再测紫外，其最大吸收位移至505-520nm，该反应紫外吸收的二个范围为β(1→3)葡聚糖所特有。香菇多糖属β(1→3)葡聚糖，所以也应有二个最大吸收值。

红外光谱有3500～3300cm^-1(糖环上OH之O-H伸缩振动)；2920～2800cm^-1(糖环上C-H变角振动)；1100～1000cm^-1(糖环上C-O伸缩振动)；890cm^-1(β构型的异头碳特征吸收)，等四个特征吸收峰，¹³C核磁共振光谱具104.66ppm(β-1，3葡聚糖的C-1信号)；88.04ppm(C-3信号)；77.92ppm(C-5信号)；75.19ppm(C-2信号)；70.13ppm(C-4信号)和；62.17ppm(C-6信号)。

含量测定：

用高效液相层析获得的香菇多糖峰及杂质峰、由峰面积换算成浓度，即可求得香菇多糖的含量，或采用蒽酮比色法(对照为标准香菇多糖)测定含量。