一种样品中镰刀菌的快速分离检测方法及所用培养基

摘要

本发明涉及一种样品中镰刀菌的快速分离检测方法及所用培养基，将样品涂布于分离培养基上培养，分离培养基成分中不含任何氮源，按质量百分比含：0.4％‑1％碳源、1.5‑2％琼脂粉，0.15‑0.3％K

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌种分离技术，具体涉及一种样品中镰刀菌的快速分离检测方法及所用培养基。

背景技术

镰刀菌属类真菌可以导致严重的农作物病害，如小麦赤霉病、镰刀菌根腐病和玉米穗腐病等。该属真菌产生的镰刀菌毒素是一类次生代谢物能使人呕吐、腹泻、诱发大骨节病甚至癌症等严重健康问题。因此镰刀菌检测技术在海关检疫、田间病害防控检测中具有重要作用；而与镰刀菌紧密关联的镰刀菌毒素检测是粮食和食品安全中的一个重要检测项目。

针对镰刀菌毒素含量的检测技术只能反映样品中的毒素浓度，无法检测样品中是否存在镰刀菌活体菌；该方法无法预测粮食储藏过程中毒素是否会持续积累的风险。因此，在粮食储藏前进行镰刀菌含量检测将是防控粮食储藏过程中镰刀菌毒素积累的关键。

目前在田间病害或海关检疫中对镰刀菌的检测方法主要有4类:

①基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术

这类检测技术一般针对某一个或几个镰刀菌种的基因组中的某一片段设计一对或多个特异引物，通过一次或多次PCR扩增得到目的片段，并对扩增的片段进行带型分析或测序来判断菌体的种属。该检测技术灵敏度仍较低(检测下限是含镰刀菌500个细胞/g的样品)、带型分析假阳性高、无法区分活体和死体菌，检测范围不够广谱。

②基于抗体的检测技术

此类技术在获得某个特定镰刀菌株的特异抗体后，用该抗体连接一些有特殊显色反应的酶蛋白，通过显色反应来检测样品中是否含有该特定镰刀菌株。该检测技术研发和使用成本高，检测范围也很窄。

③基于荧光染色的镰刀菌孢子活体检测技术

此类荧光染色技术一般是对已经是纯化的菌株进行活体判断。活体菌和死亡菌可以染上不同的荧光颜色，以此来判断菌体是否是活体。该检测技术没有针对性，无法直接用于检测粮食中的镰刀菌污染。

④基于镰刀菌分离的检测方法

利用真菌常用培养基PDA或加有五氯硝基苯(PCNB)的PPA培养基，从各类样品中分离镰刀菌。经过多步骤连续分离后获得纯的菌株，再通过分子鉴定等手段进行菌株鉴定。

这种检测方法一般是针对具有明显镰刀菌病的材料。例如卢维宏等人从玉米穗腐病样品中用PDA培养基多次分离的方法获得纯菌株，再通过分子鉴定证明分离得到层出镰刀菌Fusarium proliferatum(卢维宏,黄思良,陶爱丽,等.玉米穗腐病样品中层出镰刀菌的分离与鉴定[J].植物保护学报,2011,38(03):233-239)。黎永坚等人从患有香蕉枯萎病(镰刀菌病害)的田中取根际土壤，用具有一定选择作用的PPA培养基经多轮分离后筛选得到纯菌落，再用分子鉴定方法证明分离得到的是镰刀菌(黎永坚,陈远凤,喻国辉,等.粉蕉种植土镰刀菌分离与鉴定[J].广东农业科学,2014,41(16):74-80)。

由于PDA是广泛性的培养基，各类真菌均能在其上面快速生长，因此分离纯化工作量很大，难以筛选得到目的镰刀菌。

PPA培养基加入了PCNB后具有一定的筛选作用，可以减少立枯菌和炭疽菌等一些真菌的污染，但是筛选分离的难度和工作量依然很大，需要不断循环分离筛选。例如汪建飞第一步用PPA培养基从有镰刀菌病的滁菊连作土壤中分离菌株，然后“在培养基上挑取生长5d的菌落，接种到马铃薯培养基上纯化培养3d，再挑取菌落接种到马铃薯培养基上，如此循环，直到得到纯化的菌种”(汪建飞,周毅,高祥,等.滁菊连作土壤中尖孢镰刀菌的分离、鉴定及变化特征[J].生物学杂志,2011,28(06):46-48)。

由于此类检测方法一般针对含镰刀菌数量较多的带有镰刀菌病症的样品，并且需要多次的分离才能获得镰刀菌株；因此不适合用于无镰刀菌病症、菌体含量较少的样品的快速检测。

综上，基于镰刀菌分离的检测方法，缺点在于：a、目前此类分离方法中使用的培养基如PDA或PPA等，导致其他真菌的污染率高，需要多次循环分离才能获得纯菌株；分离难度大。b、由于a这样的分离特点，该方法分离周期过长，一个分离循环时间5天左右，两个以上的分离循环需要10天以上的工作时间，不适用于快速检测。c、由于a这样的分离特点，分离工作量大，需要耗费较大的人力物力。

发明内容

本发明的目的是提供一种样品中镰刀菌的快速分离检测方法，可实现对各类样品中的镰刀菌的检测，避免其他真菌污染，使得检测灵敏度更高、周期更短。

本发明人在相关研究过程中发现：镰刀菌是一类具有固氮作用的真菌，具有不需要任何氮源、只要有合适的碳源和无机盐就能正常生长的生理特性；至今还没有任何关于镰刀菌可以固氮的报道。而现有技术中基于镰刀菌分离的检测方法使用的培养基如PDA或PPA等都含有丰富的氮源，因此会导致其他真菌的污染率高。

本发明的技术方案为：一种样品中镰刀菌的快速分离检测方法，包括：

将样品涂布于分离培养基上培养，所述分离培养基成分中不含任何氮源，按质量百分比含：0.4％-1％碳源、1.5-2％琼脂粉，0.15-0.3％K₂HPO₄，0.1-0.3％MgSO₄，0.1-0.3％CaCl₂，0.3-0.5％CaCO₃，pH>

培养好后从单菌落上挑取白色半透明气生菌丝，显微观察根据细胞形态特征判断是否为镰刀菌。

在一个具体的实施方式中，所述样品取自玉米种、玉米须或茭白。

在一个具体的实施方式中，所述能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素为链霉素和/或头孢霉素。

在一个具体的实施方式中，平皿中的分离培养基厚度不小于4毫米；平皿不需密封，保持透气。

在一个具体的实施方式中，所述培养是置于恒温培养箱中，28～30℃培养2～3天。

在一个具体的实施方式中，在载玻片上滴上含有15-30％甘油的水滴，将挑取的白色半透明气生菌丝分散于水滴中，用显微镜观察，凭经验或软件判定是否镰刀菌。

在一个具体的实施方式中，通过真菌分子鉴定方法进一步确定镰刀菌的种属。具体来说，挑取白色半透明气生菌丝接种于真菌液体培养基进一步培养后，进行ITS序列扩增测序。

本发明提供的一种用于样品中镰刀菌的快速分离检测的培养基，培养基成分中不含任何氮源，按质量百分比含：0.4％-1％碳源、1.5-2％琼脂粉，0.15-0.3％K₂HPO₄，0.1-0.3％MgSO₄，0.1-0.3％CaCl₂，0.3-0.5％CaCO₃，pH>

本发明方法可适用于检测无镰刀菌病症、菌体含量较少的样品中的镰刀菌，不一定是具有明显镰刀菌病的材料；检测灵敏度高。

经多次实验检验，采用本发明方法分离检测样品中含有镰刀菌的准确率可达到100％；检测下限达到10个活细胞/g甚至更低；2-3天可即可完成分离检测。

相比①于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术，本发明的优点在于：检测灵敏度显著提高；检测周期时间较为理想，除简单制片观察外培养期间无需其他的工作量，更为经济实用。

相比②基于抗体的检测技术，本发明可提高镰刀菌的检测灵敏度、减少检测成本。

相比④基于镰刀菌分离的检测方法，本发明除了④所具有的经济性之外，可显著减少其他真菌污染，筛选检测周期大大缩短，显著提高了工作效率。

综上，本发明方法可实现对各类样品中的镰刀菌进行经济、简便和快速分离检测的目的。该方法更广谱、检测灵敏度更高、周期更短、成本更低。可显著提高镰刀菌的检测效率。本发明可应用于海关检疫中的镰刀菌检疫、种子镰刀菌检测和粮食镰刀菌检测等。

附图说明

图1为实施例一中玉米种糯2000的分离情况对比；

图2为实施例一中玉米须的分离情况对比；

图3为实施例一中显微镜观察到的疑似镰刀菌；

图4 PCR检测对比试验中样品DNA及EF1-α基因PCR凝胶电泳。

具体实施方式

本发明一个具体实施方式中，样品中镰刀菌的快速分离检测方法包括下述的步骤：

1)样品处理

样品取样无限制，可取材于无镰刀菌病症、菌体含量较少的样品，例如取材于玉米种、玉米须、茭白等。

液体样品可直接用于涂皿；固体样品则取0.5-1g，加适量无菌水，在无菌条件下研磨后取液汁涂皿。

2)分离培养基的准备

分离培养基：按质量百分比计含0.4％-1％碳源、1.5-2％琼脂粉，0.15-0.3％K₂HPO₄，0.1-0.3％MgSO₄，0.1-0.3％CaCl₂，0.3-0.5％CaCO₃，pH>

配置的培养基装瓶密封后经高温高压灭菌处理。灭菌好的培养基可立即使用或放置待用。培养基倒皿前加入适当浓度的抑制细菌生长的一种或多种抗生素，优选培养基中每种抗生素浓度为100微克/毫升左右。平皿中倒入的培养基厚度不小于4mm。

3)涂皿培养

取样品液体50-200微升于涂布于上述分离培养基平皿中，不要封口以保持透气。随后将平皿倒扣置于恒温培养箱中，28～30℃培养2～3天。

4)挑取白色半透明气生菌丝显微观察

在培养好的平皿中杂菌非常稀少。在载玻片上滴上一滴含有15-30％甘油的水滴；用无菌、尖细的器具从平皿中单菌落上挑取白色半透明气生菌丝(在本发明培养基上有此特征的菌丝一般即为镰刀菌)，分散于载片水滴上即可用于显微观察检测。可以凭实验人员的镰刀菌形态区分经验来判断是否镰刀菌，或者利用“镰刀菌显微图像处理与识别系统”(王国斌.镰刀菌显微图像处理与识别系统开发[D].河北农业大学,2010；郭灵,赵艳,刘永福,等.镰刀菌图像识别系统的研究与开发[J].农机化研究,2011,33(07):122-124.)等软件进行镰刀菌的判断。至此，样品中的镰刀菌快速分离检测工作已完成。

显微镜观察的人工经验或软件判断方法都是可靠的判断方式；但也可最终通过真菌分子鉴定方法、比如ITS、18S和28S DNA序列测序等进一步确定。

5)若用上述分离到的镰刀菌用于其他研究工作

只需要挑取单菌落上的白色半透明气生菌丝接种于常用真菌液体培养基进一步培养即可。

该步骤可以采用常用的真菌液体培养基，或者用上述的液体分离培养基(即不加琼脂，其他组分及配比与步骤2相同)。

6)菌株鉴定

为了证明上述第4)步分离得到的是否是镰刀菌，挑取菌丝经第5)步培养提取DNA后，进行ITS序列扩增测序。所用真菌ITS序列引物为ITS1和ITS4(ITS 1：5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3’，ITS 4：5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3’)。

实施例一 镰刀菌分离检测优选实验

配置几种固体培养基，高压高温灭菌后备用。几种培养基成分含量分别为：

①PPA：D-半乳糖1％、蛋白胨0.5％、KH₂PO₄>4>

②PDA：200g去皮马铃薯煮水过滤汁约800ml，加20g葡萄糖、20琼脂粉，自然pH值，加纯水定容至1L；倒平皿时加入链霉素和头孢霉素终浓度各为100毫克/毫升。

③本发明的分离培养基：1％蔗糖、1.7％琼脂粉，0.2％K₂HPO₄，0.25％MgSO₄，0.25％CaCl₂，0.4％CaCO₃，pH值7.0；倒平皿时加入链霉素和头孢霉素终浓度各为100毫克/毫升。

研钵经110℃烘烤2小时，冷却到室温后，加入3ml无菌水使样品研磨后有足够的液体；分别称取约0.5g玉米种“糯2000”(买自市场)和0.5玉米须(来自长沙田间)，分别放入研钵中捣碎、搅拌均匀。各吸取200微升水液分别涂布于上述①-③三种培养基中，盖上平皿盖子后不封口，倒扣平皿放置于28℃培养箱中培养3天。

挑取气生菌丝，分散于含15％甘油水滴中，在显微镜下镜检。

结果1 玉米种“糯2000”的分离情况如图1：PDA培养基中很快被其他霉菌长满，几乎覆盖整个培养皿，少数几个单独的菌落经显微镜观察，无镰刀菌特征的菌落。PPA培养基中有16个丝状真菌菌落，经显微镜镜检有1个疑似镰刀菌菌落。在本发明的“分离”培养基中，只有3个长有稀疏白色半透明气生菌丝的菌落(由于背景是白色培养基，图上看不出菌落，但实样中可肉眼看到)；经显微镜检查3个均为疑似镰刀菌。

结果2 玉米须的分离情况如图2：PDA培养皿中被大量真菌长满覆盖，无法挑出单菌落；尝试挑取10个不同菌落的菌丝，经显微镜观察均无疑似镰刀菌。在PPA培养皿中有大量真菌单菌落，其中丝状真菌菌落有69个，经显微镜观察，有2个疑似镰刀菌菌落。在本发明的“分离”培养基中，有5个有稀疏白色半透明气生菌丝的菌落(由于背景是白色培养基，图上看不出稀疏白色半透明气生菌丝的菌落)，经显微镜观察均为疑似镰刀菌。

对玉米种“糯2000”和玉米须的分离统计情况如表1，从“成功率”上看，本发明在分离检测上成功率显著提高，在我们的多次实验中成功率达100％。从筛选过程看，常用的PDA真菌培养基各种真菌污染非常严重，难以分离出镰刀菌；而PPA虽然有部分筛选作用，但在对不同材料筛的筛选过程中仍存在较严重的杂菌污染，分离效率仍较低；从结果看，与现有技术相比，本发明可极大程度的抑制其他真菌类杂菌，快速分离检测到镰刀菌。

表1两种材料在不同培养基中分离镰刀菌的情况

表注：成功率＝镰刀菌菌落数/丝状真菌菌落数×100％。

从玉米种“糯2000”分离到的丝状真菌中的疑似镰刀菌如图3a。经分离培养基的液体培养基扩大培养后提取DNA，用真菌ITS1、ITS4引物(ITS 1：5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3’，ITS 4：5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3’)进行PCR扩增后测序。测序结果在NCBI上Blastn比对，与Fusarium verticillioides的相似性为99％，证明分离到的该菌就是镰刀菌。

测序获得的序列为

>ITS Fusarium verticillioides

CTCCCAACCCCTGTGACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGAGTCAAATCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

从玉米须中分离到的丝状真菌中的疑似镰刀菌如图3b。经真菌ITS1、ITS4引物进行扩增后在NCBI上Blastn比对，结果与Fusarium proliferatum strain H10的相似性为100％，证明分离到也是镰刀菌。

测序获得的序列为

>ITS Fusarium proliferatum strain H10

AACCCCTGTGACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA

以PCR检测技术作为对比实验

为验证PCR的检测方法是否适用于玉米种“糯2000”和玉米须中的镰刀菌检测。分别提取“糯2000”、玉米须(与以上“实施例一”的实验为同一批取样)和纯化后Fusarium verticillioides和Fusarium proliferatum的样品总DNA。根据镰刀菌EF1-α基因(Translation Elongation Factor 1-alpha gene)同源序列设计的一对引物EF1-αF：5‘-ATGGGTAAGGAGGACAAGACTCAC-3’和EF1-αR：5‘-GAGCGACAACATACCAATGACGG-3’，对样品DNA进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4。

图4中4个样品的基因组DNA均已提取成功，但用该DNA作为PCR模板进行EF1-α基因片段扩增时，只有F.verticillioides和F.proliferatum样品的DNA模板能扩增出目的带，而玉米种糯2000和玉米须样品无法扩增出目的带。因此，对比实验结果进一步说明：在目的细胞(镰刀菌)含量较少的样品中，通过基于PCR技术的检测方法并不足够灵敏，无法检测出样品中含有的少量镰刀菌；而本发明的方法可以分离检测出含量很低的镰刀菌。

实施例二 分离检测茭白中的镰刀菌

该实施例与实施例一不同的地方是：从菜市场上购买的茭白作为材料；只配制分离培养基的固体和液体两种培养基，成分含量为：0.5％甘露醇、2％琼脂粉(液体培养基不加琼脂粉)，0.3％K₂HPO₄，0.1％MgSO₄，0.1％CaCl₂，0.5％CaCO₃，pH值6.5。

培养出来的白色半透明菌丝经显微镜观察初步判断为镰刀菌。经分离液体培养基进一步扩大培养提取DNA后用真菌ITS1和ITS4引物扩增测序；测序的序列在NCBI上进行Blastn比对,结果与Fusarium chlamydosporum strain NZD-mf112有100％的相似性。至今尚无报道在茭白中分离或检测到镰刀菌的相关报道，本实施例说明本发明能广泛的应用到各种样品中镰刀菌的分离鉴定！

>ITS Fusarium chlamydosporum

CTCCCAACCCCTGTGACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA

从上述实施例中可以看出，本发明可以高灵敏、低成本的快速分离检测各种样品中的镰刀菌。