法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-05-16
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N30/02 专利号:ZL201610308527X 申请日:20160511 授权公告日:20180403
专利权的终止
2018-04-03
授权
授权
2016-11-09
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20160511
实质审查的生效
2016-10-12
公开
公开
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种测定血浆中5,2`-二羟基,6,7,8,5`-四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法。
背景技术
Skullcapflavone-II,即5,2`-二羟基,6,7,8,5`-四甲氧基黄酮,是从药用植物黄芩中分离得到的黄酮类新化合物。SKullcapflavone-II具有对抗炎症、病毒和免疫调节的作用。此外,许多成分有止痒、调节代谢紊乱、神经保护、促进血管新生、抗癌和抗HIV的作用。Skullcapflavone-II具有多种生物学特性,如细胞毒性的假定作用,对肥大细胞组胺释放的影响,通过胰蛋白酶抑制纤溶酶原激活物1型升高抑制剂和抗哮喘气道炎症反应。
其结构式如下:
目前尚未关于Skullcapflavone-II体内测定方法的文献报道。本发明建立了Skullcapflavone-II在beagle犬体内的测定方法,通过该方法对Skullcapflavone-II的药物代谢情况进行探索性研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法,血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度,具体方法包括如下步骤:
(1)血浆样品预处理:取血浆样品,加入内标新补骨脂异黄酮,加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取,取上清液在40℃氮气吹干后,用流动相溶解后进样分析;
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离:色谱条件中色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱;流动相:体积比为80∶20的乙腈与水;流速:0.2mL·min-1;>
(3)质谱测定,条件为:
离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测MRM;离子极性:正离子;skullcapflavone-II碰撞电压23eV;内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV;毛细管电压4.5kV;气帘气Curtain gas:20psi;离子源Gas1:70psi;离子源Gas2:80psi;脱溶剂温度:400℃;CXP:9V;碰撞气CAD:10V;DP:100V;EP:10V。检测对象的离子通道:skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1,内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1
(4)计算:采用内标法,以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。
具体地,步骤(1)中,取血浆样品500μL,加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
步骤(2)中,色谱柱长度为150mm,内径为2.1mm,填料粒径为5μm。
其中,所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。
在一个具体的实施方案中,所述血浆为人或动物的血浆。
在一个具体的实施方案中,所述血浆为犬血浆。所述的犬为beagle犬。
有益效果:本发明方法与现有技术相比具有如下优势:
(1)预处理方法简便:使用有机溶剂液页萃取法,适用于常规测定。
(2)专属性强:采用Agilem ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相,乙腈和水的混合液作为流动相,等度洗脱,Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右,内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右,4.5min完成测定,内源性物质不干扰二者的测定。
(3)灵敏度高:血浆最低定量限为1ng·mL-1。
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便,为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据,具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1~4000ng·mL-1,日内和日间精密度RSD均小于10%。
附图说明
图1为犬空白血浆的质谱图;
图2为犬空白血浆加入Skullcapflavone-II和内标对照品的质谱图;
图3为犬给予Skullcapflavone-II后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图;
注:图中离子通道1为Skullcapflavone-II,[M-H]+,m/z 375.1→345.1,保留时间为3.09min左右;离子选择通道2为内标新补骨脂异黄酮,[M-H]+,m/z 323.3→255.1,保留时间为2.88min左右。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例:犬血浆中Skullcapflavone-II浓度的测定
一、实验材料与仪器
skullcapflavone-II:由泽朗医药集团提供(南京,中国);新补骨脂异黄酮(内标):购于国家药品生物制品检定所购买(北京,中国);试验用水:超纯水;甲醇:色谱纯(Merck Company)。
Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm>
二、液质条件
1.液相色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.,5μm,Agilent Technologies,Wilmington,DE,USA);流动相:乙腈和水溶液(80∶20,v/v);流速:0.2mL·min-1;柱温:40℃。
2.质谱条件
离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测MRM;离子极性:正离子;skullcapflavone-II碰撞电压23eV;内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV;毛细管电压4.5kV;Curtain gas:20;Gasl:70;Gas2:80;脱溶剂温度:400℃;CXP:9;CAD:10;DP:100;EP:10。检测对象的离子通道:skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1,内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1。
三、实验过程:
1.Skullcapflavone-II标准溶液的配制:
精密称取Skullcapflavone-II 10.08mg,置于10mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得1.008mg·mL-1Skullcapflavone-II的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释,配成浓度分别为1,5,10,50,100,500,1000,4000ng·mL-1的Skullcapflavone-II标准溶液。
2.beagle犬血浆样品的采集与处理:
beagle犬静脉注射Skullcapflavone-II溶液,给药量为5mg·kg-1,于注射前及注射后5,10,15,30,45min和1,1.5,2,3,4,6,8,12h静脉采血1mL,注入肝素管内,3000rpm离心10min,制备血浆。取beagle犬血浆500μL,加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
3.专属性:
取没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
取离心管数支,加入Skullcapflavone-II标准溶液10μL,40℃氮气吹干,加入没有给予过Skullcapflavone-II的beagle犬空白血浆500μL,旋涡30s混匀,加入新补骨脂异黄酮(内标,100ng.mL-1)10μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用100μL流动相溶解后,10μL进样分析。
结果显示,在本实验所采用的LC-MS/MS条件下,血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰,Skullcapflavone-II保留时间在3.09min左右,内标补骨脂异黄酮保留时间在2.88min左右。Skullcapflavone-II和内标互不干扰,峰形良好,基线平稳。
4.线性试验
beagle犬血浆标准曲线:取离心管数支,分别精密加入不同浓度的Skullcapflavone-II标准溶液10μL,40℃氮气吹干,加入没有给予过Skullcapflavone-II的空白血浆500μL旋涡30s混匀,配成含Skullcapflavone-II的浓度分别为0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,4μg/mL的含药血浆。加入新补骨脂异黄酮(内标,100ng·mL-1)10μL,加入4mL乙酸乙酯,震荡3min后3500×g离心10min,取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后,用>-1范围内线性关系良好。最低定量限为1ng·mL-1。
5.准确度和精密度
按照beagle犬血浆标准曲线方法配制含Skullcapflavone-II浓度为0.002,0.02and2μg/mL的低、中、高的含Skullcapflavone-II血浆样品,按“beagle犬血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天,每天每个浓度各做5份样品,计算Skullcapflavone-II峰面积As和内标峰面积Ai的比值f,代入当天的血浆标准曲线中求得Skullcapflavone-II实测浓度,由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD),实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示,日内和日间精密度RSD均小于10%,准确度符合要求。
6.测定结果
上述6只给予过Skullcapflavone-II的beagle犬血浆中Skullcapflavone-II含量(给药后5min)分别为2.17、2.04、2.35、2.23、2.19、2.24μg/mL。
本发明通过采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相,乙腈和水的混合液作为流动相,等度洗脱,Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右,内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右,4.5min完成测定,内源性物质不干扰二者的测定,同时预处理方法简便;使用有机溶剂液页萃取法,适用于常规测定;灵敏度高,血浆最低定量限为1ng·mL-1,且本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便,为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据,具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1~4000ng·mL-1,日内和日间精密度RSD均小于10%。
机译: 测定生理标本中至少一种分析物浓度的测试条,测定生理标本中至少一种分析物的浓度的方法,在此类试验片上获取大量反应区的方法以及一种测试样测定生理标本中的至少一种分析物的浓度
机译: 血浆浓度信息测定方法,用于测定血浆浓度信息的探针以及血浆浓度信息测定装置
机译: 血浆浓度信息测定方法,用于测定血浆浓度信息的探针以及血浆浓度信息测定装置