基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器及其应用

摘要

本发明公开了一种基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器及其应用，属于分析检测领域。该传感器是利用丝网印刷电极，构建了一种基于聚苯胺膜和壳聚糖/铂碳球的生物传感器，实现了重金属离子的快速检测。本发明技术方案制备得到的脲酶生物传感器有很好的重现性且省时、省力、廉价、减少溶剂、减少对环境的污染等。传感器在不用时可以置于4℃的冰箱中保存，三个星期内电位响应都未下降，在保存30天后仍能保持初始电位响应的95%，说明壳聚糖能够有效地保持脲酶的活性，并能防止酶泄漏。

说明书

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器及其应用。

背景技术

随着绿色消费观念的普及，生态纺织品越来越成为市场的主流，近年来，纺织品中可萃取重金属的检测作为生态纺织品的指标之一越来越受到重视。纺织品中重金属的主要来源于加工过程中使用的染料和助剂,如各种金属络合染料、媒介燃料、酞箐结构染料、固色剂、催化剂、阻燃剂、后整理剂等以及用于软水硬化、退浆精练、漂白印花等工序中的各种金属络合剂。纺织品中可萃取重金属会通过人体的汗液进入到人体皮肤里面为人体吸收，在肝、骨骼、肾、心及脑中.当重金属在人体器官中累积到一定程度时会对健康造成巨大的损害。目前国家规定的纺织品中可萃取重金属的检测方法主要为GB/T 17593，其规定了纺织品中砷、镉、钴、铬、铜、镍、铅、锑等多种重金属的测试方法。主要使用的分析仪器为原子吸收光谱和电感耦合等离子发射光谱。

虽然现有的分析方法精度好，准确度高，但是现有的分析方法不能满足省时、省力、廉价、减少溶剂、减少对环境的污染等。

发明内容

本发明是针对现有技术存在的问题提供一种基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器，该传感器是通过如下方法制备得到：

(1)丝网印刷电极电聚合聚苯胺：首先将丝网印刷电极置于含有盐酸和苯胺的电聚合溶液中，之后采用循环伏安法进行电聚合，得到PAIN修饰电极；

(2)铂/碳球纳米复合材料：将碳球加入到乙二醇溶液中并超声分散均匀得到碳浆，在碳浆中缓慢加入氯铂酸并搅拌均匀得到混合液，采用碱性试剂调节该混合液至碱性，升温至100～150℃还原2～6h，之后将得到的黑色产物洗涤、干燥，得到铂/碳球纳米复合材料；

(3)脲酶生物传感器：将壳聚糖和步骤(2)制备得到的铂/碳球纳米复合材料加入到醋酸溶液中并混合均匀，得到壳聚糖-铂/碳球混合溶液；将壳聚糖-铂/碳球混合溶液与脲酶溶液混合均匀，得到脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液；在步骤(1)制备得到的PAIN修饰电极表面滴涂脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液，制备得到脲酶生物传感器。滴涂量约为15μL/cm²。

一种基于聚苯胺修饰丝网印刷电极的脲酶生物传感器制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)丝网印刷电极电聚合聚苯胺：首先将丝网印刷电极置于含有盐酸和苯胺的电聚合溶液中，之后采用循环伏安法进行电聚合，得到PAIN修饰电极；

(2)铂/碳球纳米复合材料：将碳球加入到乙二醇溶液中并超声分散均匀得到碳浆，在碳浆中缓慢加入氯铂酸并搅拌均匀得到混合液，采用碱性试剂调节该混合液至碱性，升温至100～150℃还原2～6h，之后将得到的黑色产物洗涤、干燥，得到铂/碳球纳米复合材料；

(3)脲酶生物传感器：将壳聚糖和步骤(2)制备得到的铂/碳球纳米复合材料加入到醋酸溶液中并混合均匀，得到壳聚糖-铂/碳球混合溶液；将壳聚糖-铂/碳球混合溶液与脲酶溶液混合均匀，得到脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液；在步骤(1)制备得到的PAIN修饰电极表面滴涂脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液，制备得到脲酶生物传感器。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(1)的电聚合过程是在氮气保护的条件下进行的，循环伏安法扫描范围为-0.1V～0.7V，扫描的速率为40～60mV/s，总扫描80～120次。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(1)的电聚合溶液中盐酸的浓度为0.1～3.5mol/L，苯胺的浓度为0.1～3mol/L。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(2)的碳球与氯铂酸的质量比为1～3：1。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(2)的碱性是指混合液的pH值为9～11。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(3)的壳聚糖-铂/碳球混合溶液中壳聚糖的质量分数为0.1～1％，铂/碳球纳米复合材料的质量分数为0.5～1.5％。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(3)的脲酶溶液浓度为5～15mg/ml，壳聚糖-铂/碳球混合溶液与脲酶溶液的体积比为1～5：1～5。

本发明技术方案所述的脲酶生物传感器及其制备方法中：步骤(3)的滴涂量为10～30μL/cm²。

前述所述的PAIN修饰电极在测定溶液pH中的应用；优选测定的抑制时间为≥20min，响应时间≥2min。

前述所述的脲酶生物传感器在检测重金属离子中的应用；优选在尿素溶液中检测Hg²⁺和Cd²⁺中的应用；更优选在尿素溶液中检测纺织品中Hg²⁺和Cd²⁺的应用。测定的抑制时间为≥20min，响应时间≥2min；优选尿素溶液的浓度≤选择40mmol/L。

本发明的有益效果：

本发明技术方案制备得到的脲酶生物传感器有很好的重现性且省时、省力、廉价、减少溶剂、减少对环境的污染等。传感器在不用时可以置于4℃的冰箱中保存，三个星期内电位响应都未下降，在保存30天后仍能保持初始电位响应的95％，说明壳聚糖能够有效地保持脲酶的活性，并能防止酶泄漏。

附图说明

图1为实施例1苯胺单体在丝网印刷电极上电聚合循环100次所得的伏安图。

图2为苯胺聚合前后，丝网印刷电极的循环伏案图。

图3为PAIN修饰电极的电位响应与溶液pH值的关系图。

图4为脲酶生物传感器置于尿素溶液的电位响应随时间的变化图。

图5为在Hg²⁺或Cd²⁺存在的情况下，抑制率随时间的变化见图5

图6为脲酶生物传感器置于含有尿素的溶液中，尿素浓度与电位变化图。

图7为脲酶生物传感器置于含有尿素的溶液中，抑制率与重金属浓度的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

本发明实施例所述的碳球可以是市售产品或者是采用如下方法制备得到：以甲醛-间苯二酚为先驱体，采用方法，0.1mL氨水(25w％)加到8mL乙醇与20mL去离子水的混合溶液中，搅拌1h后，加入0.2g间苯二酚，搅拌至完全溶解，然后再滴加0.284mL甲醛溶液(37w％)，混合液在30℃搅拌24h，然后将混合液移至水热釜中，在100℃ 反应24h，混合物经离心分离，100℃下干燥48h。接下来，进行炭化处理，以1℃/min的升温速率，加热到350℃，保持2h，然后再以1℃/min的升温速率加热到600℃，保留下煅烧4h，然后自然冷却到室温，制备得到碳球。

实施例1

丝网印刷电极电聚合聚苯胺：首先将丝网印刷电极置于含有盐酸和苯胺的电聚合溶液中，其中，HC1的摩尔浓度为1mol/L，苯胺的摩尔浓度为0.5mol/L；之后采用循环伏安法进行电聚合，循环伏安法扫描范围为-0.1V～0.7V，扫描速率为50mV/s，总共扫描100次。实验开始前电聚合溶液需通氮气l0min，整个电聚合过程在氮氛下完成。电聚合完成后，用1mol/L盐酸和二次水对电极进行冲洗，晾干，制得PAIN修饰电极；

铂/碳球纳米复合材料：将80mg碳球加入到乙二醇溶液中并超声分散均匀得到碳浆，在碳浆中缓慢加入42mg氯铂酸并搅拌均匀得到混合液，采用NaOH溶液调节该混合液pH至10，升温至130℃还原3h，之后将得到的黑色产物洗涤、干燥，得到铂/碳球纳米复合材料；

脲酶生物传感器：将壳聚糖和步骤(2)制备得到的铂/碳球纳米复合材料加入到醋酸溶液中并混合均匀，得到壳聚糖-铂/碳球混合溶液，该混合液中壳聚糖的质量分数为0.5％，铂/碳球纳米复合材料的质量分数为1％；将体积比为1：1的壳聚糖-铂/碳球混合溶液与浓度为10mg/ml脲酶溶液混合均匀，得到脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液；在步骤(1)制备得到的PAIN修饰电极表面滴涂15μL/cm²脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液，制备得到脲酶生物传感器。

实施例2

丝网印刷电极电聚合聚苯胺：首先将丝网印刷电极置于含有盐酸和苯胺的电聚合溶液中，其中，HC1的摩尔浓度为2mol/L，苯胺的摩尔浓度为1mol/L；之后采用循环伏安法进行电聚合，循环伏安法扫描范围为-0.1V～0.7V，扫描速率为40mV/s，总共扫描80次。实验开始前电聚合溶液需通氮气l0min，整个电聚合过程在氮氛下完成。电聚合完成后，用1mol/L盐酸和二次水对电极进行冲洗，晾干，制得PAIN修饰电极；

铂/碳球纳米复合材料：将50mg碳球加入到乙二醇溶液中并超声分散均匀得到碳浆，在碳浆中缓慢加入42mg氯铂酸并搅拌均匀得到混合液，采用NaOH溶液调节该混合液pH至9，升温至100℃还原6h，之后将得到的黑色产物洗涤、干燥，得到铂/碳球纳米复合材 料；

脲酶生物传感器：将壳聚糖和步骤(2)制备得到的铂/碳球纳米复合材料加入到醋酸溶液中并混合均匀，得到壳聚糖-铂/碳球混合溶液，该混合液中壳聚糖的质量分数为1％，铂/碳球纳米复合材料的质量分数为1.5％；将体积比为1：3的壳聚糖-铂/碳球混合溶液与浓度为5mg/ml脲酶溶液混合均匀，得到脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液；在步骤(1)制备得到的PAIN修饰电极表面滴涂10μL/cm²脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液，制备得到脲酶生物传感器。

实施例3

丝网印刷电极电聚合聚苯胺：首先将丝网印刷电极置于含有盐酸和苯胺的电聚合溶液中，其中，HC1的摩尔浓度为3mol/L，苯胺的摩尔浓度为1.5mol/L；之后采用循环伏安法进行电聚合，循环伏安法扫描范围为-0.1V～0.7V，扫描速率为60mV/s，总共扫描120次。实验开始前电聚合溶液需通氮气l0min，整个电聚合过程在氮氛下完成。电聚合完成后，用1mol/L盐酸和二次水对电极进行冲洗，晾干，制得PAIN修饰电极；

铂/碳球纳米复合材料：将120mg碳球加入到乙二醇溶液中并超声分散均匀得到碳浆，在碳浆中缓慢加入42mg氯铂酸并搅拌均匀得到混合液，采用NaOH溶液调节该混合液pH至11，升温至150℃还原2h，之后将得到的黑色产物洗涤、干燥，得到铂/碳球纳米复合材料；

脲酶生物传感器：将壳聚糖和步骤(2)制备得到的铂/碳球纳米复合材料加入到醋酸溶液中并混合均匀，得到壳聚糖-铂/碳球混合溶液，该混合液中壳聚糖的质量分数为0.4％，铂/碳球纳米复合材料的质量分数为1.5％；将体积比为3：1的壳聚糖-铂/碳球混合溶液与浓度为15mg/ml脲酶溶液混合均匀，得到脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液；在步骤(1)制备得到的PAIN修饰电极表面滴涂30μL/cm²脲酶-壳聚糖/铂/碳球混合溶液，制备得到脲酶生物传感器。

性能检测

1PAIN修饰电极的制备

图1为实施例1苯胺单体在丝网印刷电极上电聚合循环100次所得的伏安图，其循环伏安图显示其电极过程具有可逆性。氧化峰电位分别在0.22V，还原峰电位在0.08V。该峰为质子化的苯胺氧化为自由基阳离子的过程。随着循环次数的增加，峰电流增大，这是由于苯 胺一旦在电极表面聚合成膜，会发生自催化反应，同时聚合物的膜厚度也逐渐增加。制备得到的聚苯胺膜修饰电极为蓝绿色。苯胺聚合前后，丝网印刷电极的循环伏案图见图2，曲线a是在电聚合开始前，丝网印刷电极的循环伏安图，曲线b是在电聚合完成后，聚苯胺膜覆盖的丝网印刷电极循环伏案图。从图2可以看出，经过电聚合后，制备得到的聚苯胺修饰电极有一对明显的氧化还原峰，峰电流明显增大，说明聚苯胺膜电极成功制备。

2PAIN修饰电极的pH响应

PAIN修饰电极对溶液的电位有响应，可以测的溶液的pH值变化。电极的电位响应与溶液pH值的关系通过检测其与Ag/AgC1参比电极的开路电位得出。不同的pH值溶液，可以得到不同的电位值，结果如图3所示。此聚苯胺修饰丝网印刷电极的响应范围为pH 1～pH12，呈现出较好的线性关系，线性相关系数为0.999，斜率为：60.8mV/pH(T：25℃)，见图3。由图3可知，聚苯胺修饰电极具有良好的电位响应。

3响应时间和抑制时间的选择

脲酶生物传感器催化尿素的水解需要一定的响应时间，在进行测试时应保证相同的响应时间。将脲酶生物传感器置于尿素溶液中，测试其电位响应随时间的变化，具体结果见图4，从图4可以看出，电位响应随时间的增加而增大，在2分钟后趋于稳定。因此在检测电位时，选择电极的响应时间即酶促反应时间为2min。

在溶液中有重金属离子存在的情况下，脲酶的活性会受到抑制。随着时间的增长，抑制率会增加，在一定时间内抑制率达到平衡。将传感器置于含有Hg²⁺或Cd²⁺和尿素的溶液中，抑制率随时间的变化见图5，可以看出从0-20min，随着时间的增长，抑制率增加，在20min以后，抑制率达到一个平台，因此在进行重金属检测时，选择的抑制时间为20min。

4尿素浓度的选择

将实施例1制备得到的脲酶生物传感器置于含有尿素的溶液中，脲酶会催化尿素的水解，产生CO₂和NH₃，引发溶液的电位变化。尿素溶液的浓度会影响电位变化的程度，尿素浓度从10-100mmol/L与电位变化的关系见图6。从图6可以看出，尿素浓度从10到40mmol/L时，电位差与尿素浓度成正比，在尿素浓度从50mmol/L到100mmol/L电位差值随着尿素浓度的变化，增速变缓，这是由于电极表面固定的酶，仅能催化有限浓度的尿素，当尿素浓度过高时，酶的催化能力会趋于饱和。根据图6所示，选择≤40mmol/L的尿素溶液，最为合适。

5脲酶生物传感器用于重金属离子的检测

将实施例1制备得到的脲酶生物传感器置于40mmol/L的尿素溶液中，测定酶促反应引起的电位变化ΔE。在尿素溶液中分别加入不同浓度的Hg²⁺(10、50、100、500、1000、2000μg/L)和Cd²⁺(50、100、500、1000、2000、5000μg/L)溶液，20分钟后，测试抑制后的电位，计算抑制后的酶促反应的电位变化ΔE'。重金属对脲酶活性的抑制率等于[(ΔE-ΔE')/ΔE]×100％。

抑制率与重金属浓度的关系如图7所示，从图7中可以看出，对Hg²⁺和Cd²⁺的抑制率随着浓度的增加而增加，酶活性的抑制率与浓度的负对数呈良好的线性关系，线性相关系数均在0.99以上，Hg²⁺线性范围为10-2000μg/L，Cd²⁺的线性范围为500-5000μg/L，计算检出限为Hg²⁺3.89μg/L，Cd²⁺5.41μg/L(按抑制率10％计算)。

6脲酶生物传感器的重现性和稳定性

选用实施例1制备得到的脲酶生物传感器对500μg/L Hg²⁺和500μg/L>2+检测的相对标准偏差分别为7.2％，8.9％。表明该传感器有很好的重现性。传感器在不用时可以置于4℃的冰箱中保存，三个星期内电位响应都未下降，在保存30天后仍能保持初始电位响应的95％，说明壳聚糖能够有效地保持脲酶的活性，并能防止酶泄漏。

7传感器对纺织品实际样品的检测

纺织品样品溶液的制备：纺织品样品先剪碎成5mm×5mm碎片，称取2g，加入80mL酸性汗液，放入恒温水浴振荡器中振荡60分钟后，冷却待用。酸性汗液按照GB/T17593.2-2007的要求配制。

选用实施例1制备得到的脲酶生物传感器在纺织品样品提取液中进行加标回收，计算其回收率。具体内容见表1，从表1可以看出，样品的回收率范围在80％-120％之间，可以用于实际样品的检测。

表1实际样品的加标回收率