一种酪蛋白-百里香精油脂质体抗菌剂的制备方法和用途

摘要

本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体涉及一种酪蛋白‑百里香精油脂质体抗菌剂的制备方法及用途。本发明通过将百里香精油包裹在酪蛋白脂质体中，以实现减少百里香精油在施用过程中的挥发，从而减少百里香精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。

说明书

技术领域

本发明属于抗菌剂及食品添加剂或者化妆品领域，具体涉及一种酪蛋白-百里香精油脂质体抗菌剂的制备方法及用途。

背景技术

百里香，属于常绿灌木草本植物，是唇形科植物，花期7-8月，小坚果近圆形或卵圆形。主要有以百里酚为主的百里香酚百里香、含最多沉香醇的沉香醇百里香、以侧柏醇为主的侧柏醇百里香这三种。百里香精油具有治感冒、祛风、健脾消食、止咳化痰、温中散寒等作用。在海鲜、肉类、鱼类等食品中应用广泛，是天然的调味香料，可去除腥味，增加菜肴的风味；百里香中含有大量的单萜等挥发性成分，对人体具有极高的食用营养价值。

国内已有很多关于百里香在食品、化妆品、医药技术等领域的专利申请。CN103333509A公开了一种含有百里香精油的可食性鱼皮胶原蛋白抗菌膜及其制备方法。制备的胶原蛋白抗菌膜具有良好的抗菌性能，能被生物降解，不会对环境造成污染，能抑制食品表面微生物的生长，从而达到食品保鲜及延长货架期的效果。CN104739952A公开了一种具有促进伤口愈合作用的复方茶树精油，能促进皮肤新陈代谢，促进伤口愈合，且可防留疤。CN1618294公开了一种从天然芳香植物百里香中提取的精油作为活性成分的驱螨组合物，24h驱避率均达到100％。CN102178251A公开了一种百里香羊肉除膻调味剂，除膻效果良好，色泽优美，百里香香气适宜，口感和谐自然，具有很高的应用价值和广阔的市场前景。CN104379156A公开了一种铺地百里香提取物，用于治疗肠炎性疾病。CN104478607A公开了一种百里香酚杀菌剂及其该杀菌剂几种剂型的制备方法。该杀菌剂低毒、环保、安全、无害，是一种非常具有市场应用前景的杀菌剂。CN104381334A公开了一种微囊悬乳剂，特别是含有阿维菌素、百里香酚、茚楝油、生半夏活性成分的微囊悬乳剂的配方及其制备方法。阿维菌素和百里香酚具有协同增效作用，复配作用明显，大大降低农药的用药量，还可扩大杀虫谱，提高杀虫效率。

虽然百里香精油在医学，食品和化妆品行业被广泛应用，具有较好的杀菌、增香等特点，但是百里香精油易挥发，暴露在空气中不稳定，所以要寻找有效的方法降低百里香精油在使用过程中的挥发程度，延长其贮存期。

纳米脂质体能将精油包裹在内，并且纳米脂质体不会对百里香精油的主要活性成分造成破坏。纳米脂质体使百里香精油中的活性成分与外界环境隔绝开来，可以降低百里香精油的挥发性，延长保存期。但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期有限。因此，选用酪蛋白制成稳定性更高的酪蛋白脂质体。此外，纳米脂质体由于它们的亚细胞尺寸，能加强脂质体的被动吸收机制，减少物质运输阻力，从而增强精油的抗菌效果。

发明内容

本发明的目的是公开一种酪蛋白-百里香精油脂质体的制备方法及其用途，通过将百里香精油包裹在酪蛋白脂质体中，以实现减少百里香精油在施用过程中的挥发，从而减少百里香精油的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。本发明由百里香精油，大豆卵磷脂，胆固醇和表面活性剂，酪蛋白制成酪蛋白-百里香精油脂质体。

本发明的制备方法是将百里香精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸发形成光滑的薄膜，加入水相介质溶解膜状物并超声成乳液，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的百里香精油脂质体，其特征在于：将纳米级的百里香精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液混合，搅拌均匀，通过低温冷冻缓慢融化的方法使酪蛋白镶嵌在脂质体上，通过温和超声使脂质体闭合，最终形成包裹百里香精油的酪蛋白脂质体。

本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为5:1；用于制备精油脂质体的乳液含有百里香精油的浓度为5.0mg/mL；表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹百里香精油的酪蛋白脂质体后其最终浓度为1.0mg/mL。

本发明中所述的有机溶剂为氯仿。

本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的磷酸盐缓冲溶液，pH值6.5～7.4，优选7.2。

所述的酪蛋白和表面活性剂的溶液是将酪蛋白分散在Brij-35的磷酸盐缓冲液中得到的，Brij-35浓度为10mg/mL，分散后溶液中酪蛋白浓度为1.0mg/mL。

本发明中脂质体上镶嵌的蛋白为酪蛋白，百里香精油脂质体与酪蛋白和表面活性剂的溶液以体积比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白浓度为0.1mg/mL，Brij-35浓度为1.0mg/mL。

本发明中低温冷冻缓慢融化是指将混合液在-18℃下冷冻2h，随后在0℃ 下缓慢融化2h。

本发明中温和超声是指在低功率50W条件下超声2h，温度范围0-10℃。

附图说明

图1酪蛋白-百里香精油脂质体的包封率。

图2酪蛋白-百里香精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)。

图3酪蛋白-百里香精油脂质体对大肠杆菌的抗菌效果。

图4酪蛋白-百里香精油脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

表1酪蛋白-百里香精油脂质体的Zeta电位。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此

实施例1酪蛋白-百里香精油脂质体的包封率

1实验材料

2实验方法

1)百里香精油脂质体的制备

①称取1g大豆卵磷脂，0.2g胆固醇和250mg的百里香精油，加入50mL氯仿使其溶解。

②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10～30℃，圆底烧瓶内壁会形成光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30℃，真空状态下干燥24h。

③加入50mL的磷酸盐缓冲液到圆底烧瓶中进行水化，水化超声波功率为100W，超声时间为5h。

④将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以功率360W，工作10s，间隙5s，粉碎30min。

⑤将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。

⑥将所得液体用0.22μm滤膜进行过滤，得滤液。

2)酪蛋白-百里香精油脂质体的制备

①按照上述百里香精油脂质体的制备方法，制备百里香精油浓度为5.0mg/mL的百里香精油脂质体。

②将酪蛋白超声分散在含10mg/mL Brij-35的磷酸盐缓冲液中，形成酪蛋白—Brij-35溶液，其中酪蛋白浓度为1.0mg/mL。

③在50mL百里香精油脂质体中添加5mL酪蛋白—Brij-35溶液，混合均匀。④将所得混合液于超声条件下扩散10min。

⑤将所得混合液在-18℃下冷冻2h。

⑥将所得混合液在0℃下缓慢融化2h。

⑦通过温和超声(功率50W，2h，KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)使脂质体闭合，所得溶液即为酪蛋白-百里香精油脂质体。

3)包封率的测定

用无水乙醇稀释百里香精油，逐级稀释成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的标准溶液。然后，分别吸取1μL标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分的谱峰面积进行自动积分，绘制主成分峰面积-百里香精油浓度标准曲线。取1mL酪蛋白-百里香精油脂质体样品，13500rpm，离心3h，倒掉上清液。接着加入1mL乙醇破乳剂，超声3h。最后以10000rpm的转速离心15min，取上清液，用于GC-MS分析。制备好的脂质体样品，对精油主成分的峰面进行自动积分，再根据绘制的标准曲线，计算出脂质体中百里香精油的含量。则：

3酪蛋白-百里香精油脂质体的包封率

包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒等特点的关键。由图1可看出，百里香精油脂质体的包封率为38.42％，酪蛋白-百里香精油脂质体的包封率为75.89％。因此制备酪蛋白-百里香精油脂质体可以明显提高脂质体的包封率。

实施例2酪蛋白-百里香精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)

1实验材料

①空白脂质体

②百里香精油脂质体

③酪蛋白-百里香精油脂质体

2实验方法

用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为BI-9000的高浓度激光粒度仪测定酪蛋白-百里香精油脂质体的粒径和多分散系数(PDI)值，所测样品放入样品池直接测量即可。

3酪蛋白-百里香精油脂质体的粒径与多分散系数(PDI)

多分散系数(PDI)直接反映酪蛋白-百里香精油脂质体的稳定性，因此是主要参考指标，脂质体的PDI在0～0.3范围内属于最好，在0.3～0.7范围内较差，但可以接受，当PDI>0.8时，不予考虑。如图2所示，空白脂质体的粒径为86.4nm、PDI为0.353，百里香精油脂质体的粒径为146.6nm、PDI为0.254，酪蛋白-百里香精油脂质体的粒径为628.0nm、PDI为0.028。酪蛋白-百里香精油脂质体的多分散系数(PDI)最小，因此制备酪蛋白-百里香精油脂质体可以明显提高脂质体的稳定性。

实施例3酪蛋白-百里香精油脂质体的Zeta电位

1实验材料

①空白脂质体

②百里香精油脂质体

③酪蛋白-百里香精油脂质体

2实验方法

用英国马尔文仪器有限公司生产的型号为ZetasirernanoZSZeta的电位仪测量，直接将待测脂质体样品放入电位仪中测量即可。

3酪蛋白-百里香精油脂质体的Zeta电位

表1 酪蛋白-百里香精油脂质体的Zeta电位

Zeta电位也可以直接反映酪蛋白-百里香精油脂质体的稳定性，因此也是主要参考指标，脂质体的Zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，Zeta电位的绝对值在0～30范围内属于不稳定，在大于30时脂质体较稳定性。如表1所示，三种脂质体均带负电，空白脂质体的Zeta电位为-22.8mV，其绝对值小于30，脂质体不稳定；百里香精油脂质体的Zeta电位为-36.1mV，其绝对值大于30，脂质体较稳定；酪蛋白-百里香精油脂质体的Zeta电位为-41.5mV，其绝对值最大，脂质体最稳定。

实施例4酪蛋白-百里香精油脂质体的抗菌性能

1实验材料

①百里香精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天)

②酪蛋白-百里香精油脂质体(保存7天、30天、60天、90天)

2实验方法

采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为模式菌种测定酪蛋白-百里香精油脂质体的残存菌数。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，分别置于空气摇床中在37℃、150rpm的条件下震荡培养24～48h，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别加入含有一定量无菌磷酸盐缓冲液的试管中(细菌浓度约为10⁵～10⁶CFU/mL)，然后再向试管中加入浓度为20％(v/v)的百里香精油脂质体及酪蛋白-百里香精油脂质体。同时另取两个分别含有以上两种菌的试管并向其中加入等量无菌水(不加脂质体)作为对照。将各试管均置于空气摇床中在37℃、150rpm的条件下震荡反应24h。分别于不同时间点的取适量培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μL稀释液滴到无菌固体平板培养基上，涂布均匀之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。24～48h后进行平板菌落计数，从而对百里香精油脂质体和酪蛋白-百里香精油脂质体的抗菌活性进行评价。实验重复三次，结果取平均值。

3酪蛋白-百里香精油脂质体的抗菌性能

不同保存期的酪蛋白-百里香精油脂质体的抗菌活性的变化也可以间接反映脂质体的稳定性。因此对保存7天、30天、60天、90天的百里香精油脂质体及 酪蛋白-百里香精油脂质体进行了抗菌性能评价，结果如图3、图4所示。保存时间为7天时，百里香精油脂质体与酪蛋白-百里香精油脂质体的抗菌活性相近，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了良好的抗菌效果。保存时间为30天时，百里香精油脂质体的抗菌效果明显降低，而酪蛋白-百里香精油脂质体仍然显示出良好的抗菌效果。保存时间为60天和90天时，百里香精油脂质体几乎没有显示抗菌效果，而酪蛋白-百里香精油脂质体仍然保持良好的抗菌效果。