一种酪氨酸脱羧酶突变体及其基因和应用

摘要

本发明公开了一种酪氨酸脱羧酶突变体及其基因和应用。该突变体是将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的具有如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的酪氨酸脱羧酶在586位的丝氨酸被丙氨酸取代后得到。本发明所述酪氨酸脱羧酶突变体对底物酪氨酸的比活力是野生型酪氨酸脱羧酶的2.23倍，对底物的Km值为野生型酶的72.4％。所述酪氨酸脱羧酶突变体比野生型适于酪胺产品的制备，具有良好的工业开发前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酪氨酸脱羧酶的突变体及其基因和应用。

背景技术

酪胺是一种自然存在的痕量单胺，是一种具有非常重要的化合物。在哺乳动物体内，酪胺可通过促进肾上腺素的释放进而增加由毛喉素介导的cAMP的生成和β肾上腺素介导的脂解作用来发挥作用，因此酪胺在减肥产品中具有巨大的应用潜力。酪胺具有升高血压和兴奋子宫等药理作用，应用于生化试剂、有机化工及医药中间体，可用于治疗偏头痛和诊断嗜铬细胞瘤药物的合成。此外酪胺还可用于制备降血脂药物苯扎贝特，通过降低胆固醇和甘油三酯含量达到降血脂的目的。研究发现酪胺具有类似胰岛素的功能，它可以刺激葡萄糖的转运并可有效地治疗II型糖尿病。酪胺及其衍生物还可有效降低黑色素的产生，目前已被应用于化妆品行业。

由于酪胺在医药、保健和化妆品行业的突出表现，酪胺的合成方法也备受关注。目前，我国的酪胺还主要依靠进口，价格较高。已报道的酪胺制备方法中包括化学合成法、生物发酵法和生物催化法。生物催化法集化学合成法、生物发酵法两种酪胺生产方法的优点于一体，具有反应条件温和、周期短、操作简单、副产物少、产物纯化简便、能耗低、环境污染小等优点，因此更加符合“可持续发展”、“绿色化学”的理念，生物催化法生产酪胺具有广阔的发展前景。酪氨酸脱羧酶是一种依赖磷酸吡哆醛的氨基酸脱羧酶，它可以催化酪氨酸脱羧生成酪胺并释放出CO₂。目前市场上已有从粪肠球菌中分离纯化的酪氨酸脱羧酶作为商品化酶制剂在销售(Sigma)。然而其价格较高，无法利用酪氨酸脱羧酶进行工业化的生物催化反应。

从短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.2028克隆得到的酪氨酸脱羧酶已在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组过量表达(Protein Expression and Purification,2014,94,33–39；CN103421734A)。然而关于该酪氨酸脱羧酶催化反应的关键位点不明确，尚未有关于酪氨酸脱羧酶分子改造的研究报道。本发明通过解析获得的短乳杆菌酪氨酸脱羧酶的晶体结构，对酶底物结合口袋的氨基酸进行定点突变得到了对底物酪氨酸的催化活性显著提高的突变株，该突变株具有较可观的工业应用价值。

发明内容

因此，本发明提供了一种酶活力提高的酪氨酸脱羧酶突变体蛋白质及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，含有该酪氨酸脱羧酶突变体蛋白质的细胞的制备方法，以及该酪氨酸脱羧酶突变体蛋白质作为催化剂在催化酪氨酸脱羧反应，制备酪胺中的应用。与野生型酪氨酸脱羧酶相比，本发明提供的酪氨酸脱羧酶突变体蛋白质对底物酪氨酸具有更高的催化效率。

本发明采取的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，所述蛋白质是在具有如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质中底物结合关键氨基酸为点经过取代一个氨基酸且具有酪氨酸脱羧酶活性的衍生蛋白质。

其中所述的取代的位点较佳地为：序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第98位、99位、100位、101位、102位、103位、294位、297位、298位、299位、331位、391位、395位、396位、397位、398位、505位、586位和第588位氨基酸中的一位。

其中所述蛋白质较佳地为：将序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质的第98～103位的氨基酸分别突变为丙氨酸(H98A、M99A、N100A、S101A、E102A、T103A)；所述氨基酸序列中第294位、297位、298位、299位、331位、391位、395位、396位、397位、398位、505位和588位氨基酸分别突变为丙氨酸(V294A、S297A、T298A、E299A、Y331A、H391A、V396A、P397A、Y398A、M505A、M588A)；所述氨基酸序列中第295位的丙氨酸突变为苯丙氨酸(A295F)；所述氨基酸序列中第296位的甘氨酸突变为苯丙氨酸(G296F)；所述氨基酸序列中第586位的丝氨酸分别突变为其它19种标准氨基酸，其中更佳地为突变为丙氨酸(S586A)。

本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化获得所述蛋白质。

本发明所采用的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述的核酸是编码上述蛋白质的核酸分子。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码酪氨酸脱羧酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码酪氨酸脱羧酶突变体的基因核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码酪氨酸脱羧酶突变体的核酸分子。

如本领域技术人员所知，编码SEQ ID No.1的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明所述具有点突变的核酸分子的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：以连接有来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC1.2028中的酪氨酸脱羧酶基因的pET24a载体为模板(该基因名称：lbtdc，请参考CN103421734A，登录号EU195891.1)，利用含有突变点的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸位点上下游各15～20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后氨基酸的密码子，作为PCR正向引物，其反向互补序列即为PCR反向引物)，通过PCR方法扩增，即得到带有点突变的核酸分子。其中所述含有突变点的突变引物的序列如序列表中SEQ ID No.2～SEQ ID No.81所示。

其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。利用所得PCR引物进行PCR扩增程序，即得编码所述酪氨酸脱羧酶突变体的核酸分子。

其中所述PCR扩增为本领域常规技术，其中所述PCR反应的体系(20μL)较佳地为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.0μL，25mmol·L^-1MgSO₄>-1dNTPs>

所述PCR扩增的程序较佳地为：(1)94℃变性2min；(2)94℃变性10sec，(3)55℃退火30sec；(4)68℃延伸3.5min；步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68℃延伸7min，4℃保藏产物。

本发明采用的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的酪氨酸脱羧酶突变体基因的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，本发明所述载体优选地为pET24a(+)。

本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的酪氨酸脱羧酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(Escherichia coli)，更加的为大肠杆菌BL21(DE3)将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明所采取的技术方案之五是：一种重组酪氨酸脱羧酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物种获得重组酪氨酸脱羧酶。

其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠杆菌接种至含有氨苄青霉素的(100μg/mL)LB培养基中，30～40℃，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.8)，加入0.05～1.0mmol/L(优选地为0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30℃(优选25℃)，诱导12～16小时即可得到高效表达的重组酪氨酸脱羧酶。

本发明所采取的技术方法之六是：上述蛋白质或上述重组表达转化体作为催化剂在酪氨酸脱羧中的应用。

本发明所用试剂盒原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：在天然酪氨酸脱羧酶晶体结构的基础上，通过对活性位点氨基酸进行定点突变得到了S586A突变体。S586A突变体酶的纯酶比活力为野生型的2.23倍，底物亲和力K_m值为野生型的72.4％。本发明表明586为氨基酸残基对酶的催化活性有较大影响，为酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了酪氨酸脱羧酶生物催化法生产酪胺在工业上的应用潜力。

附图说明

图1为酪氨酸脱羧酶突变体表达及纯化结果的SDS-PAGE电泳图。其中：图1(A)泳道1为不同分子量的蛋白质标准品，泳道2为野生型酪氨酸脱羧酶蛋白，泳道3-9分别为突变体蛋白H98A、M99A、N100A、S101A、E102A、T103A、V294A。图1(B)泳道1-7分别为突变体蛋白A295F、G296F、S297A、T298A、E299A、Y331A和H391A，泳道8为不同分子量的蛋白质标准品，泳道9为野生型酪氨酸脱羧酶蛋白。图1(C)泳道1-6分别为突变体蛋白V396A、P397A、Y398A、M505A、S586A和M588A，泳道7为野生型酪氨酸脱羧酶蛋白，泳道8为不同分子量的蛋白质标准品。

图2为酶促酪氨酸脱羧反应的进程曲线图。图中所示两条曲线为反应过程中底物酪氨酸和产物酪胺在反应体系中的浓度变化。其中▲：酪氨酸；●：酪胺。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体实验条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1短乳杆菌酪氨酸脱羧酶突变体的制备

定点突变采用II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Catalog#200522)所述方案进行操作。首先设计含有突变点的突变引物，如表1所示，包括对序列表中SEQ ID NO:1所示序列中第98位、99位、100位、101位、102位、103位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、331位、391位、395位、396位、397位、398位、505位、586位和588位引入突变的引物，以及对586位进行饱和突变(将586位的丝氨酸突变为其余19种氨基酸中的任意一种)的引物。上述引物的序列如序列表SEQ ID No.2～81所示：

表1酪氨酸脱羧酶的突变引物

利用上述引物，以含有LbTDC基因的pET-24a质粒为模板，进行全质粒PCR反应。反应体系如下(20μL)：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.0μL，25mmol·L^-1MgSO₄>-1dNTPs>

PCR扩增程序：94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；72℃延伸3.5min；扩增15个循环后，再68℃后延伸7min，最后冷却至4℃保存。

扩增得到的PCR产物经内切酶Dpn I于37℃消化2h后，分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，经37℃过夜培养，挑取单克隆，即得到含突变体表达质粒的E.coli BL21(DE3)菌株，部分送至赛音生物技术(上海)有限公司测序，部分用于保存甘油管。测序结果用DNAMAN软件与野生型酪氨酸脱羧酶基因序列进行比对，确认突变前后基因序列及相应的氨基酸序列的差异。

实施例2短乳杆菌酪氨酸脱羧酶突变体的表达与纯化

1.酪氨酸脱羧酶突变体的表达

将实施例1中测序成功的突变体的表达菌株接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和20g/L葡萄糖)中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.8后降温至25℃，并加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，诱导6h后8000×g离心7min收集菌体。菌体用A液(25mmol/L>

2.酪氨酸脱羧酶突变体的纯化

镍柱亲和纯化酪氨酸脱羧么突变体蛋白，步骤如下：

(1)Ni柱使用前首先用A液(25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，5mmol/Lβ-巯基乙醇)平衡5～10个柱体积。

(2)粗酶液以1mL/min的流速上样，将目的蛋白吸附到Ni柱上。

(3)上样完成后，再用A液(25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，5mmol/Lβ-巯基乙醇)平衡5个柱体积以洗脱与Ni柱非特异性结合的杂蛋白。

(4)用含不同咪唑浓度的B液(25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，300mmol/L NaCl，75、300mmol/L咪唑，5mmol/Lβ-巯基乙醇)对目的蛋白进行分步洗脱。洗脱液分别收集。

(5)用SDS-PAGE分析收集到的蛋白样品，确定目的蛋白的纯度。收集高纯度的蛋白洗脱液。

实施例3酪氨酸脱羧酶突变体的酶活性分析

酪氨酸脱羧酶的活力用反相HPLC(C18柱)测定，通过测定反应前后酪胺的增加量来确定酪氨酸脱羧酶的活力。酶活力定义为，测活条件下，1min转化1μmol底物生成产物所需的酶量为1U。比活力定义为，每毫克蛋白所具有的活力单位数。

酪氨酸脱羧酶的测活体系(1mL)为：40℃预热的2.75mmol/L底物950μL(溶于0.2mol/L，pH 5.0的醋酸钠缓冲液中)，5mmol/L辅酶PLP 40μL，10μL合适浓度的酶液。反应在2mL EP管中进行，40℃反应10min后，用金属浴100℃灭活10min以终止反应。反应液冷却后，12,000×g离心10min并通过0.22μm滤头过滤。利用Diamonsil C18柱(迪马科技)、安捷伦1260液相分析底物与产物的相对含量。液相检测条件：进样体积为10μL，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长220nm。流动相为甲醇:水:冰醋酸＝10:90:0.1。蛋白浓度用Bradford法蛋白定量试剂盒测定。

野生型酪氨酸脱羧酶与突变体酶的比活力见下表(野生型酪氨酸脱羧酶的比活力定义为100％)。

表2酪氨酸脱羧酶突变体对酪氨酸的比活力

酶比活力(U·mg^-1)相对活力(％)WT43.1100H98A20.347.1M99A3.88.8N100A1.22.7S101A42.598.4E102A0.92.0T103A6.715.6V294A22.351.7A295F3.89.0G296F9.923.0S297A24.556.9T298A2.55.9E299A4.610.7Y331A2.45.5H391A17.841.2Y395A0.92.0V396A2.35.3P397A22.953.2Y398A0.61.5M505A5.111.8S586A96.0222.6M588A3.99.0

上表列出了实施例2纯化后的突变体蛋白的比活力情况。结果表明在将酪氨酸脱羧酶底物结合位点周围位阻较大的残基突变为位阻较小的丙氨酸后，S586A突变体具有最高的脱羧活力，对酪氨酸的催化活性提高了2.23倍。

为阐明S586突变成丙氨酸活力增加的详细机制，我们首先对586位丝氨酸进行饱和突变，但饱和突变体中多数没有可检测的活性，仅有S586G、S586T、S586V、S586F、S586L、S586I、S586N、S586Y、S586C和S586E表现出了一定的催化活力。下表列出了具有可检测酶活力的586位的突变体。

表3第586位饱和突变体催化酪氨酸脱羧的比活力

上表表明除S586A外，只有S586G和S586T对酪氨酸底物保留超过10％(32.6％和10.0％)的相对活力，其他突变体对酪氨酸的酶活力都低于5％或没有可检测的酶活力，这表明S586是底物结合或催化的关键残基。为从机理上分析S586A催化活力提高的原因，我们对S586A进行了动力学分析。动力学参数测定是在不同底物浓度(0.55、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5mmol/L)下，按照实施例3中的酶活测定的方法测定酶活力，并通过比活力来表征反应速率，利用Oringin9.0软件拟合到米氏方程，从而得到他们的K_m和k_cat值。表4列出了野生型酪氨酸脱羧酶与S586A突变体对酪氨酸的动力学参数。

表4酪氨酸脱羧酶野生型及突变体对酪氨酸的动力学常数

结果表明S586A突变体蛋白对酪氨酸的亲和力和催化效率较野生型均有提高。结合饱和突变比活力和动力学参数结果我们推测LbTDC发挥脱羧作用对586位的氨基酸具有空间位阻与疏水性的要求。

实施例4酪氨酸脱羧酶突变体在催化酪胺形成中的应用

实施例3结果表明，将酪氨酸脱羧酶586位的丝氨酸突变成丙氨酸后具有相对较高的比活力。将实施例2所得到的酪氨酸脱羧酶S586A突变体的粗酶粉对酪胺进行了合成。酪胺合成体系为：在1L，0.2M，pH 5.0的醋酸钠缓冲液中，加入100mM酪氨酸，0.2mM磷酸吡哆醛，S586A突变体蛋白20mg，在40℃条件下200rpm搅拌反应。反应进行0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、4.0h、5.0h和6.0后按实施例3所述方法取0.5mL反应液进行灭活处理，反相HPLC法检测底物与产物的含量，计算酪氨酸的转化率和酪胺的合成速率。结果显示酪氨酸可以完全转化。

上述结果显示本发明所述酪氨酸脱羧酶突变体对酪氨酸脱羧反应具有良好的催化效果。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。