前体和诱导子对石蒜酪氨酸脱羧酶基因表达和生物碱积累影响

摘要

生物碱是石蒜科植物重要的次生代谢产物，具有药用价值。本试验的主要的研究内容为：建立石蒜不定芽培养体系，探究在不同的生长条件下，石蒜不定芽酪氨酸脱羧酶基因表达量的变化，该酶活性的变化及石蒜不定芽中生物碱积累量的变化。分析石蒜酪氨酸脱羧酶基因在石蒜生物碱积累过程中所发挥的作用。获得以下试验结果：
　　1.筛选出合适的内参基因。内参基因是荧光定量 PCR试验中获得可靠试验结果的前提。检测石蒜中ACT,18s rRNA, GADPH, P450等四个基因在不同生长条件下石蒜组织中的表达水平。所得试验数据通过GeNorm分析软件进行分析，结果显示在不同的样本中四个候选基因平均表达稳定值M从大到小依次为：P450>GAPDH>18S rRNA>ACT。因此，在本实验中选用内参基因的是ACT。
　　2.应用qRT-PCR技术，检测了不同生长条件下石蒜不定芽中TYDC基因表达量。结果显示，酪氨酸对不定芽TYDC基因表达量都有提升作用。高浓度的酪氨酸对不定芽TYDC基因表达上调作用要明显强于低浓度的酪氨酸。不同浓度的酪氨酸处理后， TYDC基因表达量达到最高时是在处理后48 h，随后该基因表达量开始下调。低浓度的MeJA处理，该基因表达上调。浓度为20μmol/L的MeJA处理24 h后，TYDC基因表达量达到最高，随着浓度的升高，该基因的表达量开始下调，MeJA浓度高于100μmol/L时，对不定芽TYDC基因表达表现出一定的抑制作用。
　　3.建立了石蒜不定芽酪氨酸脱羧酶活性检测方法。酪氨酸脱羧酶反应体系为：0.1mol/L磷酸盐缓冲液，2 mmol/L酪氨酸溶液，0.2 mmol/L磷酸吡哆醛，0.5 mL粗酶液，总反应体积为3 mL，反应时间为30 min。通过检测产物酪胺的生成量来检测酶活性。酪胺通过HPLC法检测。酪胺检测条件为，流动相为：A：50 mmol/L乙酸铵水溶液（pH4.5）；B：甲醇，0-4 min A96％, B4%;4-20 min A96-90%, B4-10%.检测波长为276 nm，流速1 mL/min，进样量10μL。检测柱为：Eclipse XDB-C18(250 mm x4.6 mm,5μm)，柱温为室温。
　　4.前体物和诱导子对酪氨酸脱羧酶活性的影响。酪氨酸处理，酪氨酸脱羧酶活性都有一定的提升。当添加150μmol/L的酪氨酸时，同组处理的石蒜不定芽酪氨酸脱羧酶活性达到最高，随着酪氨酸浓度进一步增加，酪氨酸脱羧酶活性有一定程度的下降。当MeJA的浓度较低时，与对照组相比酪氨酸脱羧酶活性有着显著地增加。MeJA浓度继续增大时，对酪氨酸脱羧酶活性提升的作用则会出现下降。
　　5.不同生长条件下不定芽生物碱积累量检测。酪氨酸对石蒜生物碱的积累均有促进作用。当加入的酪氨酸浓度为150μmol/L时，石蒜不定芽中石蒜碱的含量为349.86μg/g，是对照组石蒜碱含量的2.66倍。当把200μmol/L的酪胺加入到石蒜不定芽液体培养基时，力克拉敏和加兰他敏的含量达到最高，分别为391.53μg/g和233.48μg/g，分别是对照组的2.58倍和2.80倍。不同浓度的茉莉酸甲酯对石蒜不定芽生物碱的合成有着不同的作用。其中低浓度的茉莉酸甲酯处理对不定芽生物碱的积累有着显著的促进作用；但是随着茉莉酸甲酯浓度的增加，石蒜生物碱的含量显著下降。当茉莉酸甲酯浓度为20μmol/L时，力克拉敏的含量为416.04μg/g，是对照组的2.74倍。石蒜碱和加兰他敏积累量最高的一组是添加50μmol/L的茉莉酸甲酯，这两种生物碱的积累量分别为381.72μg/g和267.35μg/g，与对照组相比分别增加了1.90倍和2.20倍。

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1 文献综述

1.1 石蒜简介

1.2 石蒜生物碱简介

1.3 石蒜科植物组织培养的研究

1.4 石蒜生物碱合成的研究

1.5 酪氨酸脱羧酶研究

2 引言

2.1 研究内容及意义

2.2 技术路线

3 材料和方法

3.1 材料

3.2 试剂与仪器

3.3 石蒜不定芽培养

3.4 石蒜酪氨酸脱羧酶基因克隆

3.5 内参基因筛选

3.6 TYDC基因和内参基因荧光定量PCR

3.7 酪氨酸脱羧酶活性测定方法

3.8 生物碱的提取与检测

3.9 数据处理与分析

4 试验结果与分析

4.1 石蒜不定芽总RNA提取检测

4.2 TYDC基因克隆

4.3 内参基因和TYDC基因扩增标准曲线

4.4 内参基因的选择

4.5 TYDC基因在石蒜不定芽中表达水平的变化

4.6 酪氨酸脱羧酶活性检测

4.7 生物碱含量检测

5 讨论

5.1 实时定量PCR内参基因的筛选

5.2 荧光定量的方法

5.3 酪氨酸脱羧酶活性检测方法建立和前体物与诱导子对其活性的影响

5.4 石蒜酪氨酸脱羧酶基因表达与生物碱积累的相关性分析

6 结论

参考文献

附录及缩略词

致谢

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