一种基于HSP90AB1基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒

摘要

本发明涉及一种基于HSP90AB1基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包含组分：检测HSP90AB1基因多态性位点基因型的引物，PCR扩增酶及相应缓冲液，PCR产物纯化酶，dNTP，单碱基延伸反应酶及相应缓冲液，单碱基延伸产物纯化酶。HSP90AB1基因rs9367190多态性位点基因型为CA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好。rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型为CA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效差。rs13296多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量（心理健康）改善差。本发明为指导SLE患者的个体化治疗提供了新的思路和方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，属于医药卫生技术领域。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病。SLE患病率存在性别差异，好发于青中年女性，但亦见于儿童及老年人，患病率男女比约为1：>8。目前SLE的发病机制尚不完全清楚，证据显示遗传因素和环境因素是导致其发生的两个主要因素。SLE患者近亲发病率约为5％，同卵孪生发病率(约68％)远高于异卵孪生发病率(约3％)。流行病学调查显示SLE患病率存在地区差异(14.6-122/10万人)，我国SLE患病率高于西方国家和亚洲其它国家，约为70/10万人，妇女的患病率高达113/10万人。近年随着医疗水平的提升，SLE患者生存率不断提高，我国SLE患者5年生存率约为95％，10年生存率约为90％。该病给患者本人、家庭及社会造成了极大的经济负担，是一个重要的公共卫生问题。

糖皮质激素(glucocorticoids，GC)因其抗炎和免疫抑制作用被广泛应用于SLE的治疗，是目前公认的治疗SLE的基础药物。但临床实践显示GC治疗SLE是一把“双刃剑”，即GC治疗SLE患者的疗效及不良反应存在极大的个体化差异，部分患者对治疗反应敏感，部分患者对治疗反应不敏感，甚至会产生严重不良反应(有可能导致患者死亡)，因此SLE治疗必须遵循个体化用药原则。目前，临床上仍缺乏能够真正指导SLE患者个体化治疗的方法，SLE患者的GC初始治疗剂量、治疗过程中GC剂量调整以及何时加用其它免疫抑制剂等都只能凭借临床医生的个人经验进行尝试性治疗。总体上GC在治疗SLE上取得一定疗效，但因患者个体差异的存在，一部分患者对GC反应不敏感，从而会导致SLE的病情恶化。另外，长期服用GC会给患者带来很多不良反应，包括骨质疏松及椎骨压迫性骨折、物质代谢和水盐代谢紊乱(类肾上腺皮质功能亢进综合征等)、诱发或加重感染、消化系统并发症(胃或十二指肠溃疡等)、心血管系统并发症(高血压和动脉粥样硬化等)、神经精神异常(癫痫)、白内障和青光眼等，这些不良反应会对患者的生活质量和存活率产生很大影响。SLE患者对GC疗效的个体差异给SLE的临床合理用药带来了严重困难。

有效、安全和规范的应用GC是SLE治疗中急需解决的问题。药物基因组学(Pharmacogenomics)是功能基因组学研究的一个分支，它是研究基因遗传变异对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应产生影响的现象及其机制，从而指导合理用药的一门学科，它的出现对于实现个体化用药具有重要的意义。药物基因组学主要研究方法是通过检测相关基因的单核苷酸多态性(single neucleotide polymorphism，SNP)来预测药物的疗效和毒性，目的是在找到影响药物作用的遗传差异后，用更加科学的手段给患者开药，即依据患者的基因组特征优化治疗疗方案，减少治疗费用和风险，做到既有效又安全。近年来，发表在国际权威杂志上的研究证据显示药物基因组学的研究成果能够迅速应用到临床治疗中，患者基因型即将成为确定患者个体化治疗的重要依据之一。虽然目前缺乏指导SLE个体化治疗行之有效的方法，但随着药物基因组学的深入发展，SLE个体化治疗在不久的将来将成为可能，即只需要检测患者外周血中与治疗药物相关基因型，即可确定最优的方案，这对SLE个体化治疗来说，具有积极而深远的意义。

GC具有强大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用机制是通过基因调控途径完成，它与细胞浆内的GR相结合，形成GC-GR复合物，进入细胞核，通过直接和间接基因调控机制发挥作用。热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)是热休克蛋白家族中重要一员，是广泛存在于生物界的具有高度保守性的蛋白质，参与众多的细胞生理过程，对维持生命具有重要意义。HSP90是GC-GR效应中的重要伴侣蛋白和关键环节，HSP90在决定GR与GC结合力上具有重要作用，它通过与GR结合形成多聚体，使GR结构活化与GC特异性结合，从而使GC-GR复合物发挥其生物学效应，它的结构和功能的任何变化都会影响GC发挥其生物学效应。

大量研究表明HSP90在SLE患者体内表达增加，和疾病活动度呈正相关，并和过表达的IL-6及HSP90自身抗体的产生相关，HSP90过度表达在SLE的发生发展中具有重要作用。HSP90AB1基因转录增加与Hsp90的表达增加密切相关，HSP90AB1基因变异可能是GC治疗SLE疗效和不良反应存在个体化差异的重要原因之一，多个HSP90AB1基因多态性位点已被发现。当前本领域缺乏基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测GC治疗SLE疗效的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供新的思路和方法。

本发明技术方案是通过以下实现的：

一种基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包含有下述试剂组分：

(1)检测HSP90AB1基因多态性位点基因型的引物；

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)PCR产物纯化酶；

(4)dNTP；

(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；

(6)单碱基延伸产物纯化酶。

所述的HSP90AB1基因多态性位点为rs9367190和rs13296。

所述的检测HSP90AB1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物。

所述的扩增rs9367190多态性位点的引物：

5’-TTCACTGTGCGTGCTGACCA-3’

5’-AAAAGTATATGCAGTTGAGACCAGCAA-3’

所述的扩增rs13296多态性位点的引物：

5’-CTGGCTTTTGCTTTCCCTGGTA-3’

5’-CCGCTGTCATCCTCCTCATCTG-3’

所述的单碱基延伸rs9367190多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTAGCAGAAATTTTGGGCATCCTGT-3’

所述的单碱基延伸rs13296多态性位点的引物：

5’-TTTTTGAACCCACATCTTCGATCTTGGG-3’。

本发明还提供了一种基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法，具体步骤包括：

(1)提取基因组DNA；

(2)PCR扩增反应；

(3)PCR纯化产物；

(4)单碱基延伸反应；

(5)纯化延伸产物；

(6)HSP90AB1基因分型；

(7)预测糖皮质激素治疗SLE疗效。

所述PCR扩增反应包含rs9367190和rs13296两对扩增多态性位点的引物。

所述单碱基延伸反应包含rs9367190和rs13296两条单碱基延伸多态性位点的引物。

所述的HSP90AB1基因分型包含rs9367190和rs13296多态性位点基因型以及rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型。

所述的糖皮质激素包括(但不限于)泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松等。

所述的疗效为经糖皮质激素治疗后SLE患者临床症状是否得到缓解，临床症状得到缓解则疗效好，没有得到缓解则疗效差。同时，疗效也包括SLE患者生活质量的改善情况。

所述的预测为HSP90AB1基因的rs9367190多态性位点基因型为CA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好；rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型为CA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效差；rs13296多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量(心理健康)改善差。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1：一种基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法

(一)试剂盒的组成成分

(1)检测HSP90AB1基因多态性位点基因型的引物；

扩增多态性位点的引物：

延伸多态性位点的引物：

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)PCR产物纯化酶及相应缓冲液；

(4)dNTP；

(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；

(6)单碱基延伸产物纯化酶及相应缓冲液。

(二)标本收集准备和基因型检测

1采集血标本

由专业医护人员从符合1997年美国风湿病学会(ACR)的SLE分类标准确诊的SLE患者前臂采取静脉血5ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。

2提取基因组DNA

使用基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的提取，具体方法如下：

(1)将20μl QIAGEN蛋白酶加入1.5ml离心管后，再加入200μl血样至离心管中，充分混匀。

(2)加入200μl Buffer AL至离心管中，涡旋振荡15s充分混匀，56℃孵育10min，快速离心，保证离心管盖子中无液滴残留。

(3)加入200μl的96-100％乙醇至离心管中，涡旋振荡15s充分混匀，快速离心，保证离心管盖子中无液滴残留。

(4)将样品移至QIAamp Mini离心柱，6000g(8000rpm)离心1min，将离心柱放入一个新的2ml收集管中。

(5)加入500μl Buffer AW1到离心柱中，6000g(8000rpm)离心1min，弃收集管，将离心柱放入一个新的2ml收集管中。

(6)加入500μl Buffer AW2到离心柱中，20000g(14000rpm)离心3min，弃收集管，再将离心柱转移到一个新的2ml收集管，20000g(14000rpm)离心1min，弃收集管。

(7)将离心柱转移到一个1.5ml收集管中，加200μl Buffer AE至离心柱中，室温孵育1min，再6000g(8000rpm)离心1min，洗提DNA。

3基因型检测

(1)DNA质量和浓度评估：DNA样本取1μl 1％agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl。

(2)进行PCR扩增反应

a)扩增多态性位点引物：

扩增rs9367190多态性位点的引物：

5’-TTCACTGTGCGTGCTGACCA-3’

5’-AAAAGTATATGCAGTTGAGACCAGCAA-3’

扩增rs13296多态性位点的引物：

5’-CTGGCTTTTGCTTTCCCTGGTA-3’

5’-CCGCTGTCATCCTCCTCATCTG-3’

b)PCR反应体系：

反应体系(10μl)包含1x HotStarTaq buffer,3.0mM Mg2+,0.3mM dNTP,1U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1μl样本DNA和1μl多重PCR引物。

c)PCR循环程序：

(3)纯化PCR产物

添加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶至10μl PCR产物中，37℃温浴60min，75℃下灭活15min。

(4)单碱基延伸反应

a)延伸引物：

单碱基延伸rs9367190多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTAGCAGAAATTTTGGGCATCCTGT-3’

单碱基延伸s13296多态性位点的引物：

5’-TTTTTGAACCCACATCTTCGATCTTGGG-3’

b)延伸反应条件：

延伸反应体系(10μl)包括5μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μl纯化后多重PCR产物，1μl延伸引物混合物，2μl超纯水。

c)延伸反应程序：

(5)纯化延伸产物

在10μl延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1小时,然后75℃灭活15分钟。

(6)延伸产物上ABI3730XL测序仪

0.5μl纯化后的延伸产物和9μl Hi-Di及0.5μl Liz120SIZE STANDARD混匀成总体积10μl的反应体系，95℃变性5min后，上ABI3730XL测序仪收集数据。

(7)基因分型

ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)来分析，判定rs9367190和rs13296多态性位点基因型。

(三)预测疗效

1判定疗效标准

使用糖皮质激素(泼尼松)治疗活动期SLE患者三个月，观察患者疗效，使用系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)评分来判定糖皮质激素治疗SLE疗效。治疗三个月后患者SLEDAI评分下降为0～4分为病情缓解，疗效好；治疗三个月后患者SLEDAI评分仍大于4分为病情没有缓解，疗效差。另外，生活质量改善情况是评价糖皮质激素治疗SLE疗效的另一个重要指标，因此，采用SF-36量表评价治疗过程中SLE患者生活质量的改善情况。

2基于HSP90AB1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素疗效

254例SLE患者完成了三个月的治疗，使用SLEDAI评分评价发现127例患者疗效好，127例患者疗效差。同时对254例患者的rs9367190和rs13296多态性位点基因型进行分型，Hardy-Weinburg平衡检验分析显示两个多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡，结果见表1。在校正年龄、性别、吸烟、饮酒等混杂因素前后回归分析发现rs9367190多态性位点基因型和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在关联，rs9367190多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效。rs9367190多态性位点基因型为CA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，结果见表2。单倍型分析发现rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型CA和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在关联，rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型CA能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效，单倍型CA预测糖皮质激素治疗SLE的疗效差，结果见表3。同时，结果显示rs13296多态性位点基因型和糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量改善情况之间存在关联，rs13296多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量(心理健康)的改善情况，rs13296多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量(心理健康)改善差，结果见表4。

表1 HSP90AB1基因型和等位基因的分布以及Hardy-Weinburg平衡结果

表2 HSP90AB1基因多态性位点与GC治疗SLE患者疗效的关联

*Logistic回归分析，因变量赋值：疗效好＝0，疗效差＝1

表3 HSP90AB1基因两个多态性组成单倍型与GC治疗SLE患者疗效的关联

表4 HSP90AB1基因rs13296多态性位点与GC治疗SLE患者生活质量改善的关联(显性模型)

(四)结论

从上述结果可以得出：HSP90AB1基因rs9367190多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效，rs9367190多态性位点基因型为CA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好。HSP90AB1基因的rs9367190和rs13296多态性位点组成的单倍型CA能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效，单倍型CA预测糖皮质激素治疗SLE的疗效差。rs13296多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量(心理健康)的改善情况，rs13296多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE患者的生活质量(心理健康)改善差。