一个嵌合型RbcS cTP基因及其表达载体和应用

摘要

本发明公开了一个嵌合型RbcS cTP基因及其表达载体和应用。该基因由拟南芥RbcS cTP的N‑端插入到玉米RbcS cTP的N‑端和中间结构域之间形成，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。玉米RbcS cTP基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。所述的嵌合型RbcS cTP基因能在将外源基因转入到单子叶和/或双子叶植物叶绿体中应用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个嵌合型RbcS cTP基因及其表达载体和应用。

背景技术

叶绿体是绿色植物把光能转化为化学能的重要细胞器，叶绿体只能合成自身需要的一部分蛋白质，许多叶绿体蛋白均是由核基因编码的，它们在细胞质中被翻译成成熟的功能性蛋白或蛋白质前体物，然后再被导入到叶绿体中发挥各自的功能。导肽在这个过程中发挥了十分重要作用。多数叶绿体蛋白质从细胞质运输到叶绿体是由转运肽(transit peptide,TP)的介导来实现的。该转运肽一般位于被转运蛋白的N端。在氨基酸序列一级结构上TP可被分为三个结构域，它们分别是N-端结构域、中间结构域和C-端结构域。在不同物种的同一个结构域之间或者同一物种的不同结构域之间，其序列通常具有高度的可变性，缺少一致序列或共同序列基序。每一个基序在叶绿体蛋白运输的特定过程中都发挥着至关重要的作用。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基(the small subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RbcS)的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,cTP)是研究较为广泛的植物叶绿体导肽之一。

目前，拟南芥RbcS的cTP的结构域和部分基序的功能相对比较清楚，但是在单子叶植物RbcS的cTP中，其结构域和不同基序是如何发挥功能的还不是很清楚，特别是单子叶和双子叶植物的cTP是否具有物种特异性等至今鲜有报道。

本研究首先在启候选动子/增强子验证中筛选出玉米RbcS cTP，利用生物信息学预测转运肽的大小，并克隆玉米RbcS的cTP基因，再采用类似方法克隆出水稻和拟南芥中的同源基因，发现RbcS cTP的叶绿体的靶向功能在单子叶和双子叶植物中具有明显的物种特异性；其次构建了玉米和拟南芥的N-端串联的嵌合型cTP，转化原生质体后GFP信号定位到拟南芥和玉米的叶绿体中。

叶绿体作为一种新型生物反应器，生产药物和某些具有特殊功能的蛋白，具有高效表达、定点整合、安全性好、后代遗传稳定等优点，发展前景非常好。随着植物叶绿体基因工程研究的不断完善，该发明有利将叶绿体作为一种新型高效的生物反应器，将为遗传工程带来新的生机和活力，也将为农业发展带来一场“绿色革命”。

发明内容

本发明的一个目的是提供玉米RbcS cTP基因和嵌合型RbcS cTP基因。

本发明的另一个目的是提供玉米RbcS cTP和嵌合型RbcS cTP的瞬时表达载体。

本发明的又一个目的是提供玉米RbcS cTP和嵌合型RbcS cTP的瞬时表达载体，瞬时表达可用于将外源基因转入到单子叶和双子叶植物叶绿体中。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一个嵌合型RbcS cTP基因，由拟南芥RbcS cTP的N-端插入到玉米RbcS cTP的N-端和中间结构域之间形成，其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的嵌合型RbcS cTP基因编码的转运肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

含有所述的嵌合型RbcS cTP基因的瞬时表达载体。

所述的瞬时表达载体优选以pJIT163-hGFP为原始载体，将所述的嵌合型RbcS cTP插入pJIT163-hGFP的HindIII和BamHI酶切位点间所得。

所述的嵌合型RbcS cTP基因在将外源基因转入到单子叶和/或双子叶植物叶绿体中的应用。

含有所述的嵌合型RbcS cTP基因的瞬时表达载体在将外源基因转入到单子叶和/或双子叶植物叶绿体中的应用。

玉米RbcS cTP基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

含有SEQ ID NO.1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬时表达载体。

所述的瞬时表达载体优选以pJIT163-hGFP为原始载体，将SEQ ID NO.1所示的玉米RbcS cTP基因插入pJIT163-hGFP的HindIII和BamHI酶切位点间所得。

SEQ ID NO.1所示的玉米RbcS cTP基因在将外源基因转入到单子叶和/或双子叶植物叶绿体中的应用。

含有SEQ ID NO.1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬时表达载体在将外源基因转入到单子叶植物叶绿体中的应用。

有益效果：

本发明首次从玉米中克隆得到RbcS cTP基因及其所编码的蛋白质，为玉米中首次报道。将玉米和拟南芥的RbcS cTP插入瞬时表达载体pJIT163-hGFP，转化到玉米、小麦、水稻和拟南芥原生质体中，玉米的RbcS cTP瞬时转化载体的GFP信号可以定位到玉米、小麦或水稻的叶绿体中，不可以定位到拟南芥的叶绿体中；而拟南芥的RbcS cTP瞬时转化载体的GFP信号只可以定位到拟南芥叶绿体中，不可以定位到玉米或水稻的叶绿体中。把拟南芥RbcS cTP的N-端结构域插入到玉米RbcS cTP的N-端和中间结构域中间的嵌合型cTP，转化原生质体后GFP信号可同时定位到拟南芥和玉米的叶绿体中。

附图说明

图1玉米RbcS cTP瞬时表达载体构建示意图。

图2 cTP序列三个结构域划分。

图3 TP-DNTP结构示意图。

图4玉米RbcS cTP在水稻、小麦、拟南芥叶绿体中的亚细胞定位信号。

图5拟南芥RbcScTP在拟南芥和玉米中的亚细胞定位信号。

图6 RbcScTP的N-端串联混合型cTP在玉米和拟南芥中的亚细胞定位信号。

具体实施方式

实施例1克隆RbcScTP基因及载体构建

玉米是单子叶植物，基因组已完成测序。玉米RbcScTP基因是由第一申请人(发明人)张文利根据mDNase-seq(modified DNase-seq)鉴定出DHSs(DNase I hypersensitive sites)，同时结合RNA-seq的分析得到候选启动子/增强子，然后用GFP作为报告基因，利用原生质体转化法从这些候选启动子/增强子中筛选得到。在NCBI上用blast找到拟南芥的同源基因。

首先用引物F1CGATAAGGCGACAAGTGGTG(SEQ ID NO.5)/R1：CTGCATGCACCGGATCCTT(SEQ ID NO.6)和F2：AGTAGTAATGGCTTCCTCTATGC(SEQ ID NO.7)/R2：ACCTTCATGCAGCTAACTCTTC(SEQ ID NO.8)分别从玉米和拟南芥基因组中将RbcScTP基因分别克隆到pMD19-T载体上，测序后用NCBI比对序列。然后用玉米RbcScTP基因引物F3：GCCCTTGCTCACCATGGATCCATGGCGCCCACCGTGATGAT(SEQ ID NO.9)/R3：GCCCTTGCTCACCATGGATCC GGACCGGATCCTTCCGCCGT(SEQ ID NO.10)和拟南芥RbcS cTP基因引物F4：TGGAGAGGACAGCCCAAGCTTATGGCTTCCTCTATGCTCTC(SEQ ID NO.11)/R4：GCCCTTGCTCACCATGGATCCGCAGCTAACTCTTCCCCCGT(SEQ ID NO.12)进行PCR扩增，并用快速克隆试剂盒ClonExpress^TMⅡ(南京诺唯赞公司)把PCR产物连到瞬时表达载体pJIT163-hGFP的HindⅢ和BamHⅠ之间(如图1所示)，测序后用NCBI比对序列，并分别命名为M-TP(maize>

实施例2原生质体提取及转化

原生质体的提取及转化方法主要参照已发表的方法(参考文献：Yang Zhang，Jianbin Su，等，A highly efficient rice green tissue protoplastsystem for transient gene expression andstudying light/chloroplast-related processes，Plant Methods，2011)，并做适当修改，通过该方法提取了玉米、水稻、小麦和拟南芥的原生质体。

步骤：

1)培养正常生长的绿化苗，选取玉米、水稻和小麦生长十天左右的幼苗，拟南三周左右的幼苗，同时纯化转化用的实施例1构建的两种瞬时表达质粒20ul(1ug/ul)。

2)配制酶液10ml，55℃加热10min。

3)用刀片将叶片(玉米、小麦和拟南芥)或茎(水稻)切至0.5-1mm左右，立即浸入酶液中。

4)抽真空30min，在28℃下黑暗中30-50rpm振荡培养4-6h左右。

5)加入等体积W5并摇匀，再通过35μm(200目)尼龙膜过滤酶液，。

6)100g室温离心2min，弃上清，缓慢沿着壁加入4ml W5溶液，轻轻悬浮，然后再进行100g x 2min室温离心。

7)弃去上清，沿管壁加入预冷的MMG溶液4ml，100g x 2min室温离心后弃去上清，重新加入4ml MMG溶液，充分悬浮后冰浴30min。

8)100g室温离心2min来沉淀原生质体，弃去上清，加MMG调整原生质体浓度为1-2×10⁵/ml。

9)取2ml tube,按100μl原生质体加入10μl质粒，轻弹混匀后加入110μl40％PEG，轻弹混匀。室温静置20min。

10)加入1ml W5溶液，混匀清洗，100g x 2min室温离心。

11)取上清，加入500μl W5，轻弹混匀，28℃黑暗过夜培养。

12)第二天，100g，3min室温离心，去上清，留取20-40μl，轻弹混匀后制片观察。

实例3RbcScTP基因定位

培养后的原生质体用激光共聚焦荧光显微镜观察。设定不同的激发波长，利用GFP荧光蛋白发出绿色荧光和叶绿体自发红光区分信号，并进行信号观察。结果显示，玉米和水稻的RbcS cTP瞬时转化载体的GFP信号可以定位到玉米、小麦或水稻的叶绿体中，不可以定位到拟南芥的叶绿体中；而拟南芥的RbcS cTP瞬时转化载体的GFP信号只可以定位到拟南芥叶绿体中，不可以定位到玉米或水稻的叶绿体中。把拟南芥RbcS cTP的N-端结构域插入到玉米RbcS cTP的N-端和中间结构域中间的嵌合型RbcS cTP，转化原生质体后GFP信号定位到拟南芥和玉米的叶绿体中。上述实验说明玉米RbcS cTP能够将外源基因定位到禾本科单子叶植物的叶绿体中，而嵌合型RbcS cTP能够将外源基因定位到双子叶和单子叶植物的叶绿体中。