玉米rbcS基因启动子的改造及其在转基因植物中的初步应用研究

摘要

为获得叶片组织特异性表达强启动子,该实验克隆改造得到四个玉米rbcS基因启动子突变体.在启动子的GC富含区-118定点突变得到T→C的突变体并将其替换pBI121质粒上的35S启动子构建成新的载体pB2;在启动子的-31位置插入了一个八核苷酸片段并将其替换pBI121质粒子的35S启动子构建成新的载体pB8;用rbcS的5'端470bp片段与35S启动子构建470bp+35S组合启动子结构的载体pB20;用GC富含区-118→C点突变得到的突变体的3'端324bp与35S启动子构建324bp+35S双启动子结构载体pB13.另外,还用未经济修饰的rbcS启动子替换了35S启动子构建了载体pB9,作为对照.在烟草原生质体中对改造后的启动子表达强度进行了瞬时表达的检测.测定结果表明pB13的双启动子结构表现出了最大的活性,是rbcS启动子的4倍,是35S启动子的1.4倍.pB20与p2表达强度相关不大,都是rbcS启动子的3倍,是35S启动子的1.2倍.p8没有明显的增强效果,只是rbcS启动子的1.6倍,是35S启动子的0.6倍.启动子突变体转化实验和组织特异性验证等正在进行.

目录

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缩略词

第一章文献综述

1.1启动子研究进展

1.2转基因启动子研究进展

1.3 rbcS研究进展

1.3.1组织特异性rbcS基因及其蛋白概况

1.3.2 rbcS启动子结构研究概况

1.3.3其它组织特异性基因研究进展

1.4启动子研究存在的主要问题

1.5本课题研究目标和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2生化与分子生物学试剂

2.1.3菌株与载体

2.1.4培养基与培养条件

2.2方法

2.2.1玉米总DNA的提取—CTAB法

2.2.2 PCR扩增

2.2.3 PCR产物回收纯化

2.2.4连接

2.2.5感受态细胞的制备

2.2.6连接产物转化大肠杆菌DH5α

2.2.7质粒提取

2.2.8质粒检测及测序

2.2.9突变

2.2.10载体构建

2.2.11载体瞬时表达检测(聚乙二醇介导的烟草叶肉原生质体的转化)

2.2.12农杆菌介导的瞬时表达检测

第三章结果与分析

3.1启动子rbcS的克隆

3.1.1 PCR扩增与连接

3.1.2目的片段的序列测定

3.2突变位点的引入及表达载体的构建

3.2.1突变位点的引入

3.2.2组合启动子的构建

3.2.3载体构建

3.2.4瞬时表达检测

3.2.5启动子广谱性的检测

第四章讨论与结论

4.1讨论

4.1.1启动子强度与结构关系

4.1.2定向启动子与生物安全性的关系

4.1.3启动子克隆中的保真性

4.1.4影响PEG-介导的烟草原生质体瞬时表达的因素

4.1.5对于干扰荧光法测定物质的处理

4.1.6下一步工作

4.2结论

参考文献

致 谢

附录1

附录2序列测定峰图（部分）