一种神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上分化的方法

摘要

一种神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上分化的方法，属于生物科学技术领域。本发明包括如下步骤：20nm粒径的金纳米粒子合成、单层金纳米粒子薄膜的制备和神经细胞的培养与分化诱导。本发明提供了一种细胞选择性分化的手性培养平台，为神经受损导致的相关疾病的治疗提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上分化的方法，属于生物科学技术领域。

背景技术

近20年来，神经母细胞瘤发病的分子机制的研究取得很大进展，治疗方法亦有许多改进，但临床疗效并无多大提高。然而，神经母细胞瘤的自然退化这一奇特现象却吸引着人们关注。神经母细胞瘤被认为是最有希望用以揭示肿瘤逆转自然过程的肿瘤，有助于最终采取措施抑制其恶性进程。

神经母细胞瘤可以自行退化，少数表达N-myc基因的病例在极少或无系统治疗的情况下也可完全消退或分化。因此人们设想诱导神经母细胞瘤分化，逆转其恶性进程可能比直接杀伤肿瘤细胞更合乎自然。体外研究发现，能诱导神经母细胞瘤分化的物质有维甲酸，γ-干扰素，二丁基环磷酸腺苷，苯乙酸钠等，其中研究最多的是维甲酸。维甲酸在预防和治疗癌症方面潜力巨大，在临床使用中耐受良好，个别病例即使对放疗、化疗均无反应，用维甲酸治疗后可长期缓解。

基于神经母细胞瘤的诱导分化的研究，人们做了很多出色的工作。然而，手性界面对神经母细胞瘤的分化影响仍有很大的探索空间。本发明利用单层金纳米粒子薄膜构建左右旋手性界面，揭示了手性界面在诱导神经母细胞瘤分化中所起的重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上分化的方法。

本发明的技术方案，一种神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上分化的方法，步骤为：

（1）神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上的培养：将左旋或右旋手性的金纳米粒子薄膜置于6孔的细胞培养板孔中；用5mL胰酶消化25mL细胞培养瓶中的神经母细胞瘤细胞NG108-15 5min，将胰酶倒掉后，用含20%胎牛血清的1640培养基将细胞吹起；在放有左旋或右旋手性的金纳米粒子薄膜的细胞培养板孔中加含2 × 10⁴个细胞/mL的培养基，置于37℃二氧化碳培养箱中培养；24h后观察细胞形态及密度，左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈长条舒展状态，右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈圆形，且左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞密度大于右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞密度；

（2）神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上的分化：细胞在左旋及右旋手性的金纳米粒子薄膜上分别培养24h后，更换新的培养基，加维甲酸至终浓度为1μM，继续培养2天后，观察细胞形态；左旋及右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞均长出突触；其中，左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈细长型，只两端长出突触，右旋手性的金纳米粒子薄膜上四周均有突触长出。

所述手性单层金纳米粒子薄膜的制备步骤如下：

（1）20nm粒径的金纳米粒子合成及L/D型半胱氨酸修饰：

a、3-4nm金纳米种子的合成：采用硼氢化钠还原法合成；取120mL超纯水，依次加入147μL质量浓度1%柠檬酸三钠和0.5mL 10mM氯金酸，充分混合后，在剧烈搅拌的状态下加入0.6mL新配制的0.1M的硼氢化钠，即得到3-4nm金纳米种子溶液；

b、20nm粒径的金纳米粒子合成：采用种子生长法合成；在195mL超纯水中加入5mL 10mM氯金酸，加热至沸腾，同时加入步骤a制备得到的1.5mL金纳米种子溶液和800μL 1%的柠檬酸三钠，继续煮沸至颜色不变，即得到20nm粒径的金纳米粒子溶液；

将合成好的金纳米粒子溶液9000rpm离心10min，25℃浓缩重悬在原溶液1/10体积的超纯水中，用氢氧化钠调节pH至10，待用；取两份溶液，分别加入L型半胱氨酸及D型半胱氨酸至终浓度为100μg/mL，搅拌过夜，9000rpm离心，去除溶液中多余的半胱氨酸，重悬，得到左旋及右旋手性的金纳米粒子溶液；

（2）金纳米粒子薄膜的制备及转移：将步骤（1）所得修饰好L/D型半胱氨酸的左旋或右旋手性的金纳米粒子溶液倒入小烧杯中，加入5mL正己烷，然后缓慢滴加无水乙醇；滴加过程中，金膜会逐渐浮出在界面上，将金膜转移到聚二甲基硅氧烷PDMS膜上，得到具有左旋或右旋手性的金纳米粒子薄膜，晾干待用。

本发明的有益效果：本发明利用单层金纳米粒子薄膜构建左右旋手性界面，揭示了手性界面在诱导神经母细胞瘤分化中所起的重要作用。

附图说明

图1是本发明中转移到聚二甲基硅氧烷PDMS膜上的金纳米粒子薄膜。

图2-a是左旋金纳米粒子薄膜的紫外可见光吸收光谱。

图2-b是右旋金纳米粒子薄膜的紫外可见光吸收光谱。

图3是本发明中手性金纳米粒子薄膜的圆二色图谱。

图4是NG108-15细胞在金膜上培养24h后的显微镜照片。

图5是加维甲酸诱导2天后手性金纳米粒子薄膜上分化细胞的激光共聚焦照片。

具体实施方式

实施例1

1、手性单层金纳米粒子薄膜的制备

（1）20 nm 粒径的金纳米粒子合成及L/D型半胱氨酸修饰；20 nm 粒径的金纳米粒子采用种子生长法合成。

a、3-4nm金纳米种子的合成：采用硼氢化钠还原法合成；取120mL超纯水，依次加入147μL质量浓度1%柠檬酸三钠和0.5mL 10mM氯金酸，充分混合后，在剧烈搅拌的状态下加入0.6mL新配制的0.1M的硼氢化钠，即得到3-4nm金纳米种子溶液；

b、20nm粒径的金纳米粒子合成：采用种子生长法合成；在195mL超纯水中加入5mL 10mM氯金酸，加热至沸腾，同时加入步骤a制备得到的1.5mL金纳米种子溶液和800μL 1%的柠檬酸三钠，继续煮沸至颜色不变，即得到20nm粒径的金纳米粒子溶液；

将合成好的金纳米粒子溶液9000rpm离心10min，25℃浓缩重悬在原溶液1/10体积的超纯水中，用氢氧化钠调节pH至10，待用；取两份溶液，分别加入L型半胱氨酸及D型半胱氨酸至终浓度为100μg/mL，搅拌过夜，9000rpm离心，去除溶液中多余的半胱氨酸，重悬，得到左旋及右旋手性的金纳米粒子溶液；

（2）金纳米粒子薄膜的制备及转移：将修饰好L/D型半胱氨酸的金纳米粒子溶液倒入小烧杯中，加入5mL 正己烷，然后缓慢滴加无水乙醇。滴加过程中，金膜会逐渐浮出在界面上。金膜可以转移到PDMS膜上，得到具有左旋(L-film)或右旋(D-film)手性的金纳米粒子薄膜晾干待用。

2、神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上的培养：将左旋或右旋手性的金纳米粒子薄膜置于6孔的细胞培养板孔中；用5mL胰酶消化25mL细胞培养瓶中的神经母细胞瘤细胞NG108-15 5min，将胰酶倒掉后，用含20%胎牛血清的1640培养基将细胞吹起；在放有左旋或右旋手性的金纳米粒子薄膜的细胞培养板孔中加含2 × 10⁴个细胞/mL的培养基，置于37℃二氧化碳培养箱中培养；24h后观察细胞形态及密度，左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈长条舒展状态，右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈圆形，且左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞密度大于右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞密度；

3、神经母细胞瘤在手性金纳米粒子薄膜上的分化：细胞在左旋及右旋手性的金纳米粒子薄膜上分别培养24h后，更换新的培养基，加维甲酸至终浓度为1μM，继续培养2天后，观察细胞形态；左旋及右旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞均长出突触；其中，左旋手性的金纳米粒子薄膜上细胞呈细长型，只两端长出突触，右旋手性的金纳米粒子薄膜上四周均有突触长出。