一种基于脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法

摘要

本发明公开了一种基于脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法包括以下步骤：(1)配置不同浓度梯度的碳纳米管‑去离子分散液；(2)将分散液与酿酒酵母混合均匀，得到碳纳米管‑酵母悬浮液；(3)碳纳米管‑酵母悬浮液置于高压脉冲处理室中进行破壁处理，获得破碎的酵母细胞；(4)通过核酸的提取与测定检测酵母细胞破壁效果。在相同的操作条件下，酿酒酵母破壁率比纯脉冲电场或碳纳米管处理有明显提高。本发明过程简单，易操作，可以在短时间到达较好的破壁效果，有利于提高酿酒酵母胞内核酸等营养物质的提取。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母破壁的方法，特指一种基于脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，从而达到提取胞内核酸的目的。

背景技术

在啤酒生产过程中会产生夹带大量酵母，每生产100吨啤酒就有1.5～2.0吨废酵母产生，我国啤酒行业每年可产生的啤酒废酵母达60～80万吨。目前，啤酒废酵母大部分作为肥料、饲料，利用率很低，部分企业把废酵母直接作为废弃物排入啤酒废水，增加了啤酒废水的处理负荷和难度，造成很大的浪费。这些废弃酵母中含有丰富的酵母多糖、核糖核酸、蛋白质等物质，在生物、医药及保健食品中有着重要的应用价值。因此从废酵母中高效充分地提取出各种功能性强的营养物质,制成功能性食品如氨基酸制剂和核酸制剂等是对酿酒酵母综合利用的一个大方向。细胞破壁技术研究对有效提取胞内活性物质具有重要意义。

酿酒酵母细胞壁较厚(100-300nm)，主要由β-D-葡聚糖、α-D甘露聚糖两种多糖及少量的几丁质组成。酵母细胞的细胞壁具有典型的三明治结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间夹有蛋白质分子层。酵母细胞壁由复杂的分枝状聚合物相互交联而成，壁厚，很难破除，必须借助外力才能破坏。目前所报道的关于酵母破壁的方法很多，常用的破壁方法有物理法，如高压匀浆破碎法、超声波破碎法、微波破碎法等；化学法，如酸热法、化学渗透法；生物法，如酶溶细胞破壁法等。近年来，国内陆续采用以上方法开展了酵母破壁的研究，中国专利CN200910229778.9公布了一种利用微生物酶系对啤酒酵母细胞进行破壁裂解的方法；中国专利CN201310675002.6公布了一种红酵母的破壁方法；中国专利CN201510153242.9公布了一种富硒酵母破壁及纳米化的制备方法等。

但综合来看，以上破壁技术存在以下不足之处：

(1)传统的物理破壁法需要消耗较大能量，产生的热降低了胞内物质如蛋白质和核酸的生物活性。

(2)化学处理法易引起营养活性物质变性，后续处理土艺繁琐。

(3)生物破壁法，反应时间长、成本高，不利于工业化生产。

所以有必要寻找一条简单、节能、节约成本的破壁工艺，近年来，脉冲电场破壁法被广泛应用于生物质的提取，脉冲电场利用电穿孔机理在瞬间使细胞破壁，促进活性组分提取。刘铮等在《食品工业科技》第28卷3期(2007)发表了“高压脉冲电场破壁法提取啤酒酵母中蛋白质与核酸”和谢阁等在《食品与发酵工业》第34卷第3期(2008)发表了“利用高压脉冲电场诱导啤酒酵母细胞释放蛋白质与核酸”。采用脉冲电场进行破壁提取生物质，避免了传统提取手段的缺陷。但单一物理场有一定自身的局限性，破壁效果有限。

本项发明提出脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，通过施加外电场的方法，来定向增强碳纳米管对酵母细胞的破壁作用，充分应用脉冲电场电穿孔作用和碳纳米管的电场响应特性,以及二者的相互作用以强化破壁效率，可以大大缩短胞内活性物质的释放时间。经检索，超声脉冲电场与碳纳米管结合起来作用于酵母细胞进行破壁的研究还未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，大幅度提高酵母细胞破壁效率和活性组分提取率。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，包括以下步骤：

(1)配置不同浓度梯度的碳纳米管-去离子水分散液；

(2)将分散液与酿酒酵母混合均匀，得到碳纳米管-酵母悬浮液；

(2-1)酵母的活化处理；

(2-2)不同浓度梯度的碳纳米管处理酵母悬浮液

(3)碳纳米管-酵母悬浮液置于高压脉冲处理室中进行破壁处理；

(4)通过核酸的提取与测定检测酵母细胞破壁效果。

所述不同浓度梯度的碳纳米管-去离子分散液，具体为：取适量碳纳米管，超声均匀分散于去离子水中，超声时间为0.5h，配置成浓度梯度分别为1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L碳纳米管-去离子分散液。

所述的碳纳米管为多壁碳纳米管，纯度>95％，平均直径10-20nm,长度1-10μm。

所述对酵母的活化处理，具体为：将干酵母按1:10～20的比例投放于35～38℃的温水中复水15～20min制成酵母悬浮液。

所述碳纳米管处理酵母悬浮液，具体为：取五只小烧杯，分别加入50mL上述酵母悬浮液，各加入1-5g/L的碳纳米管-去离子分散液30mL，机械搅拌混合均匀，搅拌时间为0.5h，即得碳纳米管-酵母悬浮液。

所述将碳纳米管-酵母悬浮液置于高压脉冲处理室中进行破壁处理，具体为：

将碳纳米管-酵母悬浮液置于高压脉冲处理室中，脉冲波形为指数衰减波、平板电极的距离为10～40cm，脉冲放电电压为10～40kV，频率50～200Hz，脉冲宽度为40～100μs，脉冲数为500～1000次，脉冲处理时间为1～20s。

所述核酸的提取与测定，具体为：不同方法得到的酿酒酵母细胞碎片，以4000～5000r/min的速度离心8～10min，得到的上清液即为核酸提取液，于260nm波长处测定吸光度。核酸量计算公式为：

A₂₆₀为260nm处的紫外吸收值；0.024为浓度1μg/mL的标准核酸溶液的紫外吸收值；V为上清液体积,mL；n为稀释倍数；m为酿酒酵母质量，g。

本发明的有益效果是：

1)在脉冲电场和碳纳米管协同作用下，碳纳米管可以像“纳米针”一样穿透细胞膜，稳定的外加电场可以定向增强碳纳米管对细胞膜破坏作用，充分疏松细胞壁结构，进一步扩大脉冲电场致细胞电穿孔的效果，同时碳纳米管塌缩过程中可以释放巨大的范德华作用能，提高酿酒酵母破壁率，加强胞内物质的释放、扩散、溶解及提取。

2)协同提取速率比纯脉冲电场或碳纳米管处理有明显提高，操作工艺简单、易行，生产成本低，破壁率高。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的基于脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，步骤如下：将1g多壁碳纳米管，超声均匀分散于1000mL去离子水中，超声时间为0.5h，配置成浓度梯度为1g/L碳纳米管-去离子分散液。将1g啤酒干酵母按1:10的比例投放于35℃的温水中复水15min制成酵母悬浮液后，加入30mL 1g/L碳纳米管-去离子分散液，机械搅拌0.5h，获得碳纳米管-酵母悬浮液。将制备的碳纳米管-酵母悬浮液置于两板状铁电极之间的处理室，电极的距离保持在40cm。脉冲放电电压为10kV、频率50Hz、脉冲宽度为40μs、脉冲数为500次、脉冲电场处理时间为1s，即得破碎的酵母细胞，再用离心机以5000r/min的速度离心8min，收集上清液，于260nm波长处测定吸光度。核酸量＝A₂₆₀×V×n/0.024m,式中A₂₆₀为260nm处的紫外吸收值；0.024为浓度1μg/mL的标准核酸溶液的紫外吸收值；V为上清液体积,mL；n为稀释倍数；m为酿酒酵母质量，g。经分析，本实施例酿酒酵母破碎率比单独使用脉冲电场或碳纳米管提高12％和22％。

实施例2：一种脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，步骤如下：将1g多壁碳纳米管，超声均匀分散于500mL去离子水中，超声时间为0.5h，配置成浓度梯度为2g/L碳纳米管-去离子分散液。将1.5g啤酒干酵母按1:15的比例投放于36℃的温水中复水18min制成酵母悬浮液，加入30mL 2g/L碳纳米管-去离子分散液，机械搅拌0.5h，获得碳纳米管-酵母悬浮液。将制备的碳纳米管-酵母悬浮液置于两板状铁电极之间的处理室，平板电极的距离保持在20cm。脉冲放电电压为20kV、频率100Hz、脉冲宽度为60μs、脉冲数为800次、脉冲电场处理时间为10s，即得破碎的酵母细胞，用离心机以4500r/min的速度离9min，收集上清液，于260nm波长处测定吸光度。核酸量＝A₂₆₀×V×n/0.024m,式中A₂₆₀为260nm处的紫外吸收值；0.024为浓度1μg/mL的标准核酸溶液的紫外吸收值；V为上清液体积,mL；n为稀释倍数；m为酿酒酵母质量，g。经分析，本实施例酿酒酵母破碎率比单独使用脉冲电场或碳纳米管提高14％和25％。

实施例3：一种脉冲电场与碳纳米管协同驱动酿酒酵母细胞破壁的方法，步骤如下：将1g多壁碳纳米管，超声均匀分散于200mL去离子水中，超声时间为0.5h，配置成浓度梯度为5g/L碳纳米管-去离子分散液。将2g啤酒干酵母按1:20的比例投放于38℃的温水中复水20min制成酵母悬浮液，加入30mL 1g/L碳纳米管-去离子分散液，机械搅拌0.5h，获得碳纳米管-酵母悬浮液。将制备的碳纳米管-酵母悬浮液置于两板状铁电极之间的处理室，平板电极的距离保持在10cm。脉冲放电电压为40kV、频率200Hz、脉冲宽度为100μs、脉冲数为1000次、脉冲电场处理时间为20s，即得破碎的酵母细胞，用离心机以4000r/min的速度离心10min，收集上清液，于260nm波长处测定吸光度。核酸量＝A₂₆₀×V×n/0.024m,式中A₂₆₀为260nm处的紫外吸收值；0.024为浓度1μg/mL的标准核酸溶液的紫外吸收值；V为上清液体积,mL；n为稀释倍数；m为酿酒酵母质量，g。经分析，本实施例酿酒酵母破碎率比单独使用脉冲电场或碳纳米管提高18％和28％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。