一种检测待测药物对目的细胞的细胞毒性的方法及其专用细胞芯片

摘要

本发明公开了一种检测待测药物对目的细胞的细胞毒性的方法及其专用细胞芯片。本发明所提供的细胞芯片，包括支持介质和附着于所述支持介质上方的琼脂糖凝胶膜；所述琼脂糖凝胶膜上分布有若干个微阱，每个微阱的大小与单个目的细胞的大小相匹配；每个微阱内附着有所述单个目的细胞。实验证明，利用本发明所提供的细胞芯片可检测待测药物对细胞的细胞毒性和/或检测待测药物对细胞的基因损伤和/或检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响和/或筛选对细胞具有效果的高内涵药物。本发明所提供的细胞芯片具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测待测药物对目的细胞的细胞毒性的方法及其专用细胞芯片。

背景技术

随着现代科技的发展，计算机模拟设计、化学合成、生物提取和天然产物提取等领域的技术突飞猛进，使得目标化合物的获取更加快速高效，并在此基础上建立了以来源、结构、作用等不同特点进行分类的各种化合物库，化合物库的样品数量从几百到上百万不等，而快速筛选出有药理活性的化合物或先导化合物，是目前医药行业的研究热点之一。高内涵药物筛选指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测待测药物对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，确定其生物活性和潜在毒性。生物芯片技术飞速发展为生化分析提供了新的研究工具，芯片上微小的试剂消耗量，快速的反应速率，微结构加工的灵活性，是实现高通量生化分析以进行高内涵药物筛选的有利条件，可在极小的单元内实现大量细胞样品信息的采集与分析。芯片技术可代替传统的动物毒理学实验进行早期的毒性筛查和线索发现，其最显著的特点是在毒性线索发现阶段可以给出海量的信息，有助于更深入的毒性机制研究。利用生物芯片技术进行高内涵药物筛选，可在一定程度上克服以往传统研究方法效率低、速度慢的弱点，在同一实验中，可实现各种对于细胞整体生理现象以及单细胞个体的研究。其不仅大大提高了研究效率，降低了研究成本，避免了重复劳动，同时获得了大量的数据信息，在现代药物筛选和毒理学分析领域有巨大的应用潜力。

单细胞作为生命活动的基本单位，其研究对生命科学的发展具有重要的意义。传统的以细胞为对象的生化分析使用大量细胞通过大型仪器来获得相关参数的总体均值，以此来描述细胞的生理活动规律，但基于细胞群体的分析方法，往往不能真实反映细胞个体的生理状态，并且大型仪器造价较高、操作繁琐，需要专门的技术人员进行维护，在实际应用中具有一定局限性。利用单细胞检测分析来发掘群体内细胞个体差异的重要信息，以便更准确的描述细胞的生物特性，将方便人们更深入的获取和解析细胞生命活动过程信息，对细胞基础生物学的研究、疾病的早期诊断、细胞水平的药物筛选都有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛选对目的细胞具有效果的高内涵药物。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于进行单细胞培养的微阵列芯片。

本发明所提供的用于进行单细胞培养的微阵列芯片，可包括支持介质和附着于所述支持介质上方的琼脂糖凝胶膜；所述琼脂糖凝胶膜上分布有若干个微阱，每个微阱的大小与单个目的细胞的大小相匹配。

所述微阵列芯片中，每个所述微阱的直径可为20～50μm(如20μm、25μm、20～25μm、25～50μm)、深度为40～80μm(如40μm或60μm或40～60μm或60～80μm)。

所述微阵列芯片中，所述琼脂糖凝胶膜可用标准熔点琼脂糖水溶液制备的。

所述标准熔点琼脂糖水溶液具体为0.5g/100mL～1.5g/100mL的标准熔点琼脂糖水溶液。

所述微阵列芯片中，各微阱之间无连接。

所述微阵列芯片中，所述支持介质具体可为GelBond Film。

所述微阵列芯片中，所述琼脂糖凝胶膜可为长方体状，长度具体可为1.6cm，宽度具体可为1.6cm、高度约为300μm。所述琼脂糖凝胶膜上可以阵列方式均匀分布6.4×10³个微阱。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种细胞芯片。

本发明所提供的细胞芯片，可包括支持介质和附着于所述支持介质上方的琼脂糖凝胶膜；所述琼脂糖凝胶膜上分布有若干个微阱，每个微阱的大小与单个目的细胞的大小相匹配；每个微阱内附着有所述单个目的细胞。

所述细胞芯片还可包括置于所述琼脂糖凝胶膜上的加样装置和/或置于所述支持介质下的承载装置；所述加样装置上具有若干个通孔，每个通孔作为一个加样孔，每个加样孔对应1×10³～4×10³个所述微阱。

所述加样装置具体可为多孔板。

所述承载装置具体可为玻璃板。

所述细胞芯片中，每个所述微阱的直径可为20～50μm(如20μm、25μm、20～25μm、25～50μm)、深度为40～80μm(如40μm或60μm或40～60μm或60～80μm)。

所述细胞芯片中，所述琼脂糖凝胶膜可用标准熔点琼脂糖水溶液制备的。

所述标准熔点琼脂糖水溶液具体为0.5g/100mL～1.5g/100mL的标准熔点琼脂糖水溶液。

所述细胞芯片中，各微阱之间无连接。

所述细胞芯片中，所述支持介质具体可为GelBond Film。

所述细胞芯片中，所述琼脂糖凝胶膜可为长方体状，长度具体可为1.6cm，宽度具体可为1.6cm、高度约为300μm。所述琼脂糖凝胶膜上可以阵列方式均匀分布6.4 ×10³个微阱。单个微阱的直径具体可为20μm或25μm、深度为40μm。

所述细胞芯片中，所述多孔板具体可为长方体状，长度可为12.5cm、宽度可为8.5cm、高度可为1.5cm。所述多孔板上具体可以阵列方式均匀分布24个通孔，通孔的直径可为15.6mm。所述多孔板上可以阵列方式均匀分布48个通孔，通孔的直径可为10.2mm。所述多孔板上可以阵列方式均匀分布96个通孔，通孔的直径可为4.5mm。

所述细胞芯片中，所述目的细胞具体可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

为解决上述问题，本发明还提供了一种细胞芯片的制备方法。

本发明所提供的细胞芯片的制备方法，依次可包括如下步骤：

(1)取微阵列芯片，用纤连蛋白溶液浸泡；

所述微阵列芯片包括支持介质和附着于所述支持介质上方的琼脂糖凝胶膜；所述琼脂糖凝胶膜上分布有若干个微阱，每个微阱的大小与单个目的细胞的大小相匹配；所述琼脂糖凝胶膜是用标准熔点琼脂糖水溶液制备的；

(2)完成步骤(1)后，将加样装置置于在所述微阵列芯片上方，通过加样孔将所述目的细胞的细胞悬液加入所述微阱中；所述加样装置上具有若干个通孔，每个通孔作为一个加样孔，每个加样孔对应1×10³～4×10³个所述微阱。

上述制备方法中，还可包括如下步骤(3)：完成步骤(2)后，用琼脂糖凝胶覆盖微阱中的细胞；所述琼脂糖凝胶是用低熔点琼脂糖水溶液制备的。

所述步骤(3)中，所述覆盖的厚度具体可为100μm。

所述步骤(3)中，所述琼脂糖凝胶膜可用低熔点琼脂糖水溶液制备的。所述低熔点琼脂糖水溶液具体为0.4g/100mL～0.8g/100mL的低熔点琼脂糖水溶液。

所述步骤(2)具体可为：通过所述加样孔将目的细胞的细胞悬液加入微阱中，静置10min。

所述步骤(2)中，所述目的细胞的细胞悬液的浓度可为1×10⁶～1×10⁸个/mL(如5×10⁶个/mL)。

所述步骤(2)和所述步骤(3)之间还可包括如下步骤(A)：在25℃条件下，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗2次。

所述步骤(2)中，所述目的细胞可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

所述步骤(2)中，所述加样装置具体可为多孔板。所述多孔板具体可为长方形状，长度可为12.5cm、宽度可为8.5cm、厚度可为1.5cm。所述多孔板上具体可以阵列方式均匀分布24个通孔，通孔的直径可为15.6mm。所述多孔板上可以阵列方式均匀分布48个通孔，通孔的直径可为10.2mm。所述多孔板上可以阵列方式均匀分布96个通 孔，通孔的直径可为4.5mm。

所述步骤(1)中，所述纤连蛋白溶液具体可为200μg/mL的纤连蛋白水溶液。

所述步骤(1)中，所述支持介质具体可为GelBond Film。

所述步骤(1)中，所述琼脂糖凝胶膜可用标准熔点琼脂糖水溶液制备的。所述标准熔点琼脂糖水溶液具体为0.5g/100mL～1.5g/100mL的标准熔点琼脂糖水溶液。

所述步骤(1)中，所述琼脂糖凝胶膜可为长方体状，长度具体可为1.6cm，宽度具体可为1.6cm、高度约为300μm。所述琼脂糖凝胶膜上可以阵列方式均匀分布6.4×10³个微阱。

所述步骤(1)中，每个所述微阱的直径可为20～50μm(如20μm、25μm、20～25μm、25～50μm)、深度为40～80μm(如40μm或60μm或40～60μm或60～80μm)。

所述步骤(1)中，所述微阵列芯片的制备过程中，需在模具中加入增加模具的疏水性的物质，处理一定时间。所述增加模具的疏水性的物质具体可为三氯(1H，1H，2H，2H-全氟辛基)硅烷。所述处理一定时间具体可为真空处理，处理时间为2h～4h(如3h)，处理温度为75～90℃(如85℃)。

按照所述细胞芯片的制备方法制备的细胞芯片也属于本发明的保护范围。

上述任一所述微阵列芯片或上述任一所述细胞芯片在d1)或d2)或d3)或d4)中的应用也属于本发明的保护范围；

d1)检测待测药物对细胞的细胞毒性；

d2)检测待测药物对细胞的基因损伤；

d3)检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响；

d4)筛选对细胞具有效果的高内涵药物。

上述应用中，所述细胞可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

上述应用中，所述待测药物可为尼莫司汀或博来霉素。

为解决上述问题，本发明还提供了一种检测待测药物对目的细胞的细胞毒性的方法。

本发明所提供的检测待测药物对细胞的细胞毒性的方法，依次包括如下步骤：

a1)取上述任一所述的细胞芯片，在不同微阱中加入体积相等但含有不同浓度待测药物的液相，处理一定时间；

a2)完成步骤a2)后，在所述微阱中然后加入染料，染色，观察并统计细胞存活率，从而获知所述待测药物对所述细胞的细胞毒性。

所述a1)中，所述待测药物可为尼莫司汀或博来霉素。

所述a1)中，所述处理一定时间具体可为处理6h或处理3h。

所述细胞可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

为解决上述问题，本发明还提供了一种检测待测药物对细胞的基因损伤的方法。

本发明所提供的检测待测药物对细胞的基因损伤的方法，包括所述a1)、所述a2)和a3)；

所述a3)为：完成步骤a2)后，将所述微阱中的所述细胞进行单细胞凝胶电泳，从而获知所述待测药物对所述细胞的基因损伤。

所述a3)中，所述染料具体可为GelRed。

所述a3)中，所述进行单细胞凝胶电泳之前还需经过所述细胞裂解、解旋等步骤。

所述a3)中，所述统计数据可采用彗星图像处理软件。

所述细胞可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响的方法。

本发明所提供的检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响的方法，依次包括如下步骤：

b1)取上述任一所述细胞芯片，在不同微阱中加入体积相等但含有不同浓度待测药物的液相，处理一定时间；

b2)完成步骤b1)后，在所述微阱中加入抗目的蛋白的抗体为一抗，进行免疫荧光检测。

所述b1)中，所述待测药物可为尼莫司汀。

所述b1)中，所述处理一定时间具体可为处理6h或处理12h。

所述b2)中，所述目的蛋白具体可为γH2AX蛋白。

所述b2)中，进行免疫荧光检测之前还可进行步骤b3)：在所述微阱中加入二抗，染色。所述染色使用的染液可为Hochest33258工作液。

所述细胞可为人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763或人肺癌细胞A549。

实验证明，利用本发明所提供的细胞芯片可检测待测药物对细胞的细胞毒性和/或检测待测药物对细胞的基因损伤和/或检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响和/或筛选对细胞具有效果的高内涵药物。本发明所提供的细胞芯片具有重要的应用价值。本发明提供的方法具有如下优点：

一是本发明提供的方法可用于各种先导化合物的筛选和优化等过程，例如新药研发中常通过合成小分子有机化合物库来优化先导化合物，可通过本发明提供的方法对其细胞毒性和基因损伤进行快速检测，确定先导化合物的活性和毒性作用，代替传统方法的多次重复性的细胞毒性与基因损伤的单独检测，从而在一次试验中完成药物毒 性分析测试而获得大量有效信息，为不同种类先导化合物毒性相关研究提供实验依据。

二是本发明提供的方法可用于药物活性分析，针对药物作用靶点、作用方式以及不同种类药物的药代动力学活性检测提供依据，从而确定药物的用药浓度。

三是本发明所提供的细胞芯片为研究单细胞的生物特性提供了有效途径，该细胞芯片可通过设计不同尺寸的微阱，对不同种类细胞进行单细胞捕获及三维培养，结合各种单细胞分析技术，可使人们更深入的获取和解析细胞内部生命活动过程的信息，对细胞基础生物学的研究、疾病的早期诊断和从单细胞水平进行药物代谢相关的各项研究具有重要意义。

四是本发明所提供的细胞芯片还可用于免疫荧光原位检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响。分析手段简便快速，避免了传统方法中细胞重叠、难以统计等问题，简化了操作以及数据分析步骤，对于单细胞之间基因和蛋白表达差异的相关研究提供了理想的分析平台。

同时，本发明所提供的细胞芯片与传统单细胞凝胶电泳技术的结合可有效解决传统方法中存在的例如无效图形较多、细胞重叠、需多次调焦以获取单细胞图像等诸多问题，大大提高了检测通量和数据准确度，且具有操作简便、数据稳定可靠和结果重现性好等众多优势。而且，本发明所提供的细胞芯片还可结合免疫荧光技术用于分析细胞群体或单个细胞中特定基因或蛋白的表达分析，在高通量生化分析以及药物筛选方面表现出巨大的应用潜力，为细胞毒理学、环境污染检测和生态病理学等领域的单细胞相关研究提供了有力工具。

附图说明

图1为制作细胞芯片的示意图。

图2为SF767细胞芯片培养24h后的荧光图像。

图3为检测待测药物的细胞毒性和基因损伤的流程图。

图4为检测不同浓度尼莫司汀处理后的细胞毒性和基因损伤。

图5为免疫荧光原位检测单细胞中蛋白的表达情况的流程图。

图6为免疫荧光原位检测单个SF767细胞中γH2AX蛋白的表达。

图7为检测不同浓度尼莫司汀处理后的细胞毒性和基因损伤。

图8为免疫荧光原位检测单个SF767细胞中γH2AX蛋白的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

人脑胶质瘤细胞SF767、人脑胶质瘤细胞SF763和人肺癌细胞A549均为中国医学科学院协和细胞资源中心的产品。在下文中，人脑胶质瘤细胞SF767简称SF767细胞，人脑胶质瘤细胞SF763简称SF763细胞，人肺癌细胞A549简称A549细胞。

硅片为北京化工厂的产品。SU-8 2050负性光刻胶为MicroChem公司产品，产品目录号为15040268。SU-8显影液为MicroChem公司产品，产品目录号为15030226。三氯(1H，1H，2H，2H-全氟辛基)硅烷为Sigma公司产品，产品目录号为448931。标准熔点琼脂糖为Biowest公司产品，产品目录号为111860。GelBond Film为Lonza公司产品，也可称为GelBond凝胶支持膜，用途为支撑琼脂糖凝胶。纤连蛋白为Corning公司产品，产品目录号为354008。低熔点琼脂糖为HydraGene公司产品，产品目录号为15120601。尼莫司汀为梯希爱公司产品，产品目录号为N0821。GelRed为Biotium公司产品，产品目录号为13G0307。胰酶、胎牛血清、Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100×)、MEM培养基和pH7.4、0.01M PBS缓冲液均为Gibco公司产品，产品目录号依次为25200072、16000069、10378016、11095072和10010049。铬板玻璃为深圳清溢光电股份有限公司产品。封闭用正常羊血清和羊抗鼠FITC IgG均为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品，产品目录号分别为ZLI-9022和ZF0315。Hochest33258为Sigma公司产品，产品目录号为94403。博来霉素为百灵威公司产品，产品目录号为BIZ0413。鼠抗γH2AX为millipore公司产品，产品目录号为05-636-I。抗荧光淬灭封片剂为碧云天公司产品，产品目录号为P0126。

裂解液的溶质及其浓度为1％(体积百分比)TritonX-100，10％(体积百分比)DMSO，2.5M NaCl，100mM EDTA，10mM Tris和1％(质量体积比)肌氨酸钠；溶剂为水；pH值为10.0。

电泳液的溶质及其浓度0.3M NaOH和1mM Na₂EDTA；溶剂为水；pH值为13.0。

MEM抗性培养基：含10％(体积百分比)胎牛血清和1％(体积百分比)Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100×)的MEM培养基。

SF767细胞悬浮液：将处于对数生长期的SF767细胞用胰酶消化，用MEM抗性培养基终止消化，1000rpm离心，向沉淀中加入MEM培养基得到SF767细胞悬浮液，SF767细胞悬浮液中SF767细胞的浓度为5×10⁶个/mL。

实施例1、SF767细胞芯片的制作

制作SF767细胞芯片的过程详见图1。

1、制作掩膜：使用AotoCAD2010绘图软件设计制作SF767细胞芯片的图形，将设计图形转为图形文件，使用高分辨率打印机(≥1200dip)将图形文件打印在铬板玻璃上，此铬板玻璃即为掩膜。

2、光刻：完成步骤1后，依次使用浓硫酸和过氧化氢混合溶液(由浓硫酸和过氧化氢按体积比为3:1混合得到)、丙酮和乙醇清洗硅片，用气枪吹干，然后将SU-8 2050负性光刻胶涂在硅片上，然后进行前烘(作用是使SU-8 2050负性光刻胶内的溶剂挥发充分，干燥的胶体更能增加与硅片的黏附性以及胶膜的耐磨性)，然后将涂有光刻胶的硅片与步骤1制备的掩膜放置于光刻机中在紫外照射下曝光50秒，之后进行后烘，利用SU-8显影液显影，除去固化的胶后得到模具。

3、修饰：完成步骤2后，取所述模具，置于干燥器，加入20μL三氯(1H，1H，2H，2H-全氟辛基)硅烷，抽真空，放置3h。进行步骤3的目的为增加模具的疏水性。

4、固化：完成步骤3后，取所述模具，浇注熔化的1％(质量体积比)标准熔点琼脂糖水溶液(约85℃)，并加盖GelBond Film，室温冷却至25℃；然后将GelBond Film从模具上剥离下来，即为微阵列芯片。

微阵列芯片包括GelBond Film(起支持介质的作用)和附着于其上方的琼脂糖凝胶膜。琼脂糖凝胶膜是用1％(1g/100mL)标准熔点琼脂糖水溶液制备的。琼脂糖凝胶膜为正方体状，长度1.6cm、宽度为1.6cm、高度为300μm。琼脂糖凝胶膜上以阵列方式均匀分布6.4×10³个微阱，单个微阱的直径为20μm、深度为40μm。

5、纤连蛋白处理：完成步骤4后，取所述微阵列芯片，置于玻璃板(目的为承载微阵列芯片，使其保持平面状态，避免弯折)上，加入2mL浓度为200μg/mL的纤连蛋白水溶液，浸泡处理30min。进行步骤5的目的为使纤连蛋白进入凝胶孔隙中，促进后续步骤7中载入的单细胞在琼脂糖凝胶表面的粘附和生长增殖。

6、装置搭建：完成步骤5后，在所述微阵列芯片上方加盖具有若干通孔的24孔板(24孔板上以6×4陈列的形式分布24个通孔，每个通孔的直径为15.6mm，每个通孔下方对应约4×10³个微阱)，得到芯片装置。

芯片装置为三层结构，最上层为多孔板，最下层为玻璃板，微阵列芯片被固定于玻璃板和多孔培养板之间。

7、单细胞载入及固定：完成步骤6后，取所述芯片装置，将SF767细胞悬浮液加入多孔培养板的每个通孔中(经由通孔进入微阱)，静置10min；然后在25℃条件下，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗2次；最后用熔化的0.6％(0.6g/100mL)低熔点琼脂糖水溶液(约40℃)覆盖(覆盖的目的为固定SF767细胞，使其形成单细胞阵列)，覆盖的厚度约为100μm，得到SF767细胞芯片。

将SF767细胞芯片置于每孔装有2mL MEM抗性培养基的6孔板中三维培养24h，然后进行细胞活死双染，在荧光显微镜下观察荧光图像并统计存活率。存活率＝活细胞数目/活细胞和死细胞的总数目×100％。

细胞活死双染的方法具体参考J Michael B,Shu H,Wonjoong H,et al. Internalization of carbon black and maghemite iron oxide nanoparticle mixtures leads to oxidant production.Chemical Research in Toxicology，2010，23(12)：1874-82.

实验结果见图2，结果表明，SF767细胞芯片的SF767细胞载入率可达90％以上，且细胞生长状态良好。

实施例2、应用SF767细胞芯片检测待测药物的细胞毒性和基因损伤

应用SF767细胞芯片检测待测药物的细胞毒性和基因损伤的流程图如图3所示。

待测药物为烷化剂类抗肿瘤药物尼莫司汀(Nimustine，ACNU)，其可导致DNA股间交联，使DNA的复制转录受阻而诱导细胞凋亡。实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用MEM抗性培养基溶解并稀释尼莫司汀，配制成300mg/mL的尼莫司汀母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后储存于-20℃。使用时用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释尼莫司汀母液，获得尼莫司汀浓度为0.05mM的工作液1、尼莫司汀浓度为0.2mM的工作液2、尼莫司汀浓度为1mM的工作液3和尼莫司汀浓度为2mM的工作液4。

2、取实施例1制备的SF767细胞芯片，分别置于每孔装有2mL MEM抗性培养基的6孔板中三维培养24h；然后弃培养基，向第一个孔中加入2mL MEM培养基(作为空白对照)、向第二个孔中加入2mL工作液1、向第三个孔中加入2mL工作液2、向第四个孔中加入2mL工作液3、向第五个孔中加入工作液4，室温处理6h。

3、完成步骤2后，将各孔的SF767细胞进行细胞活死双染，20min后在荧光显微镜下观察细胞存活情况，并统计存活率。存活率＝活细胞数目/活细胞和死细胞的总数目×100％。

4、完成步骤3后，将各孔的SF767细胞先用200μm H₂O₂水溶液处理10min，再置于裂解液中裂解12h，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗去表面的裂解液，置于电泳液中解旋20min，然后进行单细胞凝胶电泳(电泳时间为30min)，用GelRed工作液(用去离子水稀释GelRed至3000倍体积得到)进行染色并置于荧光显微镜下进行图片采集，并利用彗星图像处理软件对所得数据进行统计分析。

SF767细胞芯片检测尼莫司汀的细胞毒性的实验结果见图4中(A)，SF767细胞芯片检测尼莫司汀的基因损伤的实验结果见图4中(B)。结果表明，随着尼莫司汀浓度的增加，存活率下降，即细胞毒性增强；在基因损伤检测实验中，空白对照中彗星尾部DNA含量达到90％，随着尼莫司汀浓度的增加，头部DNA含量逐步增多，趋向于形成圆形明亮荧光团，表明有DNA交联物形成，且与尼莫司汀浓度具有正相关性。

实施例3、应用SF767细胞芯片免疫荧光原位检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响

应用SF767细胞芯片免疫荧光原位检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响的流程图如图5所示。待测药物为烷化剂类抗肿瘤药物尼莫司汀，其可导致DNA股间交联，使DNA的复制转录受阻而诱导细胞凋亡。实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用MEM抗性培养基溶解并稀释尼莫司汀，配制成300mg/mL的尼莫司汀母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后储存于-20℃。使用时用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释尼莫司汀母液，获得尼莫司汀浓度为0.05mM的工作液1、尼莫司汀浓度为0.2mM的工作液2、尼莫司汀浓度为1mM的工作液3和尼莫司汀浓度为2mM的工作液4。

2、取实施例1制备的SF767细胞芯片，分别置于每孔装有2mL MEM抗性培养基的6孔板中三维培养24h；然后弃培养基，向第一个孔中加入2mL MEM培养基(作为空白对照)、向第二个孔中加入2mL工作液1、向第三个孔中加入2mL工作液2、向第四个孔中加入2mL工作液3、向第五个孔中加入工作液4，室温处理6h。

3、完成步骤2后，向各孔加入4％(质量体积比)的多聚甲醛水溶液，固定10min，弃多聚甲醛水溶液，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗。

4、完成步骤3后，向各孔加入0.2％(体积百分比)Triton-X100，在4℃条件下破膜10min，然后用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗。

5、完成步骤4后，向各孔加入封闭用正常羊血清，室温封闭1h。

6、完成步骤5后，向各孔加入鼠抗γH2AX一抗工作液(用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液将鼠抗γH2AX稀释至1000倍体积得到)，4℃放置18h，然后用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗。

7、完成步骤6后，向各孔加入羊抗鼠FITC IgG二抗工作液(用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液将羊抗鼠FITC IgG稀释至500倍体积得到)，室温避光孵育1h，然后用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗。

8、完成步骤7后，向各孔加入Hochest33258工作液(用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液将Hochest稀释至1000倍体积得到)，室温染色10min，然后用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液冲洗。最后加入抗荧光淬灭封片剂，置于共聚焦荧光显微镜下观察，进行单个SF767细胞中γH2AX蛋白表达分析。

实验结果见图6中A(Nucleus为细胞核染色，用于对总体细胞数目进行定量；γH2AX为γH2AX焦点表达的细胞，Color Combine为Nucleus和γH2AX的叠加)。结果表明，随着尼莫司汀浓度的增加，γH2AX焦点的表达数目增加，表明细胞内双链断裂增多，且随药物浓度增加，有γH2AX焦点表达的细胞数量也增加，表明药物的基因毒性作用增强。同时，在SF767细胞芯片上可对特定位置的单个细胞进行γH2AX表达分析，以阐明不同状态细胞的药物响应情况。

实施例4、应用A549细胞芯片检测待测药物的细胞毒性和基因损伤

一、A549细胞芯片的制备

按照实施例1的方法，仅将SF767细胞替换为A549细胞，微阱直径为20μm替换为微阱直径为25μm，其它步骤均不变，得到A549细胞芯片。

二、应用A549细胞芯片检测待测药物的细胞毒性和基因损伤

待测药物为博来霉素(Bleomycin，BLM)，其为可导致DNA断裂的抗肿瘤药物。

按照实施例2的方法，仅将SF767细胞替换为A549细胞，尼莫司汀替换为博来霉素，“SF767细胞芯片”替换为步骤一制备的“A549细胞芯片”，室温处理6h替换为室温处理3h，步骤4中“将各孔的SF767细胞先用200μm H₂O₂水溶液处理10min，然后置于裂解液中裂解12h”替换为“将各孔的A549细胞置于裂解液中裂解12h”，其它步骤均不变，得到应用A549细胞芯片检测博来霉素的细胞毒性和基因损伤。

A549细胞芯片检测博来霉素的细胞毒性的实验结果见图7中(A)，A549细胞芯片检测博来霉素的基因损伤的实验结果见图7中(B)。结果表明，随着博来霉素浓度的增加，存活率下降，即细胞毒性增强；在基因损伤检测的实验中，空白对照中为圆形荧光团，随着博来霉素浓度的增加，DNA碎片增多，表明有DNA单链断裂形成，且与博来霉素浓度具有正相关性。

实施例5、应用SF763细胞芯片免疫荧光原位检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响

一、SF763细胞芯片的制备

按照实施例1的方法，仅将SF767细胞替换为SF763细胞，其它步骤均不变，得到SF763细胞芯片。

二、应用SF763细胞芯片免疫荧光原位检测待测药物对细胞中目的蛋白表达的影响

待测药物为烷化剂类抗肿瘤药物尼莫司汀，其可导致DNA股间交联，使DNA的复制转录受阻而诱导细胞凋亡。

按照实施例3的方法，仅将SF767细胞替换为SF763细胞，“SF767细胞芯片”替换为步骤一制备的“SF763细胞芯片”，室温处理6h替换为室温处理12h，其它步骤均不变，得到单个SF763细胞中γH2AX蛋白表达分析。

实验结果见图8(Nucleus为细胞核染色，用于对总体细胞数目进行定量；γH2AX为γH2AX焦点表达的细胞，Color Combine为Nucleus和γH2AX的叠加)。结果表明，随着尼莫司汀浓度的增加，γH2AX焦点的表达数目增加，表明细胞内双链断裂增多，且随药物浓度增加，有γH2AX焦点表达的细胞数量也增加，表明药物的基因毒性作用增强。同时，在SF763细胞芯片上可对特定位置的单个细胞进行γH2AX表达分析，以阐明不同状态细胞的药物响应情况。