一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法

摘要

本发明涉及一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法。本发明蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的测定方法包括：样品制备；样品前处理；有机溶剂提取；固相萃取小柱去除色素杂质，氮气吹至近干，以流动相溶解残渣，溶液经滤膜过滤供HPLC分析；标准溶液的配制；高效液相色谱仪测定等过程。本发明的方法，操作简单，快速，自动化程度高，萃取效率快，回收率和重复性好，可实现蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的同时测定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蔬菜、水果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的测定方法，具体涉及一种蔬果中2种农药残留测定的高效液相色谱方法，属于农药残留的理化检测技术领域。

背景技术

近年来，温室大棚等保护地蔬果种植面积迅速增加，重茬、连作导致农产品中病虫害加重，各地在防治蔬果病虫害中，大量和连续地使用烯酰吗啉、赤霉素等农药，使得农产品中病虫对化学农药产生了普遍的抗药性，菜农只能加大农药的使用量。由此，农药使用和依赖程度呈现出恶性循环状态，使得农产品中农药残留量超标问题日益突出。

食用农药残留超标的蔬菜与水果，会直接危及人体的神经系统和肝脏、肾脏等重要器官，残留农药在人体内蓄积过一定限度后会导致一些慢性疾病，如癌症、动脉硬化、心血管病、胎儿畸形、死胎、早夭、早衰等疾病。农药残留不但对人体健康造成极大的危害，同时也严重污染人类生存环境，造成空气、土壤、河流等污染，并在环境中不断积累起来，造成动植物中毒，破坏了生态平衡。

烯酰吗啉是一种肉桂酸衍生物，对藻状菌的霜霉和疫霉属真菌有独特的作用方式；赤霉素是一种高效能的广普性植物生长促进物质，有诱导无子果实的形成、提高座果率、改善果实品质、防止落花落果、促进果实早熟、延迟果树花期、增加果品贮藏能力和打破休眠的调控作用。生产中，二者广泛应用于葡萄、苹果、西红柿、马铃薯、黄瓜、白菜等作物。

目前，国内尚无烯酰吗啉与赤霉素同时测定的液相色谱分析方法，文献报道主要有气相色谱法、气-质联用法、液-质联用法测定其中一种农药，还未报道通过高效液相色谱法同时测定蔬果中的烯酰吗啉与赤霉素。已报道的国外文献中，利用气相色谱-质谱联用法(GC/MS)检测啤酒和干啤酒花中烯酰吗啉残留，但尚未用于蔬菜水果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单，快速，自动化程度高，萃取效率高，回收率和重复性好的，同时测定蔬果中烯酰吗啉与赤霉素农药残留量的方法。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，包括如下步骤：

（1）样品制备：将蔬果样品绞碎、匀浆，冷冻保存，得冷冻样品；

（2）样品前处理：称取10g冷冻样品，精确到0.01g，置于50mL离心管中，加入10 mL 80%甲醇水混匀，涡旋，2 min；振荡，10 min；4℃，8000 r/min离心，提取上清液；再加入10 mL 80%甲醇水，涡旋，2 min；振荡，10 min；4℃，8000 r/min离心，提取上清液；合并两次提取液，浓缩至4 mL，得浓缩液；用2 mol/L盐酸调节上述4 mL浓缩液的pH至2.5，加入15mL乙酸乙酯，涡旋，2min；振荡，10min；4℃，8000 r/min离心，提取有机相；再加入15 mL乙酸乙酯，涡旋，2min；振荡，10min；4℃，8000 r/min离心，提取有机相；合并两次有机相提取液；将两次有机相提取液在45℃，旋转、浓缩至近干，加入2.0mL正己烷溶解残渣，净化，得待净化溶液；将酸性氧化铝柱依次用5mL的丙酮+正己烷混合液、5mL正己烷预淋洗、条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL的丙酮+正己烷混合液冲洗烧杯后，洗脱酸性氧化铝柱，并重复一次；将盛有10mL洗脱液的刻度离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50℃条件下，氮气吹干，用超纯水定容至1.0mL，在旋涡混合器上混匀，经0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱测定；

（3）标准溶液的配制：混合标准工作液用乙腈稀释，配制成具有系列梯度浓度的混合标准工作液，以超纯水定容；

（4）高效液相色谱仪测定：将工作液注入配有紫外检测器的高效液相色谱仪器中，进行高效液相色谱测定；高效液相色谱测定条件如下：C18柱，150 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：甲醇+水+乙酸水溶液（pH=4.0）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：20 μL；紫外吸收波长：252 nm；

（5）残留量测定结果的计算：以保留时间对烯酰吗啉、赤霉素两种农药进行定性分析，以峰面积进行两种农药的定量分析，用外标法计算结果。

优选的，所述蔬果样品为西红柿或西瓜。

所述丙酮+正己烷混合液中丙酮和正己烷的体积比为1:9。

步骤（2）所述乙酸乙酯在使用前用超纯水饱和。

步骤（2）所述酸性氧化铝柱是以酸性氧化铝粉末为固相萃取填料的色谱柱，色谱柱中酸性氧化铝粉末的加入量为每克样品加入1克酸性氧化铝粉末；所述酸性氧化铝粉末在使用前，于马弗炉内400℃下烘干。

步骤（3）所述混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/mL。

优选的，所述步骤（1）冷冻保存温度为-18℃。

进一步的，步骤（2）所述加入80%甲醇水的体积为每克样品加入2.0 mL。

本发明的蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定方法应用于检测西瓜、西红柿中的农药残留量。尤其是用于同时检测西瓜、西红柿中烯酰吗啉与赤霉素残留量。

步骤（3）所述混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/mL；

所采用的HPLC条件为：色谱柱：C18柱，150 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：甲醇（A）+水（B）+乙酸水溶液（pH=4.0，C)；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：20 μL；紫外吸收波长：252nm。

优选的，所述流动相梯度及时间如表1所示。

表1 流动相梯度及时间

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本发明的有益效果是：用本方法检测蔬果农药残留量，处理操作简单，快速，自动化程度高，萃取效率高，是一种回收率和重复性好的测定蔬果农药残留量的方法；本发明方法可同时测定蔬果中烯酰吗啉与赤霉素农药残留量。

附图说明

图1：烯酰吗啉与赤霉素2种农药的标准液相色谱图（浓度为0.1 μg/mL），图中1-3依次为烯酰吗啉 、烯酰吗啉、赤霉素。

图2：西瓜样品空白谱图。

图3：西瓜样品加标谱图（浓度为0.5 μg/mL）。

图4：西红柿样品空白谱图。

图5：西红柿样品加标谱图（浓度为0.5 μg/mL）。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1 采用本发明的方法，按如下步骤分别测定5个西瓜与西红柿样品中的烯酰吗啉与赤霉素残留量：

（1）样品制备：将5个西瓜与5个西红柿分别绞碎匀浆，-18℃条件下冷冻保存，得冷冻样品；

（2）样品前处理：称取10g冷冻样品，精确到0.01g，置于50mL离心管中，加入10 mL 80%甲醇水混匀，涡旋，2 min；振荡，10 min；4℃，8000 r/min离心，提取上清液，得提取液 80%甲醇水10 mL；再加入10 mL 80%甲醇水，涡旋，2 min；振荡，10 min；4℃，8000 r/min离心，提取上清液，得提取液80%甲醇水10 mL；合并两次提取液，浓缩至4 mL；用2 mol/L盐酸调节上述4 mL浓缩液pH至2.5，加入15mL乙酸乙酯，涡旋，2min；振荡，10min；4℃，8000 r/min离心，提取有机相；再加入15 mL乙酸乙酯，涡旋，2min；振荡，10min；4℃，8000 r/min离心，提取有机相；合并两次有机相提取液；将两次有机相提取液30 mL乙酸乙酯在45℃，旋转、浓缩至近干，加入2.0mL正己烷溶解残渣，净化，得待净化溶液；将酸性氧化铝柱依次用5mL的丙酮+正己烷（体积比为10:90）混合液、5mL正己烷预淋洗、条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL的丙酮+正己烷（体积比为10:90）混合液冲洗烧杯后，洗脱酸性氧化铝柱，并重复一次；将盛有10mL洗脱液的丙酮+正己烷（体积比为10:90）刻度离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50℃条件下，氮气吹干，用超纯水定容至1.0mL，在旋涡混合器上混匀，经0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱测定；

（3）标准溶液的配制：混合标准工作液用乙腈稀释，超纯水定容；

（4）高效液相色谱测定：配制不同浓度的混合标准工作液，注入配有紫外检测器的高效液相色谱中，混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/mL；采用的HPLC条件如下：色谱柱：C18柱，150 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：甲醇（A）+水（B）+乙酸水溶液（pH=4.0，C）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：20 μL；紫外吸收波长：252nm；流动相梯度及时间如表1所示；

（5）残留量测定结果的计算：残留量测定结果的计算：以保留时间对烯酰吗啉与赤霉素两种农药进行定性分析，以峰面积进行烯酰吗啉与赤霉素两种农药的定量分析，用外标法计算结果，结果在1个西瓜样品、2个西红柿样品中检测到农药，结果见表2。

表2菠菜样品中残留农药的含量

重复性和回收率的测定：分别采用阴性西瓜样品与阴性西红柿样品（所述阴性指在样品中2种农药均无检出）进行测定，以3倍信噪比确定分析物的检测限，以10倍信噪比确定分析物的定量限，结合回收率和样品量，方法的定量检出限为10-30ug/kg，采用样品中添加标准溶液的方法，在同样的样品处理下对两种农药进行加标回收率实验，结果见表3。

表3 西瓜中2种农药进行加标回收率及标准偏差（n=5）

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表4高效液相色谱仪测定蔬果样品中2种目标化合物的线性及检出限（n=5）

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以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非是对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。