HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法

摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法。所述方法中采用的色谱柱是以表面化学键合β‑环糊精的硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行洗脱，进入检测器进行检测；所述的流动相A为无机盐缓冲体系，所述的流动相B为有机溶剂。该方法为反相高效液相色谱法，可同时实现盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分离和检测，且有优良的分离性能和耐久性，简便可行，重现性好，高效快速，显著缩短了分析时间，拖尾因子和理论踏板数均能达到非常好的效果，可以有效测定盐酸左西替利嗪中对映异构体的含量，专属性强。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法。

背景技术

盐酸左西替利嗪(Levocetirizine Hydrochloride)于2001年2月上市，为第三代抗组胺药，是第二代抗组胺药西替利嗪的单一光学异构体(西替利嗪TP-异构体)，由UCB公司研发，为选择性组胺Hl受体拮抗剂，无明显抗胆碱和抗5-羟色胺的作用，中枢抑制作用较小，主要用于治疗呼吸系统、皮肤和眼睛等处的过敏性疾病，如过敏性鼻结膜炎、过敏性皮肤病、过敏性哮喘等，具有作用起效快、效应强而持久和副作用少的优点。

盐酸左西替利嗪适用人群广泛，可用于儿童与妊娠期和哺乳期妇女，安全、可靠、临床效果显著。盐酸左西替利嗪化学名R-2-[2-[4-[(4-氯苯基)苯基甲基]-1-哌嗪基]乙氧基]乙酸，二盐酸盐，分子式为C₂₁H₂₅ClN₂O₃·2HCl。盐酸左西替利嗪结构式为：

异构体的化学名称及结构式如下：

在已经进行的西替利嗪对映异构体的疗效临床研究试验过程中发现，左旋西替利嗪疗效优于其消旋体西替利嗪，而右旋西替利嗪则没有任何药效作用。由于二者在药理上存在较大的差异，故药物合成和制剂过程中需要对盐酸左西替利嗪的对映异构体杂质含量进行严格控制。而含手性碳原子的对映异构体的分析、分离一直是手性药物合成和制剂过程中质量控制的难点和重点，实现盐酸左西替利嗪及其对应异构体的分离在盐酸左西替利嗪药物的合成和制剂过程的质量控制方面具有非常重要的社会意义和经济效益。

对于制备盐酸左西替利嗪过程中产生的异构体，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。目前USP中收载有药品盐酸左西替利嗪，并且有异构体检测方法，但是USP中盐酸左西替利嗪异构体检测方法，出峰时间很晚，主峰出峰时间为35分钟，一针样品至少需要60分钟，并且对称因子很大，理论踏板数不高。公开日期为20041231的蛋白质及纤维素衍生物手性固定性分离盐酸左西替利嗪对映体，张哲峰，药学学报中限制的是蛋白质及纤维素衍生物手性固定相，而本方法采用的是以表面化学键合β-环糊精的硅胶为填料，具体采用ULTRON ES-CD，该色谱柱有优良的分离性能和耐久性。申请号为201010595648.X的发明专利公开了一种分析分离左西替利嗪及其光学异构体的检测方法，该方法采用CHIRAL-AGP手性柱，为正相色谱法。在该专利中首先色谱柱填料为α₁-酸糖蛋白，使用寿命不长，很容易坏。其次该专利方法报道为正相色谱法，正相色谱法味道重，毒性大。目前还没有一种采用β-环糊精的硅胶为填料，且能经久耐用、环保、毒性小，并且还能快速分离盐酸左西替利嗪及其对映异构体的公开方法报道。

因此开发以β-环糊精的硅胶为填料，经久耐用、环保、毒性小且能快速分离盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分析方法，对于药物分析人员健康及其产品的质量控制和降解途径研究都是十分有意义的工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪 及其对映异构体的方法，该方法为反相高效液相色谱法，可同时实现盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分离和检测，且有优良的分离性能和耐久性，显著缩短了分析时间，拖尾因子和理论踏板数均能达到非常好的效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种HPLC(高效液相色谱)法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法，所述方法中采用的色谱柱是以表面化学键合β-环糊精的硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行洗脱，进入检测器进行检测；所述的流动相A为无机盐缓冲体系，所述的流动相B为有机溶剂。

所述盐酸左西替利嗪结构式为：

所述盐酸左西替利嗪对映异构体的化学名称及结构式如下：

在用环糊精手性键合相拆分对映异构体时，对样品的结构有特殊要求，一是样品分子必须部分能够进入环糊精内腔，二是样品分子手性中心上的极性基团与环糊精腔中的羟基发生缔合作用。本发明所分离的化合物含有苯环，能与环糊精内腔发生包容络合作用，能与环糊精腔口的羟基形成氢建，所以盐酸左西替利嗪及其对映体在环糊精键合固定相上能得到较好的分离。

作为一种优选，所述的色谱柱选择的是ULTRON ES-CD，ULTRON ES-CD：ES-CD手性固定相为β-环糊精，ES-CD有优良的分离性能和耐久性。ES-CD和柱对反相正相流动相都可以，应用于疏水的环状药物、农药和有机化合物的手性分离。

进一步，所述无机盐缓冲体系中无机盐的浓度为0.04mol/L-0.06mol/L。

作为一种优选，所述无机盐缓冲体系中无机盐的浓度为0.05mol/L。

进一步，所述无机盐缓冲体系为六氟磷酸钾的缓冲体系。

影响手性分离的因素很多，在确定的固定相条件下，对确定的样品来说，流动相的组成是影响分离的关键因素。六氟磷酸钾浓度高了，与乙腈混合容易析出固体，浓度低了达不到离子对试剂效果，故选择浓度范围为为0.04mol/L-0.06mol/L。

进一步，所述无机盐缓冲体系pH值为2-4。

流动相的pH和离子强度对环糊精键合相的选择性和效能有很大的影响，在流动相中加入盐，形成缓冲溶液，对保留和效能的影响比对选择性的影响大，由于缓冲剂与分析物竞争占领环糊精空腔，所以随缓冲剂的强度增加，溶质的保留降低，效能增加。流动相pH的变化对离解溶质的有很大的影响。

作为一种优选，所述无机盐缓冲体系pH值为3.0。

进一步，所述流动相A与流动相B的体积比60：40；所述有机溶剂包括乙腈。

在环糊精键合相的手性分离反相模式中，流动相中一般可以使用的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二氧六环等，但使用最多的是甲醇和乙腈。通常在水中环糊精包合有机分子的能力最强，随着有机改性剂的加入，由于有机改性剂与溶质分子相互竞争占据环糊精内腔，使包合能力降低，甲醇是醇类中最弱的顶替剂，乙腈的顶替能力要比甲醇和乙醇强。选择不同的有机溶剂，可以改善对映体分离的选择性。

进一步，所述流动相流速为0.3-0.7ml/min，所述色谱柱柱箱温度为20-30℃。

溶质对环糊精的结合常数受温度的影响很大，在低温下结合常数增大，但质传递会变差，所以降低柱温可使环糊精键合相的选择性增大，同时也可能会使分离度降低，但增加柱温对强保留的溶质的分离会有所改善，所以经过试验验证，色谱柱柱箱温度范围选择为20-30℃。

进一步，所述色谱柱的规格为150×6.0mm，5μm。

对此规格的ULTRON ES-CD分析柱，最佳的流动相流速范围应该为 0.3-0.7ml/min，在高流速下(0.7-2.0ml/min)由于质传递效应引起的峰扩散会导致降低柱效和分离度。

进一步，所述检测器的检测波长为220-240nm。

进一步，所述HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法，具体包括以下步骤：

1)分别取盐酸左西替利嗪及其对映异构体的对照品，用稀释剂溶解制成待测样品及其对映异构体的对照品溶液，分别取待测样品盐酸左西替利嗪及其对映异构体的对照品溶液进样，进行高效液相色谱分析，确定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的保留时间；

2)取盐酸左西替利嗪供试样品加稀释剂制成供试品溶液，再取稀释剂作为空白溶液，分别取供试品溶液及空白溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，完成盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分离测定。

进一步，步骤1)所述稀释剂为乙腈或乙腈的水溶液溶解样品，所乙腈的水溶液中乙腈和水的体积比为40:60。

本发明所述的方法，作为一种优选，具体可按照以下方法实现：

(1)取盐酸左西替利嗪适量，用40％乙腈水溶液(乙腈V：水V＝40:60)溶解样品，配制成每1ml含盐酸左西替利嗪0.1-0.5mg的样品溶液；

(2)选用型号为岛津LC-20AT的色谱仪，色谱柱型号为ULTRON ES-CD(150×6.0mm)，流动相A的配制：称取六氟磷酸钾9.25g(0.05mol/L六氟磷酸钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH值至3.0±0.1；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的比例为60：40，取步骤(1)的样品溶液10μl注入液相色谱仪中，设置流动相流速为0.5ml/min，检测波长为231nm，色谱柱柱箱温度为25℃，完成盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分离及测定。

本发明的目的还在于提供一种固定相及流动相在分离和/或测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的色谱法中的应用，所述固定相为表面化学键合β-环糊精的硅胶，所述流动相为六氟磷酸钾的缓冲体系和有机溶剂，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.04mol/L-0.06mol/L；所述六氟磷酸钾溶液的pH值为2-4；所述有 机溶剂为乙腈。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的一种HPLC法分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体的方法，采用反相高效液相色谱法对盐酸左西替利嗪及其对映异构体进行分离和检测，可在25分钟内将盐酸左西替利嗪及其对映异构体完全分离并进行检测，显著缩短了分离时间，且有优良的分离性能和耐久性。

2)本发明以β-环糊精的硅胶为填料，该填料经久耐用、环保、毒性小且能快速分离盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分析方法，对于药物分析人员健康及其产品的质量控制和降解途径研究都是十分有意义的工作。

3)本发明解决了盐酸左西替利嗪及其对映异构体的分离测定问题，该方法分离度好，专属性强，灵敏度高；且操作简单，具有简便、快速的优点，从而确保了盐酸左西替利嗪及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效，对于盐酸左西替利嗪的质量控制有重要意义。

附图说明

图1为空白溶剂的高效液相色谱图。

图2为盐酸左西替利嗪及其对映异构体的混合溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，采用的仪器及色谱条件如下：

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT

色谱柱：ULTRON ES-CD(150×6.0mm)

流动相：

流动相A：无机盐缓冲体系缓冲盐：称取六氟磷酸钾9.25g(0.05mol/L六氟磷酸钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH值至3.0±0.1；

流动相B：乙腈

流动相A和流动相B的比例为60：40

检测器检测波长：231nm

流动相流速：0.5ml/min

色谱柱柱箱柱温：25℃

进样量：10μl

稀释剂(溶解对照品和待测样品的溶剂)：40％乙腈(乙腈V：水V＝40：60)。

实施例1分离测定盐酸左西替利嗪及其对映异构体

对映异构体溶液的配制：分别取对映异构体对照品约25mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对映异构体贮备溶液。精密移取上述溶液0.5ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对映异构体浓度为1.25μg/ml的对照品液。

混合溶液的配制：称取盐酸左西替利嗪约25mg，置100ml量瓶中，精密移取对映异构体贮备溶液0.5ml，置上述同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

分别取稀释剂及混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，测定结果见表1。结果见图1、图2。

表1试验测定结果

结论：空白稀释剂不干扰样品测定；主峰与对映异构体峰间分离度大于1.5；上述试验证明盐酸左西替利嗪与对映异构体峰分离良好，专属性强。

对比实施例1

在该对比实施例中，除了采用的流动相A不同，其余条件均与实施例1相同。

流动相A：水。

取混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，测定结果见表2。

表2试验测定结果

结论：在与上述实施例其他条件相同仅为流动相A不同的分离试验中，盐酸左西替利嗪与对映异构体分离度小于1.5，并且主峰拖尾因子大于2.0，不能满足盐酸左西替利嗪与对映异构体进行有效分离。

对比实施例2

在该对比实施例中，除了采用的流动相A不同，其余条件均与实施例1相同。

流动相A：无机盐缓冲体系缓冲盐：称取磷酸二氢钾6.8g(0.05mol/L磷酸二氢钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH值至3.0±0.1。

取混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，测定结果见表3。

表3试验测定结果

结论：在与上述实施例其他条件相同仅为流动相A不同的分离试验中，盐酸左西替利嗪与对映异构体分离度小于1.5，并且主峰拖尾因子大于2.0，不能达到盐酸左西替利嗪与对映异构体有效分离的要求。

实施例2色谱系统对盐酸左西替利嗪和对映异构体的检测限、定量限基础研究

定量限溶液：精密称取盐酸左西替利嗪与对映异构体照品，配成一定浓度的溶液，并逐级稀释得定量限溶液，如表2所示。

检测限溶液：精密移取定量限溶液7.0ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液，如表3所示。

测定方法：

取上述定量限溶液连续进样3次，检测限溶液连续进样2次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。记录色谱图，试验结果见表4和表5。

表4定量限测定结果

表5检测限测定结果

结论：从上表试验数据可知，本色谱系统下，盐酸左西替利嗪与对映异构体的检测限、定量限分别符合S/N＝3(10)：1的要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的 宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。