血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p作为急性脑梗死的诊断标志物的应用

摘要

本发明公开了血清外泌体miR‑9‑3p和miR‑124‑3p作为急性脑梗死诊断标志物的应用，所述miR‑9‑3p和miR‑124‑3p的序列分别为AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU和UAAGGCACGCGGUGAAUGCC。采用高分子聚合物沉淀血清中的外泌体，实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术分析脑组织特异性的miR‑9‑3p和miR‑124‑3p在脑卒中患者和健康人群血清外泌体中的表达和差异。急性脑梗死后，脑组织特异性miR‑9‑3p和miR‑124‑3p以外泌体形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，且表达量与脑损伤的程度呈正相关，可作为一种评判脑缺血性损伤和程度的标志物。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p作为急性脑梗死的诊断标志物的应用。

背景技术

脑卒中是世界范围内发病率及死亡率较高的疾病之一，是导致成年人致残的首要因素。具备“五高”的特点，即高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率、高额诊治费用，给国家和患者家庭造成沉重的经济负担。缺血性卒中(Ischemic stroke，IS)占全部脑卒中的80％[Donnan GA,Fisher M,Macleod M,et al.Stroke[J].Lancet,2008,371(9624):1612-1623.]，采用组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(t-PA)的溶栓治疗，以使闭塞的血管再通以挽救缺血半暗带是目前最为有效的治疗手段，但这受限于狭窄的溶栓时间窗，通常急性脑梗死的静脉溶栓时间在4.5h，这也成为当前溶栓治疗的瓶颈，因此，早期诊断已成为脑梗死成功治疗的关键。核磁共振是目前临床诊断最为有效的方法，但该方法也存在一些问题，比如影像学的检查通常是滞后的，早期急性脑梗死患者的核磁共振检查无明显改变，这都会影响到临床的决策和治疗。此外，由于该设备的费用问题影响了其普及性，并且检查的时间延误也严重影响着患者治疗。因此找寻诊断脑缺血损伤早期诊断的标志物是临床卒中研究的重要课题。已有研究发现了多种可以用于脑梗死诊断的蛋白标志物，如S-100β[Dassan P,Keir G,Brown MM.Criteria fora clinically informative serum biomarker in acute ischaemic stroke:a review of S100β[J].Cerebrovasc Dis,2009,27(3):295-302.]和NSE[Anand N,Stead LG.Neuron-specific enolase as a marker for acute ischemic stroke:asystematic review[J].Cerebrovasc Dis,2005,20(4):213-219.]，但它们并非脑损伤特异性蛋白，一些其他疾病如黑素瘤或组织损伤也会使其表达增加，因而这些蛋白质并不是理想的标志物。

MicroRNA是一种内源性的22个核苷酸的小分子单链RNA，通过靶向mRNA的3`UTR降解mRNA，或抑制其翻译从而实现对基因表达的调节[Wevers KP,Kruijff S,Speijers MJ,et al.S-100B:a stronger prognostic biomarker than LDH in stage IIIB-C melanoma[J].Ann Surg Oncol,2013,20(8):2772-2779.]。血液中也存在着microRNAs，它们具有较高的稳定性和一定的组织特异性，是临床诊断标志物的理想选择[Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281-297.]。最近研究发现，急性脑梗死患者或脑缺血损伤动物模型血液中的microRNA表达显著变化，如脑缺血和动脉粥样硬化患者血清中let-7e[Creemers EE,Tijsen AJ,Pinto YM.Circulating microRNAs:novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？[J].Circ Res,2012,110(3):483-495.]、miR-21[Creemers EE,Tijsen AJ,Pinto YM.Circulating microRNAs:novelbiomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？[J].Circ Res,2012,110(3):483-495.]和miR-145[Peng G,Yuan Y,Wu S,et al.MicroRNA let-7e Is a Potential Circulating Biomarker of Acute StageIschemic Stroke[J].Transl Stroke Res,2015,6(6):437-445.]的水平增高，而mirR-221[Creemers EE,Tijsen AJ,Pinto YM.Circulating microRNAs:novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？[J].Circ Res,2012,110(3):483-495.]和miR-210[Tsai PC,Liao YC,Wang YS,et al.Serum microRNA-21 andmicroRNA-221 as potential biomarkers for cerebrovascular disease[J].J Vasc Res,2013,50(4):346-354.]则显著降低，因此认为它们可以作为脑梗死早期诊断的血液标志物。但它们同样缺乏组织特异性，miR-145是主要分布在血管平滑肌细胞[Creemers EE,Tijsen AJ,Pinto YM.Circulating microRNAs:novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？[J].Circ Res,2012,110(3):483-495.]而miRNA-210则是氧敏感性microRNA[Creemers EE,Tijsen AJ,Pinto YM.Circulating microRNAs:novelbiomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？[J].Circ Res,2012,110(3):483-495.]。

miR-9-3p是脑特异性且高表达的microRNA之一[Jia L,Hao F,Wang W,et al.CirculatingmiR-145 is associated with plasma high-sensitivity C-reactive protein in acute ischemic strokepatients[J].Cell Biochem Funct,2015,33(5):314-319.]。近来研究显示，血清miR-9-3p可以作为非侵入性评价神经性损伤的标志物。在神经损伤的动物模型和神经退行性疾病，如AD患者血清中均观察到miR-9-3p水平的增高[Zeng L,Liu J,Wang Y,et al.MicroRNA-210 as anovel blood biomarker in acute cerebral ischemia[J].Front Biosci(Elite Ed),2011,3:1265-1272.]，且miR-9-3p的水平与损伤程度相关。在小鼠急性脊髓损伤模型中也发现血清中miR-9-3p的水平增高，认为其可作为评估损伤程度和治疗效果的标志[Cheng Y,Liu X,Yang J,et al.MicroRNA-145,a novel smooth muscle cell phenotypic marker and modulator,controls vascular neointimal lesion formation[J].Circ Res,2009,105(2):158-166.]。在以三甲基氯化锡(trimethyltin chloride TMT)建立的大鼠神经毒性模型中，TMT可以引起神经元死亡和胶质细胞反应，此时血清中miR-9-3p的水平也显著增高[Mathew LK,Simon MC.mir-210:a sensor for hypoxic stress during tumorigenesis[J].Mol Cell,2009,35(6):737-738.]。MiR-124是脑中含量最丰富的miRNA之一，表达在几乎脑个各个区域[Laterza OF,Lim L,Garrett-Engele PW,et al.Plasma MicroRNAs as sensitive and specific biomarkers of tissueinjury[J].Clin Chem,2009,55(11):1977-1983.]。已有的临床和动物模型研究显示血浆中miR-124的水平较正常对照组显著增加[Weng H,Shen C,Hirokawa G,et al.Plasma miR-124as a biomarker for cerebral infarction[J].Biomed Res,2011,32(2):135-141.,Rainer TH,LeungLY,Chan CP,et al.Plasma miR-124-3p and miR-16 concentrations as prognostic markers in acutestroke[J].Clin Biochem,2016.]。因此本发明分析了脑梗死患者血液外泌体中的miR-9-3p和miR-124-3p的水平变化，并提供血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p作为急性脑梗死诊断标志物的应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服现有技术中对急性脑梗死诊断的不足，提供一种血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p作为急性脑梗死的诊断标志物的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p作为急性脑梗死的诊断标志物的应用，所述miR-9-3p和miR-124-3p的序列分别为AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU和UAAGGCACGCGGUGAAUGCC。

外泌体是一种直径约30-100nm的双层膜性小囊泡，多种组织和细胞都可分泌形成，存在于血清、脑脊液、唾液和尿液等体液中。它们含有来自宿主细胞的microRNA和蛋白质等多种成分，是细胞间重要的信息交流媒介，同时也是无创性疾病诊断标志物研究的理想对象。该发明将分析脑组织特异性的miR-9-3p和miR-124-3p在急性脑梗死患者血清外泌体中的表达，并探讨其作为急性脑缺血损伤标志物的可能性。

采用基于高分子聚合物沉淀溶液中外泌体的Exoquick法分离提取血清外泌体，实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术分析脑组织特异性的miR-9-3p和miR-124-3p在脑卒中患者和健康人群血清外泌体中的表达和差异。

有益效果：成功分离和鉴定人血清外泌体。脑卒中患者血清外泌体中miR-9-3p和miR-124-3p的水平较对照组显著增加(P＜0.001)，且其表达量与IL-6的含量呈正相关(r＝0.741,P＜0.001)。因此，急性脑梗死后，脑组织特异性miR-9-3p和miR-124-3p以外泌体形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，且表达量与脑损伤的程度呈正相关，miR-9-3p和miR-124-3p的AUC(area under curve)值分别为0.8689(95％CI:0.7779–0.9600)and 0.7083(95％CI:0.5866–0.8301)，因此它们可作为一种评判脑缺血性损伤和程度的标志物。由于在外泌体的提取过程中，绝大部分血清成分被去除，因此外泌体microRNA较血清microRNA可以更为准确地反映脑缺血损伤的程度。miR-9-3p和miR-124-3p的特异性和灵敏度显著高于现有的蛋白标志物如S100β，CRP。

附图说明

图1是本发明的血清外泌体的分离和鉴定。A.透射电镜观察分离的外泌体大小和形态(Bar＝200nm)；B.Western印迹法检测外泌体标志蛋白CD9，CD63和CD81在对照组和研究组血清外泌体中的表达。C.NTA检测血清外泌体的粒径分布图；D.NTA的外泌体图片。

图2是两组血清外泌体中miR-9-3p和miR-124-3p的表达，注：两组比较，*P＜0.001。

图3是miR-9-3p和miR-124-3p表达与IL-6水平的相关性

图4.是miR-9-3p和miR-124-3p的ROC(Receiver operation Characterization)分析结果。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例

一、1.研究对象：选取2015年1月至2015年12月南通大学附属医院神经内科住院的急性脑梗死患者32例设为研究组。其中男20例，女12例。年龄40～76岁，平均(61.3±10.3)岁。均经头颅CT或MRI检查证实，符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑梗死诊断标准。发病时间48-72小时，NIHSS评分的中位数(四分位数间距)为8(8-12)。除外恶性肿瘤，心肌梗死或心衰，血液、内分泌、代谢或消化系统疾病，营养不良，严重肺部感染、肝肾功能不全者，及神经系统的其他疾患。将同期医院体检中心确诊的的健康志愿者33例设为对照组，其中男18例、女15例，年龄46～79岁，平均(60.25±8.0)岁。本研究获医院伦理委员会批准。

2.血清收集与保存：健康志愿者于体检中心空腹采血，脑梗死患者于入院次日空腹采静脉血3ml，分离血清，-80℃冻存。ELISA法检测血液中IL-6、S100β和CRP的量：采用抗体双夹心法，检测血液中IL-6、S100β和CRP的浓度。

研究组和对照组在性别、年龄间无统计学差异(P＞0.05)；血清中IL-6、CRP、S-100β的表达较对照组增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

组别例数年龄男性IL-6CRPS-100β研究组3261.3±10.32064.9±6.267.58±5.970.18±0.04对照组3360.25±8.01835.6±5.215.12±3.130.13±0.16t值0.560.4211.27.868.55P值0.580.520.00060.0045﹤0.001

二.血清外泌体的分离：①将保存于-80度的血清在冰上融化，21000g，4℃离心15min。将上清转移至新的EP管中，加入1/4体积的ExoQuick溶液轻轻颠倒混匀，4℃孵育2h，1500g离心30min，去除上清，保留沉淀备用。采用SBI公司的Exoquick试剂盒(SystemBiosciences Inc.,Mountain View,CA,USA)分离血清中的外泌体。②.分析外泌体的粒径和浓度：采用Nanoparticle-tracking analysis(NTA)分析颗粒的数量和粒径分布。将上述沉淀用30μl无颗粒PBS重悬，测试前再稀释1000倍。③透射电镜观察外泌体的形态：根据Thery等(Thery C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomesfrom cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3 22.)所描述的方法准备电镜观察样本。用30ul PBS重悬沉淀，加入等体积的4％w/v多聚甲醛固定。将10ul固定后的外泌体溶液滴到Formvar/carbon-coated镍网上，空气干燥20min。PBS洗涤数次后，用1％v/v的戊二醛固定5min，纯水清洗数次后用4％w/v醋酸铀染色5min，醋酸铀和甲基纤维素混合液体包埋，用滤纸吸去多余液体并空气干燥备用。透射电镜(JEM-2100JEOL,Tokyo,Japan)观察外泌体的形态和大小。④Westen blot检测外泌体标志物：采用RIPA(Pierce,USA)裂解液提取外泌体蛋白，BCA(Pierce,美国)测定蛋白浓度。12％SDS-PAGE分离蛋白，每道上样量为40μg总蛋白。湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入CD63(SBI System Biosciences,USA)，CD9(Abcam，USA)和CD81(Abcam，USA)抗体(1:1000)，4℃封闭过夜，TBST洗3次，加入HRP标记的2抗(1:1000)，室温孵育1h，增强化学发光法显色(ECL)(Pierce,USA)，胶片记录。

由于外泌体粒径极小，传统的超速离心法费时、费力且分离效率较低，遂采用通过高分子聚合物沉淀溶液中外泌体的Exoquick法[Thery C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolationand characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].CurrProtoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3 22.]。本实验通过该方法获得的血清外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在100nm以下(图1A)，表达CD9，CD63和CD81等外泌体的标志分子，且研究组和对照组间无明显差异(图1B)。进一步的NTA分析显示，分离到的外泌体粒径并不均一，主要分布在100nm附近(图1C和D)，说明成功分离了人血清外泌体。三.外泌体RNA抽提和定量及实时定量PCR：采用mirVana(Ambion,TX,USA)试剂盒抽提血清外泌体的总RNA。Bioanalyzer 2000(Agilent,CA)检测所提取RNA的质量和浓度。采用基于poly-A加尾法的miDETECT A Track^TM>

研究组血清外泌体中miR-9-3p的表达：采用Q-PCR检测血清外泌体中miR-9-3p和miR-124-3p，其相对表达水平以40-CT表示。如图2所示，对照组的miR-9-3p和miR-124-3p的表达接近于本底水平，而研究组患者miR-9-3p和miR-124-3p的表达显著增高(P＜0.001)。血清外泌体中的miR-9-3p和miR-124-3p表达量与血液中IL-6的水平间的关系：为探讨血清外泌体中miR-9-3p和miR-124-3p的水平与脑损伤程度之间的关系，对miR-9-3p和miR-124-3p的水平与血液中促炎症因子IL-6的水平进行线性回归分析(图3)显示两者间明显相关(P＜0.001)。如图4所示，miR-9-3p和miR-124-3p的AUC(area under curve)值分别为0.8689(95％CI:0.7779–0.9600)and 0.7083(95％CI:0.5866–0.8301)，因此它们可作为一种评判脑缺血性损伤和程度的标志物。

本组脑梗死病例中仅有15例S100β表达量增高，而miR-9-3p和miR-124-3pp在所有病例中均显著增高，同时与脑缺血损伤的相关性也要高于CRP，脑组织特异性miR-9-3p和miR-124-3p以外泌体形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，且表达量与脑损伤的程度呈正相关，可作为一种评判脑缺血性损伤和程度的标志物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。