重组基因、其编码的重组蛋白、其应用及牛副结核杆菌的检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明提供了一种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种如SEQ ID No.1所示重组基因编码得到的重组蛋白。本发明还提供了一种如上所述的重组蛋白在检测牛副结核杆菌中的应用，主要是作为包被抗原使用。本发明还提供了一种检测牛副结核杆菌的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG和底物显色液。本发明以SEQ ID No.1所示的重组基因编码获得的重组蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA检测牛副结核杆菌，具有较好的特异性、敏感性及重复性，结果直观准确。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组基因、其编码的重组蛋白、其应用及牛副结核杆菌的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

副结核病(Paratuberculosis)也叫副结核性肠炎，是一种由副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)感染引起的以牛、羊、鹿等反刍动物为主的慢性消耗性传染病。其中牛是对本病最为易感的动物，该病主要引起患病牛慢性增生性肠炎、顽固性腹泻及慢性消瘦以致死亡。本病广泛流行于世界各地,每年造成巨大损失。在我国，牛副结核病的流行呈不断上升的趋势，给我国养牛业造成巨大的经济损失。目前对该病尚无有效的治疗方法和预防措施,根除此病的唯一办法就是检出、隔离、淘汰。因此建立一种快速高效的诊断方法非常重要。

由于该病潜伏期长，在明显症状出现之前不易被发现，加之人工培养分枝杆菌难度又高，一旦感染可在短期内传播至整个牛群。因此对该病的早期诊断就显得尤为重要，世界各国对本病的诊断学方法和技术都予以了高度重视和深入化研究。除根据该病的特征性临床症状和病理变化作初步诊断外，牛副结核病的确诊依赖于实验室诊断方法，主要有细菌学诊断、变态反应诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等方法。

细菌学诊断：该方法在群体诊断中的应用受到很大限制。操作复杂，费用昂贵，需要时间长(2～3个月或更长)，分离率低。

变态反应诊断：本方法适用于发病前期，不适用于中后期，对于感染中后期临床症状重剧的病牛，变态反应可能消失，处于耐受期的动物敏感性不强，在检查时应注意。李景思等(1997)研究发现其他一些分枝杆菌，如禽型结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、草分枝杆菌可以干扰副结核分枝杆菌的检测。

补体结合试验方法：不适用作筛选和鉴定亚临床感染的检测，且该方法操作程序复杂，不适用于血清样品的大规模检测。

琼脂免疫扩散试验：该法虽然具有操作简单、特异性好，结果判读容易等特点，但由于敏感性低，不适宜作筛选和鉴定亚临床感染病例。由于抗原的原因，目前还难以进入使用阶段，并且国内外关于牛副结核琼脂抗原的报道也非常少。

免疫胶体金技术：曾有报道称，胶体金免疫层析快速诊断试纸条存在假阳性和漏检率高的问题。假阳性或弱阳性其主要原因是由于检测时间过短，也有可能是强阳性样品造成的拖带现象，同时外界条件如温度、湿度对结果也有一定的影响。

分子生物学诊断：操作复杂、费用昂贵。

虽然以上所述的各种方法都可以用于牛副结核病的诊断，但是其方法本身也存在许多缺点：它的费用相当高，操作复杂，浪费大量的时间，需要特殊仪器等。

随着国际贸易和世界经济的发展，尤其在我国加入WTO后，动物及动物性产品的国际交流日趋频繁，我们迫切需要建立一种简便、特异、灵敏、稳定的诊断方法用于牛副结核病的诊断。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一类常用的免疫酶技术，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进行，检测液体中未知抗原或抗体的血清学诊断方法。此项技术自70年代初问世以来发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的各个领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组基因、其编码的重组蛋白、其应用及牛副结核杆菌检测试剂盒和检测方法，本发明提供的检测方法简便、特异性、灵敏性和稳定性强。

本发明提供了一种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种如SEQ ID No.1所示重组基因编码得到的重组蛋白，该重组蛋白可作为包被抗原，利用间接ELISA法对牛副结核杆菌进行检测。

本发明还提供了一种如上所述的重组蛋白在检测牛副结核杆菌中的应用，主要是作为包被抗原使用。

本发明还提供了一种检测牛副结核杆菌的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG和底物显色液。

其中，所述包被液为CBS溶液；所述洗涤液为PBST溶液；所述封闭液为含2％明胶的CBS溶液；所述稀释液为含0.5％明胶的PBST溶液，所述底物显色液为TMB底物显色液。

所述试剂盒中，所述重组蛋白和包被液的质量和体积比为0.125～4μg/mL。

本发明还提供了一种牛副结核杆菌的检测方法，包括以下步骤：

将如上所述的重组蛋白用包被液包被后，用洗涤液洗涤，加入封闭液封闭，加入稀释的待测血清进行反应，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG再次反应后洗涤，加入底物显色液进行显色，获得检测结果。

本发明以SEQ ID No.1所示的重组基因编码获得的重组蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA检测牛副结核杆菌，具有较好的特异性、敏感性及重复性，结果直观准确。

附图说明

图1为本发明实施例提供的重组基因的PCR扩增产物电泳结果；

图2为本发明实施例提供的重组质粒双酶切的凝胶电泳结果；

图3为本发明实施例提供的表达产物的SDS-PAGE鉴定结果；

图4为本发明实施例提供的经不同浓度咪唑洗脱后的纯化产物的SDS-PAGE鉴定结果；

图5为本发明实施例提供的在最佳浓度咪唑洗脱的纯化产物的SDS-PAGE鉴定结果；

图6为本发明实施例提供的最终纯化产物的SDS-PAGE鉴定结果；

图7为本发明实施例提供的最终纯化产物的Western blot检测结果。

具体实施方式

实施例1

1、目的基因的合成

以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为目的序列，参考原核表达载体pET28a(+)的酶切位点，选定BamHⅠ(GGATCC)和Xho Ⅰ(CTCGAG)作为此段基因的酶切位点，终止子为:taatga，送公司合成，获得带有重组基因map0862-2154c的大肠杆菌，即PUC-K-map0862-2154c。

2、重组质粒PUC-K-map0862-2154c的提取

将上述公司合成的菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的固体培养基上，正面向上放置2～3h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12～16h。用接种环从平板挑取白色单菌落，接种于5mLAmp/LB液体培养基中，37℃200r/min振摇过夜(12～16h)。参照天根公司的质粒小提试剂盒说明书进行操作，提取得到重组质粒PUC-K-map0862-2154c。、

3、引物的设计与合成

根据合成的重组目的基因map0862-2154c，设计一对特异性引物。引物序列如SEQID No.2和SEQ ID No.3所示，具体为：

L1：TGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCAT

L2：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA

引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

4、目的基因的PCR扩增

以提取的重组质粒PUC-K-map0862-2154c为模板，建立20ul PCR反应体系：

混匀后放入PCR仪中，其反应程序如下：

反应结束后取5uLPCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳进行检测，结果如图1所示，在约558bp处出现一条特异性目的条带，与预期扩增的map0862-2154c目的基因大小相符。

5、PCR产物的纯化与回收

按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行操作。

6、原核表达载体的构建

(1)目的基因和原核表达载体pET-28a(+)的酶切

用限制性内切酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ分别对目的基因和原核表达载体pET-28a(+)进行双酶切，目的基因和原核表达载体酶切后1％琼脂糖凝胶进行电泳，从琼脂糖凝胶上将所需的DNA带切下，胶回收试剂盒进行回收。

(2)目的基因map0862-2154c与pET28a(+)载体的连接

将回收后的目的基因和表达载体进行连接，构建重组表达质粒pET0862-2154c。

(3)连接产物的转化：构建重组表达质粒pET0862-2154c转化到大肠杆菌DH5α感受态中(克隆菌)。

(4)重组表达质粒pET0862-2154c的提取：用以上转化好的DH5α菌液，涂板挑菌到液体培养基过夜摇菌培养，然后按试剂盒说明提质粒。

(5)重组表达质粒pET0862-2154c的酶切鉴定

提取的重组质粒pET0862-2154c，用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。

用限制性内切酶BamH I和Xho Ⅰ对重组表达质粒pET0862-2154c进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，出现一条约5369bp的载体片段和一条约558bp的目的片段，与预期结果相符(见图2)，说明目的基因已正确插入到原核表达载体pET28a(+)中。

(6)测序鉴定

将鉴定正确的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定，结果表明其基因序列如SEQ ID No.1所示。

(7)重组质粒向表达菌株E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞的转化

将上述鉴定正确的阳性重组表达质粒pET0862-2154c转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞(具有KANA和氯霉素抗性)。

7、重组表达菌的诱导表达及表达蛋白的鉴定

(1)重组表达菌的诱导表达及上样蛋白的制备

取重组表达的菌液涂于Kana-氯霉素/LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取白色单菌落接种于5ml Kana-氯霉素/LB液体培养基中，200r/min振摇培养过夜。将培养的菌液按1:100比例接种于Kana-氯霉素/LB液体培养基中，37℃200r/min培养。当OD600达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，200r/min，分别20℃诱导过夜、37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。4000rpm离心10min弃上清收集菌体，菌体用PBS缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀(沉淀用包涵体溶解液溶解)，分别取上清和沉淀样品加入等比例的上样缓冲液混匀，沸水浴10min，冷却后进行SDS-PACE电泳。

(2)MAP0862-2154c重组蛋白的SDS-PACE鉴定

用SDS-PACE电泳检测上述诱导表达蛋白的情况，同时用未加IPTG诱导剂的菌体作为阴性对照。结果如下：

将重组质粒pET0862-2154c转化至表达菌E.coli Rosetta(DE3)中用IPTG进行诱导，20℃诱导过夜和37℃诱导4h，分别取上清和沉淀，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。经SDS-PAGE检测，重组菌经37℃诱导4h后且在上清中出现1条约为29kDa的特异条带(图3所示)，大小与预期的蛋白分子量相一致，而未诱导菌没有出现此蛋白条带。

(3)MAP0862-2154c重组蛋白的纯化：用蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)纯化。

(4)纯化蛋白的SDS-PACE电泳检测

(4-1)纯化MAP0862-2154c重组蛋白的SDS-PAGE鉴定

用蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化，收集流穿液，用含不同浓度咪唑的Soluble Elution buffer洗脱收集各组分的洗脱液，进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE分析表明，经不同浓度咪唑洗脱后，洗脱液中含有目的蛋白，且含100mM和500mM咪唑的洗脱组分中蛋白量较大(如图4)。确定了蛋白纯化中Soluble Binding buffer和Soluble Elutionbuffer中咪唑的最佳使用浓度，用蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行最终纯化。SDS-PAGE分析可知纯化效果较好，且在8处目的蛋白浓度达到最大(见图5)，取11之后的蛋白混匀分装，于-80℃保存。

重组蛋白经过最终纯化，进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，在相应位置(29kD)出现明显目的条带，表明重组蛋白成功得到了纯化。

(4-2)MAP0862-2154c重组蛋白的Wersten blot检测

对经过SDS-PAGE鉴定的重组蛋白再做进一步的Western blot检测，检测结果见图7。从图中可看到，阳性表达蛋白的Western blot检测有一条特异性显色带，它的位置与SDS-PAGE电泳图中的目的蛋白表达带相对应。表明表达的重组蛋白能与抗牛副结核的标准阳性血清发生特异性结合。说明目的蛋白已在原核表达系统中得到成功表达。

纯化蛋白浓度的测定：用试剂盒测的浓度为2.38mg/ml(约2.4mg/ml)。

实施例2重组MAP0862-2154c蛋白间接间接ELISA检测方法的建立

1、重组蛋白MAP0862-2154c，抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释浓度的确定

将实施例1得到的纯化的蛋白用CBS包被液分别做4.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的梯度稀释，100μL/孔，4℃包被过夜。用PBST溶液洗涤3次，每次3min，甩干；加入含2％明胶的CBS封闭液，300μL/孔，37℃封闭2h，弃去封闭液，洗涤3次拍干；然后用抗体稀释液(含0.5％明胶的PBST)将阴、阳性血清从1∶25开始倍比稀释组成方阵，100μL/孔，37℃反应1h；用PBST洗涤5次，每次2min拍干；每孔加入100μL 1∶100000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，37℃反应45min，用PBST洗涤6次，每次3min拍干；加入底物显色溶液100μL/孔，37℃避光显色15min；最后加入2mol/L硫酸终止液终止反应，50μL/孔。用酶标仪测OD_450nm值。以阳性OD_450nm值/阴性OD_450nm值(P/N)比值最大时抗原的浓度为抗原最佳工作浓度，该点对应的血清稀释度为血清最佳稀释度。

其中，CBS包被液为0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，制备方法如下：将碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g溶于950mL去离子水中，调pH值至9.6，最后定容到1000mL，4℃保存备用。

PBST溶液制备方法如下：首先制备0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS制备方法如下：NaCl 8.00g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O>

将0.5mL Tween-20加入到999.5mL PBS溶液中，得到PBST溶液，于4℃保存。

底物显色溶液包括pH5.5的底物缓冲液和TMB底物显色液，其中，底物缓冲液制备方法如下：24.3mL的0.l mol/L柠檬酸溶液，25.7mL的0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O混匀，再去离子水定容至100mL，4℃保存；

TMB底物显色液制备方法如下：取0.5mL的TMB母液(10mg/5mL无水乙醇)，10mL的底物缓冲液，在即将使用前加入30μL 30％过氧化氢溶液，混匀后使用，现用现配。

选定阳性血清OD值相对较高，而且阴性血清OD值又低，即两者的比值P/N值较大时的反应孔的反应孔的抗原和血清稀释倍数作为二者最佳工作浓度。由表1所示，当抗原包被的浓度为1.0μg/mL，血清为1∶800稀释时，阳性与阴性血清的OD比值(P/N)最高(8.643)，故将其确定为最佳的包被浓度和血清稀释浓度。

表1.重组蛋白方阵试验

注：P表示牛副结核阳性血清OD₄₅₀值；N表示牛副结核阴性血清OD₄₅₀值。

2、封闭液及封闭时间的确定

用已经确定的抗原最佳包被浓度和包被条件进行间接ELISA，分别以含2％明胶的CBS为封闭液与含0.5％明胶的PBST为抗体稀释液、含5％脱脂奶粉、1％BSA及5％犊牛血清的PBST为封闭液与抗体稀释液，分别于37℃条件下封闭1h、2h后，随后加1∶800稀释的一抗，1∶100000稀释的二抗，终止反应后，在酶标仪上读取OD450nm值。通过OD450nm值及P/N值大小以确定最适宜的封闭条件，结果见表2。

表2封闭液及封闭时间的确定

由表2可知，当含2％明胶的CBS为封闭液于37℃封闭2h时，封闭效果最好，阳性血清OD450nm值较高，且，阳性血清(PS)与阴性血清(NS)的OD比值(P/N)最高(8.877)。

3、一抗最佳反应时间的确定

取已包被抗原并封闭好的酶标板，加入最佳稀释倍数稀释后的阴、阳性血清，将反应时间分别于37℃反应30min、45min、60min、90min，其他条件同1。比较各组阴阳性血清的OD值。通过OD450nm值和P/N值以确定一抗最佳反应时间，结果见表3。

表3待检血清最佳作用时间的确定

注：P表示牛副结核阳性血清OD₄₅₀值；N表示牛副结核阴性血清OD₄₅₀值。

由表3所示，当待检血清于37℃反应60min时，阳性血清的OD450nm值较高，阳性与阴性血清的OD比值(P/N)最高(9.361)。

4、酶标二抗最佳稀释浓度的确定

在上述抗原最佳包被浓度、一抗最佳稀释度及反应时间和封闭条件确定的基础上进行间接ELISA，将HRP-兔抗牛IgG用含0.5％明胶的PBST分别作1:50000、1:100000、1:200000、1:400000这4个稀释度，37℃反应45min，显色15min加终止液终止反应后测定OD450nm，比较各组OD450nm值和P/N值大小，P/N值最大时的稀释倍数即为酶标二抗最佳工作浓度，结果见表4。

表4酶标二抗最佳稀释浓度的确定

由表4可知，当酶标抗体稀释度为1∶100000时，阳性与阴性血清的OD比值(P/N)最高(9.108)。

5、酶标二抗反应时间的确定

将酶标二抗按最佳稀释浓度稀释后，分别于37℃反应30min、45min、60min、90min，比较各组的OD450nm值和P/N值，确定酶标二抗的最佳反应时间，结果见表5。

表5酶标二抗反应时间的确定

注：P表示牛副结核阳性血清OD₄₅₀值；N表示牛副结核阴性血清OD₄₅₀值。

由表5所示，当酶标二抗于37℃反应45min时，阳性血清与阴性血清的OD_450nm比值(P/N)最高(8.705)。

6底物最佳显色时间的确定

在已经确定的各步反应条件的基础上进行ELISA，最后加入底物显色，显色时间分别于37℃避光显色10min、15min、20min、25min；终止反应，测定OD450nm值。结果由表6所示。

表6底物最佳作用时间的确定

注：P表示牛副结核阳性血清OD₄₅₀值；N表示牛副结核阴性血清OD₄₅₀值。

由表6可知，当显色的时间为15min时，阴、阳性血清OD_450nm比值(P/N)较高(8.920)。因此，底物显色最佳时间为37℃避光反应15min。

7阴阳性临界值确定

经计算30份牛副结核阴性血清OD_450nm值的平均值(X)为0.249，标准方差(SD)为0.052，OD_450nm均值(X)+3×SD＝0.249+3*0.052＝0.405，OD_450nm均值(X)+2×SD＝0.249+2*0.052＝0.353。因此，当待检血清OD_450nm≥0.405即可判为阳性；OD_450nm<0.353即可判为阴性；界于两者之间即可判为可疑(见表7)。

表7阴阳性临界值的确定

8交叉试验

用含2％明胶的CBS将牛布氏杆菌、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎阳性血清分别作1∶800稀释，同时作牛副结核阴、阳性血清对照。交叉实验结果由表8显示，牛副结核阳性血清为阳性(+)，牛布氏杆菌、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎阳性血清均为阴性(–)，说明本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。

表8间接ELISA方法的特异性试验

9重复性试验

用蛋白包被的同一批ELISA板对5份牛副结核阳性血清样品进行批内重复试验检测，每份血清重复5孔。结果显示：批内重复试验的变异系数均值为3.1％，小于10％(见表9)，表明本方法的批内重复性较好。

表9批内重复试验

将同样的5份血清样品分别在3块不同批次制备的酶标板上于相同条件下进行批间重复试验，检测OD_450nm值。结果显示：批间重复试验的变异系数均值为4.2％，小于10％(见表10)，表明本方法的批间重复性良好。

表10批间重复试验

10建立的检测方法与市售试剂盒比较试验

取100份收集的血清，分别用本研究建立的间接ELISA方法、上海笃玛生物科技有限公司的牛副结核抗体检测试剂盒进行检测，结果见表11。本研究建立的间接ELISA方法的特异性为91％，敏感性为87％，符合率为89％。

表11与ELISA检测试剂盒比较试验

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。