用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种可与质谱直接联用的蛋白质在线分析PMMA芯片及其制备方法，本发明先分别在PMMA基片和PMMA盖片上集成微型通道和电喷雾电极，然后进行封合，接着利用切割、打磨等机械加工技术在芯片通道末端制备了与质谱连接的接口即电喷雾喷嘴，然后利用表面改性结合化学修饰的方法在芯片通道内集成酶反应器，最后得到用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片；所制备的芯片特点是集成化程度高、制作成本低。该PMMA芯片集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极，可与ESI质谱直接联用进行蛋白质在线分析。

说明书

技术领域

本发明涉及在芯片加工领域中的一种利用微细加工和化学修饰手段制备集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电极的，可与质谱联用的蛋白质分析芯片的方法。

背景技术

蛋白质组学研究是21世纪生命科学的研究热点之一。生物质谱由于其可以提供试样组份中生物大分子的基本结构和定量信息，因此在蛋白质研究中具有巨大的潜力。进入质谱检测前，蛋白质必须先进行酶解处理，这个前处理是必不可少的。在传统蛋白质分析中，蛋白质先经过常规的溶液中酶解，然后收集酶解液进质谱检测分析。常规溶酶解蛋白质的反应时间长，一般需要十几个小时以上，且存在严重的酶自降解现象。这大大阻碍了蛋白质的快速有效分析。

微流控芯片可以集成常规分析系统中的试样引入、预处理、反应、分离、检测等众多功能单元，具有微型化、集成化、自动化、便携化等众多优点，越来越受到各界的关注。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)由于其光学性能好、生物兼容性好、玻璃化温度较低、加工方便成本低等优势而被广泛地用于制作各种微流控芯片。

微流控芯片由于其通道特性，在通道内反应速度较常规溶液中快。因此，芯片通道内的酶解可以很大程度地减小酶解时间。此外，将蛋白酶固定在通道表面，可以提高酶与底物的接触面积，从而大大提高了酶解反应效率，实现快速酶解。因此，文献中有报道将胰蛋白酶固定在通道表面，然后蛋白质样品通入芯片酶解后直接与基质混合转移至MALDI板上进行检测，大大缩短了酶解时间，实现了自动快速酶解。但可以看出，实验过程中仍需收集酶解液进行离线检测，蛋白质酶解和质谱检测这两个步骤仍是独立依次进行，耗时耗力，不能实现在线快速自动酶解、在线质谱检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片及其制备方法，采用本发明的方法能得到集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极的，可与ESI质谱直接联用进行蛋白质分析的PMMA芯片。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)、在PMMA基片的正面集成微型通道，得带有通道的PMMA基片；所述微型通道的末端通道与PMMA基片的中心线相重合；

2)、在PMMA盖片的正面集成电喷雾电极，得带有电极的PMMA盖片；

所述电喷雾电极包括2个电极块和一根电极线，所述2个电极块分别位于PMMA盖片的中心线的两端，且2个电极块通过电极线相连通；

3)、将带有通道的PMMA基片以末端通道(即，PMMA基片的中心线)为角平分线切割形成尖角；

将带有电极的PMMA盖片切割形成与PMMA基片的尖角相吻合的尖角；

4)、将步骤3)所得的切割后PMMA基片和切割后PMMA盖片均置于紫外灯下，进行紫外光辐射处理；

5)、将步骤4)所得的辐射处理后PMMA基片和辐射处理后PMMA盖片进行封合，得PMMA芯片；PMMA基片的正面与PMMA盖片的正面相贴合(即，通道面与电极面相贴合)，PMMA基片的中心线与PMMA盖片的中心线相重合，形成PMMA基片尖角的两个斜面与形成PMMA盖片尖角的两个斜面相对应的吻合，所述电极线垂直横跨末端通道；

打磨PMMA芯片的尖角(由PMMA基片尖角和PMMA盖片尖角组合形成)，使尖角处的PMMA芯片的厚度为0.65～0.75mm，PMMA芯片尖端设置电喷雾喷嘴；所述电喷雾喷嘴与末端通道相连通；

所述电极线与末端通道的交叉点距离电喷雾喷嘴(4)0.45～0.55cm；

6)、先向微型通道内充满乙二胺溶液，室温反应2～3小时，反应结束后用纯净水冲洗微型通道；

再向微型通道(1)内充满戊二醛溶液，室温反应10～16小时，反应结束后用用50mmol/LpH＝7.0的磷酸缓冲液冲洗微型通道；

最后向微型通道内充满蛋白酶溶液，3～5℃下反应22～26h(较佳为4℃下反应24h)，反应结束后用纯净水冲洗微型通道；得用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片。

备注说明：该用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片为集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极的，可与ESI质谱直接联用进行的PMMA芯片。

在步骤4)中，PMMA基片和PMMA盖片经紫外光辐射处理后，表面会产生羧基等基团；羧基与乙二胺溶液反应，微型通道的表面修饰上氨基基团；氨基基团与戊二醛溶液反应，微型通道的表面修饰上醛基基团；蛋白酶与微型通道表面的醛基反应从而修饰到微型通道的表面。

在本发明中，室温一般是指15～25℃。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的改进：

PMMA盖片的宽度大于PMMA基片的宽度，从而使PMMA盖片上的2个电极块均不会被PMMA基片所完全覆盖。

备注说明：PMMA盖片上的电极块需要外漏出来，这样实际使用时电极夹才能夹住电极块，才能施加电压。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：

在PMMA基片的反面分别设置样品进样口和辅助溶液进样口；所述样品进样口和辅助溶液进样口与微型通道相连通；且辅助溶液进样口与末端通道的交叉点距离电喷雾喷嘴0.5～1cm。

备注说明：辅助溶液进样口与末端通道的交叉点、电极线与末端通道的交叉点是两个不同的点，但也可以相重叠。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：

所述步骤4)中的紫外光辐射处理为：于2.10mW/cm²的辐射强度下辐射1～3h。

备注说明：利用能产生臭氧的低压汞灯作为紫外灯，其辐射的主要紫外为254nm。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：

所述乙二胺溶液的配制方法为：将0.3～0.4mol的乙二胺、45～55mmol(较佳为50mmol)的EDC，用50～100mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至1L；

所述戊二醛溶液的配制方法为：将戊二醛与50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液混合形成戊二醛溶液，所述戊二醛溶液中戊二醛的体积浓度为5％；

所述蛋白酶溶液的配制方法为：将5mg胰蛋白酶用50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至5mL。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述微型通道(1)可以通过热压法、激光烧蚀法或数控铣床等方法制备所得。其通道构型可以根据需要调整。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：电极块和电极线均由金属材料(例如金、铜、银等)制成；采用紫外光诱导化学镀技术在PMMA盖片上集成。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：PMMA基片上的尖角为直角或锐角。

作为本发明的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述步骤5)的封合为常温加压封合。

在本发明中，PMMA即是指聚甲基丙烯酸甲酯。

综上所述，本发明旨在提供一种可与质谱直接联用的蛋白质在线分析PMMA芯片的制备方法。先分别在PMMA基片和PMMA盖片上集成微型通道和电喷雾电极，然后进行封合，接着利用切割、打磨等机械加工技术在芯片通道末端制备了与质谱连接的接口即电喷雾喷嘴，然后利用表面改性结合化学修饰的方法在芯片通道内集成酶反应器，最后得到用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片；其制备的芯片特点是集成化程度高、制作成本低。该PMMA芯片集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极，可与ESI质谱直接联用进行蛋白质在线分析。

常规的蛋白质分析需要先单独溶液酶解，然后收集酶解液，最后把酶解液进入质谱分析。至少需要24h以上。本发明只需10min左右即可得到酶解样品的质谱信号。

本发明提供的制备方法，具有如下技术优势：

1.本制备方法制备的PMMA芯片集成化程度高，集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极；

2.本方法将PMMA芯片通道末端通过微加工制成一体化的探针，制备的芯片可直接与ESI质谱联用，且酶反应器与喷嘴之间没有死体积；

备注说明：死体积是指酶反应器与喷嘴之间的空隙体积。因为本发明中酶反应和喷嘴是完全集成在一起的，所以没有死体积；

3.本方法制备的PMMA芯片可以实现蛋白质的芯片上在线酶解，且不需要收集酶解液直接进入质谱分析(芯片可以与质谱联用)。

4.本方法制备过程不需要使用任何密封胶水等试剂，避免了对后期质谱的干扰；

5.本制备方法简单，成本低。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是PMMA基片的结构示意图。

图2是PMMA盖片的结构示意图。

图3是PMMA芯片(即，PMMA基片和PMMA盖片封合后)的结构示意图。

图4是与质谱直接联用进行蛋白质在线分析的PMMA芯片制作流程图；

图4中：

(a)：空白PMMA基片；

(b)：空白PMMA盖片；

(c)：加工有微型通道的PMMA基片；

(d)：加工有电喷雾电极的PMMA盖片；

(e)：基片的通道末端经过切割形成尖端(尖角)；

(f)：盖片切割成与(e)相同的尖端；

(g)：(e)和(f)经过紫外光处理后，常温封合；

(h)：(g)的尖端经过打磨、抛光处理形成以通道末端为中心的尖嘴；

(i)：(h)的通道依次经过乙二胺、戊二醛、酶溶液处理，集成了固定化酶反应器；

图5是采用该方法制备的PMMA芯片与质谱联用得到的酶解细胞色素c的质谱图。

具体实施方式

实施例1：一种可用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制作方法，依次进行以下步骤：

1)、首先采用热压法在2cm×6cm大小的PMMA基片上加工出所需要的通道构型，即，在PMMA基片的正面集成微型通道1，得带有通道面的PMMA基片；所述微型通道1的末端通道11与PMMA基片的中心线相重合；

在PMMA基片的反面分别设置样品进样口5和辅助溶液进样口6；所述样品进样口5和辅助溶液进样口6均与微型通道1相通；样品进样口5远离末端通道11，辅助溶液进样口6靠近末端通道11；

2)、采用紫外光诱导化学镀技术在4cm×6cm大小的PMMA盖片上集成金膜微电极，作为电喷雾电极；得带有电极面的PMMA盖片；

所述电喷雾电极包括2个电极块2和一根电极线3，所述2个电极块2分别位于PMMA盖片的中心线的两端，且2个电极块2通过电极线3相连通；

3)、将带有通道的PMMA基片以末端通道11(PMMA基片的中心线)为角平分线切割形成尖角；

带有电极的PMMA盖片切割形成与PMMA基片的尖角相吻合的尖角；

将上述PMMA基片和PMMA盖片对齐贴紧(使通道面与电极面贴合)，在研磨机上打磨至切面对齐(即，使PMMA盖片上的尖角与PMMA基片的尖角完全吻合)；

4)、将步骤3)所得的切割后PMMA基片(通道面朝上)和切割后PMMA盖片(电极面朝上)均置于紫外灯(能产生臭氧的低压汞灯，其辐射的主要紫外光为254nm)下，进行紫外光辐射处理；于2.10mW/cm²的辐射强度下辐射2h。

备注说明：紫外光处理后PMMA表面会生成羧基等活性基团，这些基团有利于后续步骤中两者的封合。

5)、将步骤4)所得的辐射处理后PMMA基片和辐射处理后PMMA盖片对准、贴合，施加1Mpa压力30min从而实现封合，得PMMA芯片；所述通道面与电极面相贴合(即，PMMA基片的正面与PMMA盖片的正面相贴合)，PMMA基片的中心线与PMMA盖片的中心线相重合，从而实现形成PMMA基片尖角的两个斜面与形成PMMA盖片尖角的两个斜面相对应的吻合，所述电极线3垂直横跨末端通道11；

打磨PMMA芯片尖角(由PMMA基片尖角和PMMA盖片尖角组合形成)的两个侧面，至PMMA基片与PMMA盖片间的缝隙消失，上下两片PMMA(即，PMMA基片和PMMA盖片)的侧面完全在一个平面，然后抛光至此平面高度光滑；

打磨芯片尖角(尖端)的上下两个面，至芯片尖端厚度约为0.7mm，抛光至上下两个面高度光滑。从而最终实现加工成以通道末端11为中心的尖嘴，作为电喷雾喷嘴4；所述电喷雾喷嘴4与末端通道11相连通；因此；样品进样口5和辅助溶液进样口6也最终与电喷雾喷嘴4相通。

电极线3与末端通道11的交叉点7距离电喷雾喷嘴4为0.5cm，辅助溶液进样口6与末端通道11的交叉点距离电喷雾喷嘴4为0.5-1cm。

备注说明：由于PMMA盖片的宽度大于PMMA基片的宽度，因此，PMMA盖片上的2个电极块2均不会被PMMA基片所完全覆盖；从而确保实际工作时电极夹能夹住电极块2进行施加电压。

6)、先通过样品进样口5向微型通道1内连续泵入0.36mol/L的乙二胺溶液10min(此时微型通道1内充满乙二胺溶液)，停泵。用封口膜封住通道口(即，同时封住进样口5、辅助溶液进样口6、电喷雾喷嘴4)以防止溶液挥干，室温反应3h。反应结束后，去除封口膜，用纯净水冲洗通道10min(从而确保未反应的乙二胺溶液被全部排出)；

所述0.36mol/L的乙二胺溶液的配制方法为：将0.36mol的乙二胺、50mmol的EDC，用100mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至1L。

接着，继续通过样品进样口5向微型通道1内连续泵入5％戊二醛溶液10min，停泵。用封口膜封住通道口以防止溶液挥干，室温过夜(12h)反应。反应结束后，去除封口膜，用50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液冲洗通道10min；

上述5％戊二醛溶液的配制方法为：将戊二醛与50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液按照5:95的体积比进行混合。

最后，通过样品进样口5向微型通道1内连续泵入1mg/mL胰蛋白酶溶液10min，停泵。用封口膜封住通道口以防止溶液挥干，4℃下反应24h。反应结束后，去除封口膜，用超纯水冲洗通道10min，即可得到集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极，可与ESI质谱直接联用的PMMA芯片。PMMA芯片片需4℃下密封保存。

上述胰蛋白酶溶液的配制方法为：将5mg胰蛋白酶用50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至5mL。

实验1：将实施例1制备的PMMA芯片与质谱联用，进行蛋白质的在线酶解-在线质谱检测：

本实施以采用可与ESI质谱直接联用的PMMA芯片进行蛋白质在线酶解-在线质谱检测为例做详细说明。其步骤为：

1.通过样品进样口5向微型通道1内，以1μL/min的流速连续泵入超纯水20min，冲洗微型通道1；

2.固定PMMA芯片，使电喷雾喷嘴4与质谱进样口之间距离约为3mm；

3.通过样品进样口5向微型通道1内，以100nL/min的流速连续泵入样品溶液(以100μg/mL细胞色素c溶液为例，pH＝8.0,2mmol/L NH₄HCO₃配制)，进行酶解。同时在辅助溶液进样口6向微型通道1内，以600nL/min流速连续泵入含有0.5％乙酸的甲醇溶液辅助喷雾；

4.采用正离子ESI-MS模式，在电极块2与质谱仪之间施加约3kV喷雾电压。调节喷雾电压至电喷雾稳定，即可得到酶解样品的质谱信号。如图5所述。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。