糖蛋白质谱分析和过甲酸氧化用于蛋白质组学的方法学研究

摘要

过甲酸氧化是一种应用广泛的打开二硫键的方法。论文的第一部分系统地研究了过甲酸氧化作为一种样品前处理方法用于蛋白质组学相关研究的可能性。实验发现了过甲酸氧化过程中除主要反应即半胱氨酸氧化成其磺酸的形式、蛋氨酸氧化成其砜的形式之外的一些副反应。这些副反应包括天冬酰胺残基和色氨酸残基C-端肽键的断裂、半胱氨酸的一个类似β-消除的反应、赖氨酸ε-氨基的甲酰化以及酪氨酸的氯化和氧化反应。样品的极端复杂性和串联质谱图的质量差是蛋白质组学研究技术中面临的两个突出问题。基于过甲酸氧化开发了一种针对这两个问题的蛋白质组学研究策略。首先，蛋白质经过甲酸氧化后经胰蛋白酶消化得到肽段，利用含半胱氨酸肽段由于过甲酸氧化造成的磺酸基团的电负性，在强阳离子交换的条件下选择性的富集合有半胱氨酸的肽，从而简化了样品体系；然后，利用MALDI-TOF/TOF对所得肽段进行质谱分析，磺酸肽表现出更高的裂解效率和更简单的串联图谱，从而解决了串联图谱质量差的问题。文中利用牛血清白蛋白展示了这种方法的可行性。 糖基化是一种普遍存在的翻译后修饰，对蛋白质的结构与功能有着重要的影响。因此，糖基化也成为蛋白质组学研究中的一个重要领域。但是，糖基化是一个高度复杂的动态的过程，导致合成的糖链具有极大的不均一性，使多糖成为最复杂的一种生物大分子之一。因此，尽管具有非常重要的生物学意义，阐明蛋白质的糖基化仍然是蛋白质组学面临的一大挑战。论文的第二部分以重组人尿激酶原(rhProUK)和重组人血小板源生长因子(rhPDGF)为研究对象，以生物质谱为主要研究手段，探索了基因重组糖蛋白类药物的质量肽图分析、总糖含量、唾液酸含量以及糖基化位点的确定等重要指标的分析方法，为该类药物的质量评价提供了重要的参考依据。这些分析方法的研究为从蛋白质组学水平进行糖基化研究做了方法学上的准备。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分过甲酸氧化用于蛋白质组学的方法学研究

第一章过甲酸氧化过程中降解产物的鉴定

1.1实验部分

1.2结果与讨论

1.3结论

第二章从过甲酸氧化的蛋白质的胰酶解产物中分离鉴定磺酸肽

2.1实验部分

2.2结果与讨论

2.3结论

第二部分糖蛋白质谱分析方法的考察及应用

第三章基因重组糖蛋白-人尿激酶原糖基化修饰的质谱测定

3.1材料和方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章基因重组糖蛋白-人血小板源生长因子的质谱测定

4.1实验部分

4.2结果与分析

4.3结论

结语

参考文献

致谢

在学期间发表的论文

发表文章一：蛋白质糖基化分析方法及其在蛋白质组学中的应用

发表文章二：Identification of degradation products formed during performic oxidation of peptides and proteins by high-performancew liquid chromatography with matrix-assisted laser desorption/ionization and tandem mass spectrometry

发表文章三：基因重组糖蛋白-人尿激酶原糖基化修饰的质谱测定