快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法及专用引物

摘要

本发明公开了一种用逆转录PCR(RT‑PCR)技术和实时荧光定量RT‑PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸)敏感细胞系的方法。包括1)获得ST单克隆细胞；2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT‑PCR技术确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；4)用实时荧光定量RT‑PCR技术确定拷贝数在10

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种用RT-PCR技术(即逆转录PCR)和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、热性、高度传染性和致死性的烈性传染病，俗称烂肠瘟，早年又称猪霍乱。该病是发生最多、危害最大、流行最广的猪传染病。近年来中国因病死亡猪数占饲养总数的8％-10％，其中三分之一是由猪瘟引起的。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，我国也将猪瘟定为一类烈性传染病，属于危害严重、需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭的动物疫病之一。

猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性。目前，疫苗接种是预防控制猪瘟的重要手段，许多国家和地区已先后宣布消灭了猪瘟。中国猪瘟兔化弱毒疫苗以其具有诱生免疫反应快，对种猪、乳猪无残余毒力，免疫猪可抵抗猪瘟强毒株的攻击等特点，成为国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗。

目前用于免疫的猪瘟疫苗主要有四种：脾淋苗、乳兔苗、细胞苗和联苗。这四种疫苗的猪瘟毒株均是中国系猪瘟兔化弱毒株(简称C株)。猪瘟脾淋苗和乳兔苗是兔源组织苗，是利用成兔和乳兔的活组织生产制备的。由于猪瘟脾淋苗和乳兔苗使用动物的免疫器官做成，虽然免疫效果较好，但是成本高，容易污染，产量低，批次间差异大，而且免疫注射后应激反应大。而猪瘟细胞苗具有生产成本低，适用于批量生产，批间差异小，副反应低等特点越来越受到重视。但是由于在猪瘟细胞苗生产过程中，细胞产毒效果差，病毒滴度较低，导致疫苗成品的免疫效果不及猪瘟脾淋苗。因此，筛选对猪瘟兔化弱毒株敏感的细胞系，以提高病毒滴度对猪瘟细胞苗的生产具有现实意义，并可带来经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种用RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸细胞)敏感细胞系的方法，以克服现有猪瘟细胞疫苗生产中存在的免疫效果不理想的缺陷。

本发明所提供的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，主要包括以下步骤：

1)获得ST单克隆细胞；

2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；

3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT-PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；

4)用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测猪瘟兔化弱毒液，以确定猪瘟兔化弱毒株(C株)的拷贝数，猪瘟兔化弱毒株(C株)能够持续感染细胞，并且确定在第三批次以及以后批次收获的病毒液的拷贝数能够维持在10⁶拷贝(copies)/mL的是猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系。

在上述方法中，所述步骤1)ST单克隆细胞的获得方法为：将无外源病毒污染的ST细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，用0.2％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的胰蛋白酶消化成单个散在的细胞后进行细胞计数，然后用为15％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为10-100cells/mL，用移液器加样至96孔板，每孔100μL，显微镜下观察，记录并标记只含有一个细胞的孔，每天观察，细胞数量增加后，再逐步扩大培养，得到ST单克隆细胞。

所述步骤2)中接种猪瘟兔化弱毒株(C株)的方法为：将猪瘟兔化弱毒株(C株)接种ST单克隆细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每48h收获病毒液，连续收获8个批次毒液，每个批次病毒液置于-80℃短期保存待检。

所述步骤3)中的RT-PCR鉴定方法，可包括以下步骤：

3.1)提取猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的总RNA；

3.2)以病毒液的总RNA为模板逆转录合成其cDNA；

3.3)RT-PCR检测：以cDNA为模板，在RT-PCR特异性引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为383bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。

所述步骤3.2)中是对所提取的RNA用反转录试剂盒进行两步法反转录，第一步反应体系为：Oligo dT Primer(50uM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，TemplateRNA 2μL，Rnase free ddH₂O>204.5μL，反应条件为：混匀，42℃30-60min，95℃5min，冰上冷却。

所述步骤3.3)中用于RT-PCR鉴定的特异性引物，是以猪瘟兔化弱毒株(C株)的全基因组的特异性保守区域内自5’端第54-436bp(序列表中SEQ ID NO：1)为对象设计的，目的片段长383bp，用以检测ST单克隆细胞是否能够持续感染猪瘟兔化弱毒株(C株)。

所述步骤3.3)中用于RT-PCR鉴定的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

所述步骤3.3)中的RT-PCR反应体系为：模板cDNA 1μL，2×Taq PCR Master MIX12.5μL，上游引物(10μM/μL)1μL，下游引物(10μM/μL)1μL，加Rnase freeH₂O至25μL；所述RT-PCR的反应条件为：先94℃预变性，5min；然后94℃变性30s，56℃-64℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

所述步骤4)中的实时荧光定量RT-PCR检测方法，可包括以下步骤：

4.1)建立标准曲线：将猪瘟病毒(C株)作为标准品，梯度稀释成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

4.2)提取猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行猪瘟病毒(C株)实时荧光定量RT-PCR检测；

4.3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的猪瘟病毒(C株)进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有猪瘟病毒，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪瘟病毒，再根据样品的荧光信号强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含的猪瘟病毒的拷贝数。

所述步骤4.1)和4.2)中用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是以猪瘟兔化弱毒株(C株)的全基因组的特异性保守区域内自5’端第151-243bp为对象设计的，目的片段长93bp(序列表中SEQ ID NO：4)，用以确定病毒的拷贝数(实时荧光定量PCR扩增的目的片段93bp是步骤3.3RT-PCR扩增产物的一部分)。

所述步骤4.1)和4.2)中用于实时荧光定量RT-PCR检测的上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

所述步骤4.1)和4.2)中用于实时荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA；为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。

所述步骤4.1)和4.2)中的实时荧光定量RT-PCR的反应体系为：模板RNA 2μL，2×RT-PCR buffer 12.5μL，上游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，下游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，Mix酶0.5μL，HS酶0.5μL，TaqMan探针(20μM/μL)0.5μL(10ng)，加Rnase free H₂O至25μL；实时荧光定量PCR的反应条件为：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，58℃40s，共45个循环。

本发明另一目的是提供快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系方法中的专用引物，包括：

步骤3)中T-PCR技术进行初步鉴定的上游引物，其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；下游引物，其具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或

步骤4)中实时荧光定量RT-PCR技术定量检测的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示；下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；TaqMan探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

本发明提供了一种用RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸细胞)敏感细胞系的方法。本发明能够快速的为猪瘟弱毒疫苗的生产提供敏感细胞系，缩短了疫苗生产周期并降低了疫苗成本，解决了现今猪瘟细胞疫苗由于猪瘟病毒滴度低导致的疫苗免疫效果不理想的难题。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明筛选的ST敏感细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒株(C株)，能够连续多次收获猪瘟兔化弱毒液，生产过程中可以直接使用；

2、本发明建立的筛选ST敏感细胞系的方法是细胞进行单克隆后，先用RT-PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)，再用实时荧光定量PCR技术定量检测猪瘟兔化弱毒液，比常规的免疫荧光方法能够更加快速地选育猪瘟ST敏感细胞系；

3、本发明筛选的ST敏感细胞系是针对猪瘟疫苗使用的毒株(猪瘟兔化弱毒株(C株))，能够直接应用于猪瘟疫苗生产；

4、本发明筛选的ST细胞系对猪瘟病毒敏感，并且可高滴度持续感染猪瘟病毒，有利于克服当前猪瘟病毒细胞培养滴度低的难题，可缩短疫苗生产周期并降低疫苗成本，对猪瘟疫苗的生产具有现实意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为C4株单个ST细胞在96孔板中的生长状态

图2为E11株单个ST细胞在96孔板中的生长状态

图3为标准品的实时荧光定量RT-PCR扩增曲线

图4为实时荧光定量RT-PCR的标准曲线

图5为D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株猪瘟兔化弱毒株(C株)拷贝数的实时荧光定量检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物和TaqMan探针由宝生物工程(大连)有限公司公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例、快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系

本发明用RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸细胞)敏感细胞系的方法，包括以下步骤：

1)获得ST单克隆细胞

将无外源病毒污染的ST细胞(购自美国菌种保藏中心(ATCC))在37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，用0.2％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的胰蛋白酶消化成单个散在的细胞后进行细胞计数，然后用15％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为10-100个细胞(cells)/mL(一般情况下，胰酶消化液以及血清添加量只需标出比例即可)，用移液器加样至96孔板，每孔100μL，显微镜下观察，记录并标记只含有一个细胞的孔，分别标记为D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株，每天观察，其中，C4株、E11株单个ST细胞的生长状态如图1、图2所示。细胞数量增加后逐步扩大培养，先扩大培养至24孔板，再扩大培养至6孔板，最后将克隆的ST细胞接种至25cm²细胞培养瓶中，将DMEM培养基中的血清添加量改为10％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)，进行细胞常规培养，得到ST单克隆细胞。

2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)

将D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株ST单克隆细胞扩增培养至75cm²细胞培养瓶中，均按1％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)病毒量接种猪瘟兔化弱毒株(C株，购自中国兽医药品监察所)，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每48h收获病毒液，连续收获8批次(猪瘟病毒不引起细胞病变，可连续收获毒液，每一收为一个批次)。

3)提取连续收获的8个批次病毒液的RNA，用RT-PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)，具体方法包括以下步骤：

3.1)提取病毒液的总RNA

对各批次收获的病毒液取样，用TAKARA公司的TaKaRaRNAiso Reagent试剂盒提取总RNA，具体步骤如下：

3.1.1移液器吸取200μL病毒液，加入1mL RNAiso Reagent，混合均匀。

3.1.2向上述步骤3.1.1的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力震荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5分钟。

3.1.312,000g、4℃离心15分钟。

3.1.4从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。

3.1.5向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10分钟。

3.1.612,000g、4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

3.1.7RNA沉淀的清洗小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lmL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g、4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。

3.1.8RNA的溶解室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后保存备用。

3.2以病毒液的RNA为模板逆转录合成其cDNA

对所提取的RNA用反转录试剂盒进行两步法反转录，第一步反应体系为：Oligo dTPrimer(50uM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，Template RNA 2μL，Rnasefree ddH₂O>204.5μL，反应条件为：混匀，42℃30-60min，95℃5min，冰上冷却。

3.3RT-PCR检测

检索Genbank上的猪瘟兔化弱毒(C株)的基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析，找到猪瘟兔化弱毒(C株)全基因组的特异性保守区域，以自5’端第54-436bp区域(383bp，序列表中SEQ ID NO：1)为对象，用软件Primer Express2.0设计用于RT-PCR鉴定的专用引物，用以检测ST单克隆细胞是否能够持续感染猪瘟兔化弱毒株(C株)，引物序列如下：

RT-PCR鉴定猪瘟兔化弱毒(C株)的特异性引物：

上游引物(Forward primer)：5'-ATTTGGTTCAGGGCCTCC-3'(序列表中SEQ ID NO：2)

下游引物(Reverse primer)：5'-TCCACTCCCATTGGTTTT-3'(序列表中SEQ ID NO：3)。

以cDNA为模板，在RT-PCR专用引物的引导下进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体系为：模板cDNA 1μL，2×Taq PCR Master MIX 12.5μL，上游引物(10μM/μL)1μL，下游引物(10μM/μL)1μL，加Rnase free H₂O至25μL；所述RT-PCR的反应条件为：先94℃预变性，5min；然后94℃变性30s，56℃-64℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后对RT-PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为383bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。

经RT-PCR初步鉴定，确定所得D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)。

4)用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测病毒液，以确定病毒的拷贝数。病毒能够持续感染细胞，并且在第三批次以及以后批次收获毒液的拷贝数能够维持在10⁶copies/mL的是猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系(猪瘟病毒感染细胞有适应阶段，前两批次毒液毒价较低)，具体方法包括以下步骤：

用于实时荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针，是以猪瘟兔化弱毒(C株)全基因组的特异性保守区域内自5’端第151-243bp(长93bp，序列表中SEQ ID NO：4)为对象设计的(93bp目的片段是步骤3.3RT-PCR扩增产物383bp的一部分)，用以确定病毒的拷贝数，引物和TaqMan探针的序列如下：

上游引物(Forward primer)：5'-CCCTGGGTGGTCTAAG-3'(序列表中SEQ ID NO：5)下游引物(Reverse primer)：5'-CATGCCCTCGTCCAC-3'(序列表中SEQ ID NO：6)TaqMan探针：5’-(FAM)CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTT(TAMRA)-3’(序列表中SEQID NO：7)。

所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA；为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。

4.1建立标准曲线：将猪瘟病毒(C株)作为标准品，梯度稀释成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝(copies)/μL，每个样品做2个重复，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测。

所述步骤4.1)中的实时荧光定量RT-PCR的反应体系为：模板RNA 2μL，2×RT-PCRbuffer 12.5μL，上游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，下游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，Mix酶0.5μL，HS酶0.5μL，TaqMan探针(20μM/μL)0.5μL(10ng)，加Rnase free H₂O至25μL；实时荧光定量RT-PCR的反应条件为：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，58℃40s，共45个循环。

标准品的扩增曲线如图3所示(从左至右曲线分别对应1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝(copies)/μL浓度的标准品)，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图4(横坐标为Ct值，纵坐标为拷贝数)所示，R²＝0.999，误差小，由标准曲线得到的线性方程为：

y＝-3.394x+40.812。

4.2提取收获的8个批次的各株病毒液的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量RT-PCR检测。

所述步骤4.2)中的实时荧光定量RT-PCR的反应体系为：模板RNA 2μL，2×RT-PCRbuffer 12.5μL，上游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，下游引物(20μM/μL)0.5μL(10ng)，Mix酶0.5μL，HS酶0.5μL，TaqMan探针(20μM/μL)0.5μL(10ng)，加Rnase free H₂O至25μL；实时荧光定量PCR的反应条件为：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，58℃40s，共45个循环。

4.3根据荧光信号的变化及强度，对待测样品进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有猪瘟病毒(C株)，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪瘟病毒(C株)，再根据样品的荧光信号强度和步骤4.1)中的标准曲线，得出待测样品中所含的猪瘟病毒(C株)的拷贝数，实时荧光定量RT-PCR检测结果见表1。

结果如表1和图5所示，在所得8株ST单克隆细胞系中，C4和E11两株细胞收获的第3批次至第8批次毒液拷贝数能够维持在10⁶copies/mL，并且高峰期毒液拷贝数可达10⁷copies/mL，产毒量明显高于其它细胞株，属于猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系，可应用于猪瘟疫苗的生产。

表1猪瘟病毒(C株)实时荧光定量RT-PCR检测结果