一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法

摘要

本发明公开了一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法。通过体系优化，单倍体诱导率提高至71%。选取生长在昼夜温差10℃的健壮植株花蕾在添加了2mg/LKT的MS培养基中进行预培养。6天后从花药中部切割，避免挤压、离心等操作，使小孢子自然游离于液体培养基中，同时将花药残体保留在添加0.2mg/L2,4‑D、1mg/LKT、1mg/L6BA 和5%葡萄糖的KM培养基中与游离出的小孢子共培养。花药中部和尖部有白色愈伤组织长出后，切下愈伤组织转接到添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6‑BA、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基中，在弱光环境下进行分化培养。愈伤组织转绿出芽后进行继代和生根培养，该方法可克服基因型影响，提高了茄子单倍体诱导率。

说明书

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种基于茄子自然游离小孢子与花药共培养克服基因型影响，通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的方法。

背景技术

单倍体育种是进行种质资源创新并快速固定优良性状的最佳途径，具有育种周期短、选择效率高、克服远缘杂不亲和等优点。特别是小孢子单倍体诱导技术，近年来已成为育种工作者研究的热点。与十字花科蔬菜比较，茄果类蔬菜小孢子培养难度大，大多实验停留在愈伤组织或类胚状体阶段，成功应用的报道较少。本专利在前人研究的基础上进行了大量优化调整，旨在克服基因型影响，并进一步提高有效出愈率和成苗率，最终达到应用水平。本课题现在已通过花药看护培养使小孢子培养愈伤组织有效出愈率和成苗率由原来的7%提高到了41%。经检索，目前尚未发现基于茄子自然游离小孢子与花药共培养可克服基因型影响，最终通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的报道。

发明内容

本发明公开了一种基于茄子自然游离小孢子与花药共培养克服基因型影响，通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的方法，其特征在于如下的步骤进行：

1）种植环境：花蕾所在茄子植株为人工气候箱或是保护地栽培，夜间温度为15℃，昼夜温差达到10℃-20℃，植株健壮无病虫害；

2）花蕾标准：花蕾采集标准为花冠与萼裂处齐平，对茄至八面风节位，内部花药为黄绿色，且花冠包裹紧密。采集花蕾后用牛皮纸袋包好放置在4℃冰箱24小时后开始进行花药预培养；

3）预培养特点：预培养基为添加了2mg/LKT（激动素）的MS培养基，pH 5.8，花药预培养后放置于36℃光照培养箱中暗培养6天；

4）自然游离与共培养：机械切割花药，避免挤压和离心，使小孢子自然游离于液体培养基中，同时将花药残体保留在液体培养基中与游离出的小孢子进行共培养；

培养基为添加了0.2mg/L2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、1mg/LKT（激动素）、1mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）和5%葡萄糖的KM培养基，PH 5.8；

5) 培养条件：小孢子培养条件为25℃暗培养60-90天，当花药中部和尖部有白色愈伤组织长出，达到3毫米以上直径就可转接到分化培养基中25℃弱光培养；所述的分化培养基为添加了0.01mg/LNAA（萘乙酸）、2mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基；

6) 当分化培养基中愈伤组织转绿就可放置在光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上进行培养，每间隔15天切割继代一次，一个月后可长出绿色芽苗；

7）提前配制生根培养基，主要成分为1/2MS+0.2mg/LIBA（吲哚丁酸）+ 5g/L琼脂+3%蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8，当绿色芽苗长至1-3厘米高时即可转接至生根培养基，放置于光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上培养；

8）8-12天左右切口处可见不定根生长，20天后长成带根小苗，之后用流式细胞仪检测每株小孢子再生苗，确定再生苗倍性，如为单倍体及时进行加倍处理。

本发明首先采集新鲜花蕾，花蕾所在茄子植株为人工气候箱或是保护地栽培，夜间温度为15℃，昼夜温差10℃-20℃，健壮无病虫害。花蕾采集标准为花冠与萼裂处齐平，对茄至八面风节位，内部花药为黄绿色，且花冠包裹紧密。采集花蕾后用牛皮纸袋包好放置在4℃冰箱24小时后开始进行花药预培养。预培养基为添加了2mg/LKT的MS培养基，PH5.8，花药预培养后放置于36℃光照培养箱中暗培养6天。之后进行小孢子游离培养，培养基为添加了0.2mg/L2,4-D、1mg/LKT、1mg/L6BA 和5%葡萄糖的KM培养基，pH 5.8。游离方法采用机械切割花药后，将花药残体保留在液体培养基中与游离出的小孢子进行共培养。小孢子培养条件为25℃暗培养30-90天，当花药中部和尖部有白色愈伤组织长出，达到3毫米以上直径就可转接到分化培养基中25℃弱光培养。分化培养基为添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6-BA、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基。当分化培养基中愈伤组织转绿就可放置在光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上进行培养。每间隔15天切割继代一次，一个月后可长出绿色芽苗。提前配制生根培养基，主要成分为1/2MS+0.2mg/LIBA+ 5g/L琼脂+3%蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8。当绿色芽苗长至1-3厘米高时即可转接至生根培养基，放置于光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上培养。8-12天切口处可见不定根生长，20天后长成带根小苗。之后用流式细胞仪检测每株小孢子再生苗，确定再生苗倍性，如为单倍体及时进行加倍处理。本发明的实验对象为茄子F1杂交种（有市售）。

本发明首次实现了克服基因型影响通过游离小孢子培养诱导单倍体的目标。采用自然游离可避免传统方法离心挤压等操作过程对小孢子的刺激，提高游离小孢子成活率；同时，一些不易诱导基因型通过花药共培养可以成功诱导愈伤组织，分化成苗。首先对供体材料种植环境和季节提出严格要求，第二步通过改变激动素（KT）浓度进行花药预培养，第三步通过花药共培养游离小孢子提高愈伤组织诱导率，第四步采取暗培养等措施提高愈伤组织分化率，最后利用现有技术生根成苗，进行倍性鉴定。

本发明进一步公开了茄子自然游离小孢子与花药共培养高效诱导单倍体方法在提高茄子单倍体诱导率方面的应用。本发明采用高低温差异生长诱导小孢子脱离二倍体途径向单倍体途径发展，通过激动素影响小孢子发育途径，自然游离和花药共培养提高游离小孢子成活率进而诱导出愈伤组织，愈伤组织通过暗培养等措施提高分化率，最后生根成苗。

本发明的原理在于：与十字花科蔬菜比较，茄子小孢子培养难度大，大多试验停留在愈伤组织或类胚状体阶段，成功应用的报道较少。主要原因是小孢子游离后胚诱导困难，诱导频率低，诱导出的胚状体发育能力较差，再生植株诱导频率更低。茄子小孢子培养依然存在基因型障碍，一部分关键育种资源因基因型不易诱导而出现小孢子培养诱导率低，发育迟缓甚至停滞，严重制约着该技术的应用推广。第二是小孢子游离后大量死亡，直接影响出胚率，导致茄子出胚率一般保持在10%以下。第三是茄子愈伤组织和胚状体分化出芽困难，影响植株再生。

通过实验发现，日温25-32℃、夜温12-15℃，温差10-20℃生长的供体植株，产生的小孢子细胞生理活性高、发育同步性强，而且诱导率还高。健壮且生长旺盛植株的花药具有最大的孤雄生殖能力。从季节上，冬、春季更适于花药的培养可能是由于温度与光周期共同作用的原因。低夜温可能改变了供体小孢子的发育方向，使小孢子偏离配子体发育方向并促使其脱分化形成愈伤组织。小孢子处于单核靠边期，对培养条件的诱导敏感，能很好启动胚胎发生途径。热激处理促使花药的极性分布从形态上发生改变，改变了小孢子的分裂方式以及发育途径，导致小孢子配子体发育方向发生偏离。试验发现，经过6 d热激处理的小孢子群体膨大率最高且活力最高。

通过药壁组织与小孢子共培养，愈伤组织诱导率可以快速提高。花药在液体培养基经过一段时间的培养，药室自然开裂，小孢子从花药里散落出来形成愈伤组织。花药组织在胚状体形成过程中也起着重要作用。试验证实小孢子与药壁组织共培养7天，可以明显提高愈伤组织的诱导频率。

KT、6-BA，IAA主要用来诱导细胞分裂以及根分化，而NAA和2,4-D在促使细胞分裂、胚状体形成和愈伤组织生根生芽方面应用较广。有报道证实活性炭能够提高小孢子愈伤组织的诱导率，因为可以吸附培养基、空气和试验材料所释放的抑制物质，而且活性碳能吸附和清除小孢子脱分化时产生的有毒物质。但是许多愈伤组织分化出芽存在障碍，成苗率低。采用暗培养与弱光培养相结合措施，可以大大提高愈伤组织分化率。

本发明公开的基于茄子花药看护培养克服基因型影响通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）克服基因型影响：所有茄子基因型材料，包括难诱导材料，只要种植环境和季节符合要求，花蕾健壮，采用本专利方法都可以成功诱导单倍体。小孢子培养愈伤组织有效出愈率和成苗率由原来的7%提高到了41%。

（2）单倍体诱导率高，结果可靠：实验证实，利用本方法诱导单倍体，诱导率可达45%以上，流式细胞仪检测倍性结果可靠。

（3）成本低：组织培养技术所用激素种类少，而且相对廉价。

附图说明：

图1切割后的花药与自然游离的小孢子共培养图；

图2游离小孢子产生愈伤组织图；

图3愈伤组织分化出绿色芽点图；

图4绿色芽点分化出小苗图；

图5植株再生图。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明所用到的杂交种来源于包括：斯卡特、圆杂471、改良绿罐种子均由市售。

实施例1

茄子杂交种斯卡特单倍体诱导

1、首先采集新鲜花蕾，花蕾所在茄子植株为人工气候箱或是保护地栽培，夜间温度为15℃，昼夜温差10℃-20℃，健壮无病虫害。花蕾采集标准为花冠与萼裂处齐平，对茄至八面风节位，内部花药为黄绿色，且花冠包裹紧密。采集花蕾后用牛皮纸袋包好放置在4℃冰箱24小时后开始进行花药预培养。

2、预培养基为添加了2mg/LKT的MS培养基，pH 5.8，花药预培养后放置于36℃光照培养箱中暗培养6天。

3、之后进行小孢子游离培养，培养基为添加了0.2mg/L2,4-D、1mg/LKT、1mg/L6BA和5%葡萄糖的KM培养基，pH5.8。游离方法采用机械切割花药后，将花药残体保留在液体培养基中与游离出的小孢子进行共培养。小孢子培养条件为25℃暗培养63天。

4、当花药中部和尖部有白色愈伤组织长出，达到3毫米以上直径就可转接到分化培养基中25℃弱光培养。分化培养基为添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6-BA、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基。

5、当分化培养基中愈伤组织转绿就可放置在光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上进行培养。每间隔15天切割继代一次，一个月后可长出绿色芽苗。

6、提前配制生根培养基，主要成分为1/2MS+0.2mg/LIBA+ 5g/L琼脂+3%蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8。当绿色芽苗长至1-3厘米高时即可转接至生根培养基，放置于光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上培养。8-12天左右陆续切口处见不定根生长，20天后长成带根小苗。

7、之后用流式细胞仪检测每株小孢子再生苗，确定再生苗倍性，如为单倍体及时进行加倍处理。

附表：

表1 MS预培养基配方（已知的通用配方）

表2 KM培养基配方（已知的通用配方）

表3 中英文对照表

花药有效出愈率和愈伤组织出芽率见表4和表5，成苗率100%。

实施例2

茄子杂交种圆杂471单倍体诱导

同实施例1，不同的是小孢子培养条件为25℃暗培养74天，花药有效出愈率和愈伤组织出芽率见表4和表5，成苗率100%。

实施例3

茄子杂交种改良绿罐单倍体诱导

同实施例1，不同的是小孢子培养条件为25℃暗培养86天，花药有效出愈率和愈伤组织出芽率见表4和表5，成苗率100%。

表4花药有效出愈率（%）

表5愈伤组织出芽率（%）

实施例4

表6茄子小孢子游离诱导单倍体方法比较试验

结论：

本发明公开的基于茄子自然游离小孢子与花药共培养高效诱导单倍体的方法与现有技术相比有以下三个特点。

（1）克服基因型影响

（2）单倍体诱导率高，结果可靠

（3）成本低。