维罗纳假单胞菌ZW-A及其在生产4-异丙基苯甲酸中的应用

摘要

本发明公开了一种维罗纳假单胞菌ZW‑A及其在生产4‑异丙基苯甲酸中的应用。Pseudomonas sp.ZW‑A可在好氧条件利用蒎烯类物质为唯一碳源，代谢过程中实现了4‑异丙基苯甲酸的积累。该方法与化学合成法相比，具有条件温和、无二次污染等特点，是一种绿色的生产方法。它在2d内能利用100mg/L的α‑蒎烯生产4‑异丙基苯甲酸24mg/L。该降解菌的发现对4‑异丙基苯甲酸的绿色生产具有重要意义。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种4-异丙基苯甲酸的制备，特别涉及一种利用维罗纳假单胞菌ZW-A制备4-异丙基苯甲酸的方法。

(二)背景技术

4-异丙基苯甲酸(C₁₀H₁₂O₂)又叫枯茗酸，是一种重要的精细化学品，在木材工业上用作防腐剂和保护剂，还是免清洗助焊剂和某些高分子热敏电阻的原材料。近年来，4-异丙基苯甲酸在医药等化学工业中得到了广泛应用，被视为重要的化工原料。

4-异丙基苯甲酸的生产合成主要有两种途径：一种是以异丙苯作为原料，通过酰化或者甲基化合成；另一种是以对异丙基甲苯，即对伞花烃作为原料，醋酸钴为催化剂，醋酸为溶剂，在氧气或空气中氧化而成。利用上述化学合成过程生产4-异丙基苯甲酸，不仅涉及原料较多，而且反应需在高温高压下进行；此外，化学合成过程产物得率不高，容易产生大量的环境污染(如原料、中间副产物、废催化剂等)，是一种既不经济也不环保的生产方法。

蒎烯类物质(如α-蒎烯，C₁₀H₁₆)是一种挥发性有机化合物，广泛应用于木材加工业、造纸业和制药业。随着工业的发展，α-蒎烯被随意排放进入大气，给环境造成了极大的危害。研究者发现，一些微生物能降解α-蒎烯，实现了蒎烯类物质的生物净化。同时，随着微生物代谢有机物的中间产物被检测到，研究者提出了利用微生物生产化学品的思路，可以替代传统的化学合成技术。本发明以蒎烯类烃类物质为原材料，通过微生物的代谢作用，从而实现了4-异丙基苯甲酸的积累，耗能低，产污少。该微生物还可用于含α-蒎烯废气的净化过程，并得到4-异丙基苯甲酸，实现废物的资源化，具有广泛的工业应用前景。

经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用维罗纳假单胞菌(Pseudomonasveronii)生产4-异丙基苯甲酸的报道。该微生物的获得对工业原料-4-异丙基苯甲酸的绿色化生产具有重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种维罗纳假单胞菌ZW-A及制备在4-异丙基苯甲酸中的应用，解决了利用传统化学方法生产4-异丙基苯甲酸需要原料多、反应条件苛刻、原料利用率低、易产生二次污染等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株-维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW-A，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2015788，保藏日期2015年12月28日，地址：中国武汉，武汉大学，430072。该菌株的特征为：菌落呈乳白色，不透明，边缘光滑，具有黏性。它生长最适pH值为7.0-7.5，最适温度为28-32℃。

本发明还提供一种所述维罗纳假单胞菌ZW-A在生产4-异丙基苯甲酸中的应用，具体所述的应用为：以蒎烯烃化合物为底物，以维罗纳假单胞菌ZW-A为酶源，以无机盐培养基为反应介质，在20-35℃、pH值5-7、好氧/兼性好氧的条件下进行培养，反应完全后，将反应液分离纯化，获得4-异丙基苯甲酸。

进一步，所述蒎烯烃化合物为石油工业污染物，优选下列之一：α-蒎烯、β-蒎烯、对异丙基甲苯和对异丙基苯甲醇。

进一步，所述无机盐培养基终浓度组成为：KH₂PO₄234mg·L^-1，K₂HPO₄942mg·L^-1，NaNO₃1700mg·L^-1，NH₄Cl>-1，MgCl₂·6H₂O>-1，CaCl₂·2H₂O>-1，FeCl₃16.2mg·L^-1，微量母液5mL·L^-1，溶剂为蒸馏水，pH>288mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O>-1，KI>-1，Na₂MoO₄·2H₂O>-1，H₃BO₃50mg·L^-1，溶剂为蒸馏水。

进一步，所述无机盐培养基还可以为改良无机盐培养基，所述改良无机盐培养基终浓度组成为：KH₂PO₄234mg·L^-1，K₂HPO₄942mg·L^-1，NaNO₃1700mg·L^-1，NH₄Cl>-1，MgSO₄0.1～0.5g·L^-1，CaCl₂·2H₂O>-1，FeCl₃>-1，微量母液5mL·L^-1，溶剂为蒸馏水，pH>288mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O60mg·L^-1，KI>-1，Na₂MoO₄·2H₂O>-1，H₃BO₃50mg·L^-1，溶剂为蒸馏水。优选所述MgSO₄0.307g·L^-1。

进一步，所述底物加入终浓度为100mg/L。

进一步，所述维罗纳假单胞菌ZW-A以菌悬液的形式加入，所述菌悬液制备方法为：将Pseudomonas veronii ZW-A接种至斜面培养基，在20-35℃培养3-5d，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6；

将斜面菌体接种至种子培养基，在20-30℃培养2-4d，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成同无机盐培养基，即KH₂PO₄234mg·L^-1，K₂HPO₄942mg·L^-1，NaNO₃1700mg·L^-1，NH₄Cl>-1，MgCl₂·6H₂O>-1，CaCl₂·2H₂O>-1，FeCl₃16.2mg·L^-1，微量母液5mL·L^-1，溶剂为蒸馏水，pH>288mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O>-1，KI>-1，Na₂MoO₄·2H₂O>-1，H₃BO₃50mg·L^-1，溶剂为蒸馏水。

进一步，所述菌悬液加入培养基至OD₆₀₀为0.1。

所述维罗纳假单胞菌ZW-A在废水中最佳培养温度为30℃、最佳pH7.2，好氧或兼性好氧。所述假单胞菌ZW-A在2d内均能不同程度地利用β-蒎烯、对异丙基甲苯等物质实现4-异丙基苯甲酸的生产。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的Pseudomonas veroniiZW-A来自诱变突变株，能适应复杂的实际条件，能利用多种底物绿色无污染生产4-异丙基苯甲酸，并在蒎烯类结构物质的废水废气中实现4-异丙基苯甲酸的积累，变废物为工业原料，能实现含蒎烯类废水废气的资源化，既消除了污染又变废为宝，实现了废物的资源化。Pseudomonas sp.ZW-A可在好氧条件利用蒎烯类物质为唯一碳源，代谢过程中实现了4-异丙基苯甲酸的积累。该方法与化学合成法相比，具有条件温和、无二次污染等特点，是一种绿色的生产方法。它在2d内能利用100mg/L的α-蒎烯生产4-异丙基苯甲酸24mg/L。该降解菌的发现对4-异丙基苯甲酸的绿色生产具有重要意义。

(四)附图说明

图1影印平板法筛选到的Pseudomonas veronii ZW-A照片，A为LB平板，BMN平板；

图2 Pseudomonas veronii ZW-A、ZW及空白对照α-蒎烯代谢率变化曲线；

图3 Pseudomonas veronii ZW-A、ZW利用α-蒎烯实现4-异丙基苯甲酸的积累比较曲线；

图4不同培养基配比下Pseudomonas veronii ZW-A代谢α-蒎烯性能比较；

图5不同培养基配比下Pseudomonas veronii ZW-A积累4-异丙基苯甲酸的性能比较。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用无机盐培养基终浓度组成为：KH₂PO₄234mg·L^-1，K₂HPO₄942mg·L^-1，NaNO₃1700mg·L^-1，NH₄Cl>-1，MgCl₂·6H₂O>-1，CaCl₂·2H₂O11.1mg·L^-1，FeCl₃16.2mg·L^-1，微量母液5mL·L^-1，溶剂为蒸馏水，pH>288mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O>-1，KI>-1，Na₂MoO₄·2H₂O100mg·L^-1，H₃BO₃50mg·L^-1，溶剂为蒸馏水。

改良无机盐培养基终浓度组成为：KH₂PO₄234mg·L^-1，K₂HPO₄>-1，NaNO₃1700mg·L^-1，NH₄Cl>-1，MgSO₄0.1～0.5g·L^-1，CaCl₂·2H₂O>-1，FeCl₃16.2mg·L^-1，微量母液5mL·L^-1，溶剂为蒸馏水，pH>288mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O>-1，KI>-1，Na₂MoO₄·2H₂O>-1，H₃BO₃50mg·L^-1，溶剂为蒸馏水。

实施例1.Pseudomonas veronii ZW-A的获得和鉴定

Pseudomonas veronii ZW-A是从本实验室现有菌株Pseudomonas sp.转座子诱变而获得的突变株。具体步骤如下：

将转座供体菌Escherichia coli SM10_λpir质粒pSC123上的转座序列转移至受体菌Pseudomonas>600＝0.5取200μL；OD₆₀₀＝1.0取50μL)涂布于含100mg/L氨苄青霉素和50mg/L卡那霉素的双抗LB平板上，于30℃倒置培养；培养一定时间(3d或7d)后，待双抗LB平板有单菌落出现，即为转座子诱变菌株。

上述经双亲结合产生的转座子诱变突变株，再利用影印平板(replica-platingmethod)的方法，进一步筛选4-异丙基苯甲酸代谢失活突变株，具体操作步骤如下：

将上述平板出现的单菌落，用牙签接种到一块新的双抗LB平板，同时对应接种到另一块双抗MN平板(氨苄青霉素浓度为100mg/L，卡那霉素浓度为50mg/L)，使同一菌落在两块平板上的位置相同；将LB平板和MN平板于30℃倒置培养一段时间(3d或7d)后，对比两平板，取在LB平板上生长且在MN平板上不生长菌落(图1)，于新的双抗LB平板和双抗MN平板再次影印，验证生长能力；经生长验证后的菌落(在LB平板上生长且在MN平板上不生长菌落)，即为4-异丙基苯甲酸代谢失活目标突变株，记为菌株ZW-A。菌落特征为菌株的特征为：菌落呈乳白色，不透明，边缘光滑，具有黏性。它生长最适pH值为7.0-7.5，最适温度为28-32℃。

通过16S rRNA序列(SEQ ID NO.1所示)分析，确定菌株ZW-A为Pseudomonasveronii。具体步骤如下：

采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌株ZW-A的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：

BSF8/20：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'

BSR1541/20：5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'

PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(上海英潍捷基)，测序结果见序列表。

将菌株ZW-A的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示)上传到Genbank，获得Genbank的登录号KU323913，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Pseudomonas属，与Pseudomonas veronii(AF064460)同源性最高，达到96％。因此，将该菌命名为维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW-A。

MN平板终浓度组成同无机盐培养基。

LB平板终浓度组成：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6。

实施例2：Pseudomonas veronii ZW-A利用α-蒎烯实现4-异丙基苯甲酸的积累比较

(1)菌悬液的制备

将Pseudomonas veronii ZW-A接种至斜面培养基，在30℃培养3d，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6。

将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养3d，获得种子液，即为对数生长期的ZW-A菌悬液；所述种子培养基终浓度组成同无机盐培养基。

(2)4-异丙基苯甲酸的积累

将无机盐培养基分装于250mL的密封玻璃瓶(50mL/个)，110℃灭菌40min。待培养基冷却后，加入处于对数生长期的ZW-A菌悬液，使初始细胞OD₆₀₀值达到0.1，加入α-蒎烯作为唯一碳源，初始浓度为100mg/L，置于30℃的摇床中160rpm培养。同样条件下，另取3瓶作为空白对照，第1瓶仅添加无机盐培养基，不加ZW-A菌悬液和α-蒎烯；第2瓶添加无机盐培养基和ZW-A菌悬液，不加α-蒎烯；第3瓶添加无机盐培养基和α-蒎烯，不加ZW-A菌悬液。每隔12小时，取样，用气相色谱检测α-蒎烯的浓度，用分光光度计测定培养液的OD₆₀₀值表征菌体生长情况，离心后取上清液，过膜(孔径0.45μm)后用高效液相色谱检测4-异丙基苯甲酸的含量，绘制α-蒎烯的降解率和4-异丙基苯甲酸积累率随时间变化曲线。同样条件下，以原始株ZW(即Pseudomonas>

气相色谱检测条件为：利用Agilent 6890来检测摇瓶上方α-蒎烯气体浓度，其色谱柱为HP-Innowax毛细管柱(30m×0.32mm×0.5μm)。进样口和检测器(FID)的温度分别为250℃和300℃，柱温为140℃，柱流速1mL/min，进样体积800μL。N₂为载气，分流比为15:1。氢气流和空气流量分别为40mL/min和450mL/min。

高效液相色谱检测条件为：采用Agilent Technologies 1200Series型高效液相色谱仪分析测定溶液中的枯茗酸浓度。检测条件：SB-C18反相色谱柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长λ为256nm；流动相为甲醇:水＝60:40(V/V)，加入10mM乙酸铵，用乙酸调整pH约为4.0，利于调节峰型；流速为1mL/min；进样量25μL，柱温30℃。

结果如图2和图3所示。可以明显看出，原始株ZW能在50h内将α-蒎烯代谢完全，但菌株ZW-A却无法将α-蒎烯完全代谢，表明转座子的插入影响了菌株利用α-蒎烯的能力，这可能是由于突变株的全基因序列中参与到α-蒎烯降解的基因受到了影响，或者是一些降解α-蒎烯的代谢产物的降解基因受到了影响，代谢产物的大量积累影响了突变株对α-蒎烯的利用率。同时，对降解过程中积累的4-异丙基苯甲酸进行了分析。可以发现，对于原始菌株ZW，4-异丙基苯甲酸的浓度随着降解时间的增加先增加后减少，其最大值在12h左右，为5mg/L，说明菌株ZW在降解α-蒎烯的过程中不能积累4-异丙基苯甲酸，它是同时利用α-蒎烯和4-异丙基苯甲酸维持生长的。而对于突变株，可以明显地看出，4-异丙基苯甲酸有一定程度的积累，积累量达到16mg/L，且随着降解时间的延长(从36h到50h)，4-异丙基苯甲酸并没有减少，说明ZW-A不能利用4-异丙基苯甲酸作为碳源维持生长。

实施例3：培养基组成对于Pseudomonas veronii ZW-A积累4-异丙基苯甲酸的性能影响

将无机盐培养基中的MgCl₂·6H₂O换成MgSO₄，其他同无机盐培养基，配制成改良无机盐培养基，MgSO₄的质量分别为0.157g/L、0.207g/L、0.257g/L、0.307g/L、0.357g/L，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，向其中加入生长对数期的ZW-A菌悬液(实施例2方法制备)，使初始细胞OD₆₀₀值达到0.1，以α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为100mg/L，置于30℃的摇床中160rpm培养；每隔12小时检测4-异丙基苯甲酸的积累情况(方法同实施例2)，同时以ZW-A菌悬液接种无机盐培养基(即原始培养基)为对照，确定最优的无机盐配方。

由图4、图5可知，当MgSO₄的浓度过大或者过小时(小于0.307g/L或者大于0.307g/L)，α-蒎烯的代谢效率和4-异丙基苯甲酸的积累效率都有所下降，只有当MgSO₄的浓度为0.307g/L时，菌株ZW-A利用α-蒎烯的效率最大为85％，相应的4-异丙基苯甲酸的积累率为24.5％，明显高于利用无机盐培养基培养ZW-A实现4-异丙基苯甲酸的积累(约19％)。

实施例4：Pseudomonas veronii ZW-A利用含蒎烯类结构的烃类化合物生产4-异丙基苯甲酸的性能考察

分别以α-蒎烯、β-蒎烯、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇作为唯一碳源，考察菌株Pseudomonas veronii ZW-A对于这些物质的利用及积累能力4-异丙基苯甲酸。结果表明，菌株ZW-A能实现4-异丙基苯甲酸的积累，并且积累量均在20％以上。具体实施方案如下：

分别取600mL(pH7.2)改良无机盐培养基(0.307g/L MgSO₄替代无机盐培养基中MgCl₂·6H₂O)分装至12个250mL的摇瓶中，分成三组(组1-组3)，每组4瓶，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，其中组1和组2每瓶加入生长对数期的ZW-A菌悬液(实施例2方法制备)，分别以α-蒎烯、β-蒎烯、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇作为唯一碳源，初始浓度均为100mg/L，置于30℃的摇床中160rpm培养；相同条件下，组3不加ZW-A菌悬液，分别添加α-蒎烯、β-蒎烯、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇，作为空白对照。培养2d离心后取上清液，过膜后用高效液相色谱检测4-异丙基苯甲酸的含量(方法同实施例2)，计算积累率。

结果如表1所示。菌株ZW-A能不同程度地利用α-蒎烯、β-蒎烯、对异丙基甲苯、对异丙基苯甲醇，并且实现培养基中4-异丙基苯甲酸的积累。和空白对照相比，积累量分别达到了24％、21％、25％和23％。

表1菌株ZW-A利用不同底物积累4-异丙基苯甲酸的比较