一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片、制备方法以及试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片，包括：纳米金属基底；两种或两种以上的信号分子，均匀分布于纳米金属基底上；以及两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于不同的信号分子上。本发明还提供了所述检测芯片的制备方法以及包含其的检测试剂盒。本发明的检测芯片以及检测试剂盒通过不同微区固定不同拉曼信号分子，结合纳应力传感技术实现对多种肿瘤标志物的一步、同时、灵敏、定量检测，具有巨大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片、其制备方法以及包含所述检测芯片的试剂盒。

背景技术

肿瘤标志物microRNAs(miRNAs)伴随着肿瘤的发生、生长、转移和治疗过程，呈现出不同的表达水平。miRNA的定量、高灵敏检测可以用于诊断早期肿瘤，提高病人的生存率，在肿瘤的诊断和治疗方面具有非常重要的意义。目前对miRNAs的定量检测方法包括Northernblotting、QT-PCR、荧光法、微阵列法、SERS法等。

目前，SERS(表面增强拉曼散射)法中的双温度杂交法检测miRNA只能一次检测一种miRNA，且步骤较多。其过程如下：在SERS基底上连接上与目标待测物部分互补的捕捉探针，用于捕捉目标待测物，再在待测物剩余片段上连接信号探针，以产生SERS信号。然而，在SERS法检测中，目标待测物miRNA本身SERS信号极弱，直接检测时，谱图中干扰峰特别多，不易获得其结构和浓度信息。因此现有的方法多数通过设计合理的生物芯片，将miRNA的浓度和结构信息，转化为信号分子的强度或位移信息，但上述检测方法多数只能用来检测单个miRNA，两种及以上标志物同时检测的研究未见报道。

癌症是一种复杂的疾病，同一种标志物可能出现在不同肿瘤中，而一种肿瘤中也会包含多种标志物，仅对一种标志物进行检测很难反映肿瘤的发展和治疗状态。因此，多种标志物的联合检测，能极大提高肿瘤诊断的准确性，对癌症早诊具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术中无法多种肿瘤标记物联合检测的缺陷，本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)技术的检测芯片，可同时检测多种标记物，且准确性、灵敏度更优。

本发明的另一目的是提供所述检测芯片的制备方法以及包含所述检测芯片的检测试剂盒。

本发明提供的基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片，包括以下组成：

纳米金属基底；

两种或两种以上的信号分子，均匀分布于所述纳米金属基底上；以及

两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于不同的所述信号分子上。

本发明的检测芯片中，选用纳米金属基底具有更好的灵敏性，所述纳米金属基底可选用检测芯片领域常见的纳米基底，也可按照现有方法即时制备，包括但不限于纳米银、纳米金或纳米铜的基底；优选为纳米银基底。

本发明的检测芯片中，所述信号分子的选择需满足：1)表面增强拉曼散射特征峰可明显互相区分；2)可印刷于纳米金属基底上并具备活性基团与探针序列相连。所述信号分子包括但不限于对巯基苯甲酸、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸或2-氨基-6-巯基嘌呤。

本发明的检测芯片中，所述探针序列与所述信号分子之间包含有桥联基团，桥联基团可以增加固定在基底上的探针序列的灵活性，从而不影响其与目标miRNA的结合。所述桥联基团可以为碳原子数20以下的直链饱和烷基；优选碳原子数为3～6的直链饱和烷基。

本发明的检测芯片优选包括以下组成：

纳米银基底；

两种信号分子对巯基苯甲酸以及5,5'-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)，均匀分布于所述纳米银基底上；以及

两种用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于所述两种信号分子上。

本发明提供的检测芯片制备方法，包括以下步骤：

S1：制备纳米金属基底；

S2：使用微接触印刷技术在所述纳米金属基底上分别印刷两种或两种以上的信号分子使其均匀分布于所述纳米金属基底上；

S3：使两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列分别与不同的所述信号分子结合。

步骤S2中，微接触印刷技术可使用现有的工艺技术或简单变型，印刷不同信号分子没有顺序限定，优选地，可先印刷生长速度较慢的信号分子。

进一步地，所述步骤S3包括：

S31：修饰所述探针序列使其含有与所述信号分子结合的活性基团；

S32：将步骤S31所得的探针序列通过所述活性基团分别与不同的所述信号分子反应以使所述探针序列与所述信号分子结合。

进一步地，所述步骤S31还包括修饰所述探针序列使所述探针序列与所述活性基团之间含有桥联基团。

步骤S32中，通常可先使反应活性较高的信号分子与探针结合，反应完毕后将反应位点封闭，然后再进行其他信号分子的反应，必要时，也可采用保护基团以保证未反应的信号分子不受影响，进而保证不同信号分子与不同探针序列的特异性结合。

步骤S32中，当信号分子上的活性基团反应活性较小时，也可使用活化剂提高反应活性。活化剂的种类可根据信号分子的活性基团使用有机反应领域的常见种类。

本发明还提供了一种用于检测肿瘤标志物的试剂盒，其包含以上技术方案任一项所述的基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片。

本发明的检测芯片在纳米金属基底上，利用微接触印刷技术，构筑不同的功能微区，印刷SERS特征峰区别明显的不同信号分子，然后把对应于不同标志物的检测探针序列分别固定在对应的信号分子上，再通过目标待测物miRNA与探针序列之间的特异性相互作用检测目标miRNA，目标miRNA与探针特异性结合前后会对信号分子的某个(些)拉曼峰位移产生影响，分析拉曼峰位移的大小即可得到miRNA的浓度信息。

本发明的检测芯片具有以下优点：

(1)选用灵敏性更高的纳米金属基底以及不同种类的信号分子，通过信号分子的特征峰的峰位置区别，可同时检测多种肿瘤标志物，实现了联合检测，提高了检测效率。

(2)采用微接触印刷技术，可使不同信号分子均匀印刷至纳米金属基底上形成不同的功能微区，检测探针与信号分子的化学键合，不会互相影响，因而可提高检测的灵敏度以及准确性，而且，信号分子的均匀分布还能够保证miRNA的浓度信息转化为稳定的、重现性更好的SERS信号，从而使检测过程具有良好的重现性。

(3)利用纳应力传感，将miRNA的浓度信息转化为信号分子的特征峰位移量，从而可以通过其来检测miRNA的绝对浓度，检测准确性更高。

(4)制备过程步骤少，避免了过多的干扰因素，从而进一步保证了检测结果的准确性。

本发明的检测芯片以及检测试剂盒通过不同微区固定不同拉曼信号分子，结合纳应力传感技术实现对多种标志物的一步、同时、灵敏、定量检测，具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例所述检测芯片的制备过程示意图(两种信号分子)；

图2A为本发明实施例检测过程中信号分子的SERS谱图；图2B为信号分子对巯基苯甲酸(MBA)特征峰的放大图；图2C为信号分子5,5’-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)特征峰的放大图；图2D为C-S键的拉曼信号峰；其中：曲线a表示印刷信号分子MBA后的SERS图，曲线b表示在SERS基底空白处连接上第二种信号分子DSNB后的SERS图，曲线c表示连接上探针后的SERS图，曲线d表示检测miRNA后SERS图；

图3A、3B分别为本发明实施例两种miRNA的浓度与不同信号分子峰位移的关系(errorbar为5次试验所得结果的标准偏差)；

图4为本发明实施例中2-氨基-6-巯基嘌呤印刷在纳米银基底后的SERS谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

如图1所示，以两种标志物的检测为例，先用表面具有微阵列结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章在银岛基底上印刷信号分子MBA。再在其他区域生长上信号分子DSNB，形成多种信号分子均匀、间隔分布的表面功能微区结构；控制反应条件使探针1和探针2先后与信号分子1和信号分子2特异性结合；最后，探针1和探针2分别与目标待测物特异性杂交，对底部的信号分子的结构造成影响，从而产生峰位移。具体过程如下：

1.银岛基底制备

1×1cm²的硅片/玻璃片在乙醇和丙酮中分别超声10min，吹干后置于piranha洗液(H₂SO₄/H₂O₂＝3:1,v/v)中，加热到95℃清洗40min。用超纯水彻底清洗硅片/玻璃片后，吹干，置于(3-巯丙基)三甲氧基硅烷的甲苯溶液中(2％)修饰8h。分别用甲苯、丙酮和乙醇，将硅片/玻璃片清洗干净后待用。

称取440mg的硝酸银，置于80mL的烧杯中，加入50mL水，搅拌均匀。边快速搅拌边向硝酸银溶液中缓慢加入135μLNaOH(10％)生成灰绿色沉淀。向烧杯中逐滴加入2mL10％氨水溶液，直至沉淀消失。将溶液置于冰水浴中冷却。向冷却后的溶液中加入300μL戊二醛溶液(25％)，反应10s后，置于90℃水浴中，并将修饰好的硅片/玻璃片贴壁放置在溶液中。反应4min，银纳米粒子在硅片/玻璃片上生长，形成银岛基底。立即取出银岛，置于预先冷却的乙二醇中，终止生长。超声20s除去非特异性附着的银纳米粒子，待用。

2.印章制备

7μm×7μm排列的Si微阵列模板，分别用乙醇和丙酮超声清洗10min，吹干后置于piranha洗液中，加热到95℃清洗40min，用超纯水清洗干净，并吹干。将模板置于20μL全氟硅烷的蒸汽中，修饰15min，并固定在一次性比色皿开口处(微阵列面朝内)。一次性比色皿底部开口待用。将聚二甲基硅氧烷和固化剂按10:1的比例搅拌均匀，静置待气泡消失后，从一次性比色皿底部缓慢注入。比色皿置于60℃烘箱，固化2h即得到印章。

3.表面微纳结构构筑

向印章表面上滴加20μLMBA的乙醇溶液，静置1min并吹干。印章与银岛接触1min，使印章上的MBA在银岛上生长。再将银岛置于5mMDSNB的乙腈溶液中，反应4h使银岛未生长MBA的空白区域生长上DSNB，得两种信号分子微区均匀分布的修饰银岛。

4.探针修饰

将信号分子修饰的银岛置于10μM的胺基化修饰的探针1(序列为SEQIDNO：1，分子结构见表1，BIONEER公司)溶液中(3×SSC(柠檬酸钠缓冲液)，pH7.4，含0.04％十二烷基硫酸钠)，室温下反应4h，使探针1与DSNB结合而固定到基底上。将基底转移到100μM的丁胺(3×SSC，pH7.4)溶液中，室温下继续反应40min，封闭未反应的DSNB位点。将银岛转移到含NHS(10mM)和EDC(50mM)的磷酸盐缓冲液中(pH6.8，10mM)，反应1h，活化MBA末端的羧基。用2×SSC(pH7.4，含0.1％十二烷基硫酸钠)清洗后，转移到含10μM的胺基化修饰的探针2(序列为SEQIDNO：2，分子结构见表1，BIONEER公司)的溶液中(3×SSC，pH7.4，pH7.4，含0.04％十二烷基硫酸钠)，使探针2与MBA结合固定到基底上。测定基底的SERS谱图，得到检测前的信号分子位移。

5.miRNA检测

探针修饰的基底分别置于含10^-6-10^-18M，以及不含miRNA的5×SSC溶液中(pH7.4，含0.01％十二烷基硫酸钠)，置于42℃杂交16h，测定基底的SERS谱图，得到检测后信号分子位移。

6.结果分析

基底上信号分子的谱图变化见图2A-2D。首先，利用微接触印刷技术，印刷上信号分子MBA，检测SERS谱图，发现在1068cm^-1和1581cm^-1处有MBA的特征峰；生长上第二种信号分子DSNB后，在1334cm^-1处检测到DSNB的特征峰；信号分子连接上探针分子后，MBA和DSNB的特征峰都发生了红移；与两种miRNA特异性结合后，MBA和DSNB的特征峰再次发生红移，位移量与miRNA的浓度相关。由此可同时对两种miRNA进行定量检测。

图3A、3B是miRNA浓度与信号分子峰位移的关系。miRNA1(SEQIDNO：3，序列见表1，BIONEER公司)的浓度由信号分子MBA特征峰的位移量反应，检测极限可达到10^-16mol/L；miRNA2(SEQIDNO：4，序列见表1，BIONEER公司)的浓度由信号分子DSNB特征峰的位移量反应，检测极限可为10^-16mol/L。

表1实施例中使用的miRNA及其相应探针序列

7.三种信号分子

在前述基础上，可增加为三种信号分子，例如MBA、DSNB以及2-氨基-6-巯基嘌呤(结构式如下所示)。

如图4所示，2-氨基-6-巯基嘌呤印刷在纳米银基底后的拉曼谱图中，其特征峰在1300cm^-1处，结合图2A-2D可知：2-氨基-6-巯基嘌呤的特征峰与MBA、DSNB的特征峰是可以明显区分开的，由此可制备同时检测三种肿瘤标志物的检测芯片。

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。