一种贴壁细胞中游离氨基酸和脂肪酸的提取及分析方法

摘要

本发明公开了一种贴壁细胞中游离氨基酸和脂肪酸组分的提取和分析方法，主要包括以下步骤，贴壁细胞于培养盘贴壁培养后，样品经快速水洗后液氮淬灭，加入少量水超声破碎，冻干后加入MTBE提取，然后加水离心取上清，氮气吹干后用乙腈定容然后对脂肪酸组分进行液相色谱质谱(LC-MS)分析。提取剩余部分继续加入MTBE和甲醇提取，离心后取下层对氨基酸组分直接进行LC-MS分析。本发明采用LC-MS对游离氨基酸和脂肪酸组分进行分析，利用较少的样本量实现了氨基酸和脂肪酸组分的同时提取。与常规脂肪酸GC-MS分析方法比较，该方法不需衍生，极大简化样品前处理过程，同时为贴壁细胞内代谢物的提取提供了一种参考方法，该分析方法能够应用于其他介质中游离氨基酸和脂肪酸的分析。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，涉及一种贴壁细胞内代谢物的提取方法和基于液相色谱-质谱联用技术的氨基酸和脂肪酸分析方法

背景技术

细胞内氨基酸和脂肪酸组分能够参与细胞能量代谢通路，是维持细胞碳代谢和氮代谢的基本单元。细胞受到外界环境刺激，污染物以及药物暴露后其体内氨基酸和脂肪酸组分都会发生相应的变化，在生物学领域，部分氨基酸已经成为肿瘤发生的标志物，而游离脂肪酸参与的代谢失调也会引起机体发生的病变。因此对细胞内氨基酸以及脂肪酸组分的分析具有重要意义

氨基酸的分析常用专门的氨基酸分析仪，原理是采用柱后衍生、用茚三酮作为衍生试剂的离子交换色谱法，分析时间较长，需要在一个小时内完成。随着HPLC技术的发展,用反相柱(C₈、C₁₈)柱前衍生，荧光或紫外检测法测定氨基酸取得了很大发展。但是这两种氨基酸分析方法都需要衍生，且氨基酸分析仪用时较长，液相色谱检测法检出限较高，用于少量生物样品测定严重受限于检测的特异性和灵敏度，无法在分子水平上实现准确定量。游离脂肪酸的分析常采用甲酯化衍生后利用气相色谱法(GC)，或者采用荧光衍生后用液相色谱检测(LC)。脂肪酸的提取溶剂常用非极性溶剂如：石油醚，正己烷，氯仿/甲醇混合溶液等，另外，在萃取时加入一些水，可以提高萃取效率。但是衍生化过程中会出现很多问题。如衍生不完全，衍生后脂肪酸的组成发生了变化，另外多不饱和脂肪酸在分析过程中有可能会因氧化降解。针对游离氨基酸和脂肪酸提取及分析过程中存在的问题，本发明发展了一种从贴壁细胞中提取多种氨基酸和脂肪酸的方法，并建立了基于液相色谱-质谱联用技术的分析方法，采用少量细胞样品即可实现氨基酸于脂肪酸类物质的同时提取和分析。是目前理想的分析的手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种贴壁细胞中游离氨基酸和脂肪酸组分的提取和分析方法，这种方法利用较少的细胞样本量实现了氨基酸和脂肪酸组分的同时提取。与常规的GC和LC分析方法比较，该方法不需要衍生，极大简化样品前处理过程，同时为贴壁细胞内代谢物的提取提供了一种参考方法，而且该分析方法还能够应用于其他介质中游离氨基酸和脂肪酸的分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

基于构建的贴壁细胞中游离氨基酸和脂肪酸组分的提取方法，以HepG2为模式细胞，对其胞内氨基酸和脂肪酸组分进行提取，并利用基于LC-MS的质谱方法对细胞内22种氨基酸组分和20种脂肪酸组分进行定量测定。

细胞内氨基酸和脂肪酸组分的提取与检测过程具体步骤如下：

(a)细胞于孔板中培养24～48h，待细胞铺满孔板被培养液覆盖面积的60～80％，移弃培养液，每孔加入1～2mL水快速清洗并吸弃，然后加入液氮淬灭；

(b)液氮挥发完后超声破碎，冷冻干燥，每孔的冻干样品中加入10～20μL内标混合液，涡旋混匀；

(c)加入甲基叔丁基醚(MTBE)涡旋提取，加入水涡旋混匀，离心，取上清氮气吹干，然后乙腈定容，LC-MS分析游离脂肪酸；

(d)取上清后的提取剩余部分加入MTBE和甲醇，涡旋提取，离心后取下层对游离氨基酸组分进行LC-MS分析。

上述步骤a中所述孔板为六孔板，六孔板每孔内培养液体积为2～3mL,细胞的接种密度为1～3×10⁵个/mL，在培养箱内的培养条件为37℃，空气中含体积分数为5％的CO₂；培养液为GIBCO的DMEM(高糖)液体培养基,含4500mg/l葡萄糖，含体积分数为10％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素；液氮用量为填满六孔板的每一个孔。

上述步骤b每孔加入0.5～1mL水超声破碎，超声破碎时间为3～5min,移出置于离心管中(每孔分别置于一个离心管中)于-10～-40℃冷冻干燥，加入的内标混合液中，正亮氨酸浓度为200～400nmol/L，十一酸浓度为10～20mg/L，十九酸浓度为10～20mg/L，溶剂为乙腈。

上述步骤c中每孔样品MTBE用量为400～800μL，涡旋提取时间为15～20min，加入水的体积为每孔样品200～400μL，涡旋混匀时间为2～5min，提取过程中离心操作为4～8℃下离心20～30min，转速为12000～15000rpm，取上清氮气吹干后每孔样品用乙腈定容到200～400μL用于游离脂肪酸的分析。

上述步骤d中加入MTBE量为每孔样品100～200μL，甲醇量为每孔样品200～400μL，涡旋提取时间为15～20min，离心条件为4～8℃下，20～30min，转速为12000～15000rpm。

游离脂肪酸组分的分析采用的色谱柱为Ufavour C₈柱(150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为H₂O，流动相B为含1～5mM乙酸铵的乙腈，流动相C为乙腈；流动相梯度为(时间，流动相体积百分数，流动相总流速)：0-5min,流动相A10％，流动相B20％,流动相C70％,250μL/min；第6min，在1分钟内流动相A由10％线性减少为0％，流动相C由70％线性增加为80％,250μL/min；7-15min,流动相B>

游离氨基酸组分的分析采用Atlantis C₁₈高效液相色谱柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为含0.1～0.5％(体积百分比)甲酸的H₂O，流动相B为甲醇；流动相梯度为(按体积百分比计)：0-2min，流动相A95％，流动相B5％；然后在3min之内流动相A线性减少为40％，流动相B线性增加为60％，维持4min；在1分钟内流动相A线性增加到95％，流动相B线性减少为5％，维持8min；上述过程中流动相A与流动相B总流速始终为200μL/min，进样量为2～5μL；质谱扫描模式为ESI(+)MRM。

本发明中的技术方案与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明所需样本量小，氨基酸和脂肪酸的提取来自同一细胞样本，两者之间的相对重复性和平行性好于分别提取，便于对相关代谢途径进行研究时的数据整合。

(2)根据短链，中链及长链脂肪酸组分在极性与非极性溶剂两相分配的不同分别采用十一酸和十九酸作为短中链和长链脂肪酸的内标，能够有效地提高提取效率。

(3)本发明使用溶剂毒性较小，与其他溶剂相比，MTBE提取时蛋白和不溶物沉积在离心管底部，提取过程中不会引入蛋白干扰，重复性好。后续LC-MS检测可以快速实现对多种氨基酸和脂肪酸组分的特异性检测，具有简单快速、灵敏度高、特异性好、重复性好等优点。

附图说明

图1为细胞内脂肪酸组分总离子流色谱图及提取离子色谱图。

图2为细胞内氨基酸组分总离子流色谱图及提取离子色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

(1)以HepG2为模式细胞，接种于六孔板内，细胞接种密度为1.2×10⁵个/mL，六孔板每孔培养液用量为2.5mL，培养液为DMEM(高糖)液体培养基,含4500mg/l葡萄糖，含体积分数为10％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素-链霉素。在培养箱培养24h后(37℃，5％CO₂)，移弃培养液，每孔加入1mL水快速清洗并吸弃，然后加入液氮淬灭，液氮用量为填满六孔板的每一个孔。液氮挥发完后每孔加入0.5mL超纯水超声破碎5min，移出六孔板，每孔分别置于一个离心管，-20℃冷冻干燥；冻干后每个离心管加入10μL内标混合液即包括正亮氨酸(200nmol/L)，十一酸和十九酸(分别10mg/L)的乙腈溶液。脂肪酸的提取采用MTBE法，每个离心管加入MTBE量为400μL,涡旋振荡时间为20min，然后每个离心管加入超纯水260 μL，涡旋振荡5min，8℃下离心12000rpm×20min，每个离心管取上清氮气吹干后用乙腈定容到400μL用于游离脂肪酸的分析，提取脂肪酸后剩余部分每个离心管再依次加入100μL>

(2)游离脂肪酸组分的分析采用的色谱柱为Ufavour C₈柱(150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为H₂O，流动相B为含5mM乙酸铵的乙腈，流动相C为乙腈；流动相梯度为(时间，流动相体积百分数，流动相总流速；)：0-5min,流动相A10％，流动相B20％,流动相C70％,250μL/min；第6min，在1分钟内流动相A由10％线性减少为0％，流动相C由70％线性增加为80％,250μL/min；7-15min,流动相B>18高效液相色谱柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为含0.1％(体积百分比)甲酸的H₂O，流动相B为甲醇；流动相梯度为(按体积百分比计)：0-2min，流动相A>