基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法

摘要

本发明公开了一种基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法，属于光学传感技术领域。以凝血酶适配体为模板制备生物量子点，将生物量子点与凝血酶待测样品混合，再将混合溶液加入到Au NPs溶液中，此时，生物量子点的荧光强度与凝血酶的浓度呈正相关，根据生物量子点的荧光强度判断凝血酶的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法，属于光学传感技术领域。

背景技术

凝血酶在人体内普遍存在，是一种在生理和病理过程中起着凝血因子功能的内切蛋白酶，能将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。凝血酶还具有类似激素的性质，在血栓形成和血小板激活过程中起着重要作用。因此，凝血酶在许多心血管疾病中扮演着重要角色，具有调控血管壁上炎症和组织修复的作用。凝血酶还可以作为治疗剂和生物标记物用于诊断多种疾病，例如肺转移瘤以及相关的凝血功能异常等。因此，建立简单灵敏的凝血酶检测方法对重大疾病早期诊断以及相关药物研发具有重要意义。

生物量子点（bio-dots）是最近兴起的一种新型荧光量子点，它以DNA为模板在低温水热条件下合成，方法简单、绿色。Bio-dots具有较低的细胞毒性、稳定的荧光性质、良好的水溶性以及生物相容性，此外，bio-dots不仅具有与碳量子点相似的荧光性质，还保持了DNA模板的基本功能，bio-dots的以上特性为其在生物传感领域的广泛应用奠定了基础。

荧光共振能量转移（FRET）是一种能量给体和受体之间的非辐射的能量转移，是一种与距离相关的能量转移技术。金纳米粒子（Au NPs）具有很强的距离相关的光学性质，而且在很宽的波长范围内具有高猝灭效率，因此被广泛用作荧光共振能量转移的受体。然而，尚未见Au NPs与bio-dots之间FRET的相关研究，也未见其在凝血酶检测中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法，该方法对凝血酶的检测具有灵敏度高和选择性好的特点。

本发明是这样来实现的，一种基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法，其特征在于，以凝血酶适配体为模板制备生物量子点，将生物量子点与凝血酶待测样品混合，然后将混合溶液加入到Au NPs溶液中，此时，生物量子点的荧光强度与凝血酶的浓度呈正相关，根据生物量子点的荧光强度判断凝血酶的浓度。

本发明采用以下技术方案：

（1）生物量子点的制备：将凝血酶适配体用超纯水溶解，将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，于100 °C反应12 h，制成凝血酶适配体生物量子点；

（2）基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移检测凝血酶：在磷酸盐缓冲液中，将生物量子点与凝血酶混合，在37 °C孵育1 h，将混合溶液加入到Au NPs溶液中，利用荧光光谱仪测量生物量子点的荧光强度。

上述方法中，所述的磷酸盐缓冲液浓度为10 mM，pH为7.4，含50 mM NaCl、5 mM KCl和4 mM MgCl₂；所述的生物量子点浓度为80>

本发明的技术效果是：本发明采用低温水热法以凝血酶适配体为模板制备荧光生物量子点，量子点与Au NPs 结合使Au NPs聚集，同时Au NPs的吸收光谱与量子点的发射光谱有部分重叠，使量子点与Au NPs发生荧光共振能量转移而导致量子点荧光减弱；当样品中存在凝血酶时，凝血酶的两个适配体结合位点使其作为桥梁使更多结合了量子点的Au NPs聚集，大量聚集导致Au NPs的吸收光谱发生红移，从而与量子点的发射光谱重叠部分减少，使得量子点与Au NPs之间的荧光共振能量转移效应减小，导致量子点的荧光不被猝灭；量子点的荧光强度与凝血酶的浓度呈正相关，据此实现对凝血酶的检测，该方法具有稳定、灵敏度高以及选择性好的优点。

附图说明

图1是生物量子点的透射电镜图。

图2是(a) 80 nM生物量子点、(e) 80 nM生物量子点+Au NPs以及(g) 80 nM生物量子点+80 nM凝血酶+Au NPs的发射光谱，(b)生物量子点、(c) Au NPs、(d) 80 nM生物量子点+Au NPs以及(f) 80 nM生物量子点+80 nM凝血酶+Au NPs的紫外-可见吸收光谱。

图3是(A) Au NPs、(B) Au NPs+80 nM生物量子点以及(C) Au NPs+80 nM生物量子点+80 nM凝血酶的透射电镜图。

图4是(A) Au NPs+生物量子点+不同浓度凝血酶的荧光光谱图，(B)线性关系曲线。

图5是Au NPs+80 nM生物量子点(Blank)及其分别与凝血酶(Tb)、牛血清蛋白(BSA)、辣根过氧化酶(HRP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、胰蛋白酶(Try)、α-糜蛋白酶(α-CT)、血红蛋白(Hb)作用后的最大吸收峰移动情况(Δλ_max)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；

实施例1

（1）生物量子点的制备：将凝血酶适配体（TBA）用超纯水溶解，将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至100 °C反应12 h，制成凝血酶适配体生物量子点（TBA-dots）。

（2）Au NPs的制备：将2 mL的HAuCl₄（1%>

采用透射电子显微镜对TBA-dots的形貌进行表征，结果如图1所示。由图1可见，TBA-dots呈球形且粒径分布均匀，平均粒径约为1.6 nm。采用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱对TBA-dots的光学性质进行表征。由图2可见，在最佳激发波长为320 nm时，TBA-dots的最大发射峰位于425 nm（曲线a）且不随激发波长的改变而移动。TBA-dots在260 nm处有强的紫外特征吸收峰，并在320-420 nm处有吸收带（曲线b），Au NPs在520 nm处有强的紫外特征吸收峰（曲线c）；在Au NPs中加入TBA-dots后，表面含有的大量氨基使得TBA-dots可以通过Au-N键作用组装到Au NPs表面形成“壳”结构包裹着Au NPs，导致金纳米粒子聚集，Au NPs在520 nm处的吸收峰减弱，而在660 nm处出现了新的吸收峰（曲线d），同时由于Au NPs的吸收光谱与TBA-dots的发射光谱有部分重叠，且Au NPs在很宽的波长范围内都具有高猝灭效率，使得TBA-dots的荧光大大减弱（曲线e）。当样品中存在凝血酶时，凝血酶含有两个适配体结合位点可作为桥梁使更多结合了TBA-dots的Au NPs聚集，导致Au NPs的吸收峰进一步红移（曲线f），同时520 nm处的吸收峰减小；此时，Au NPs的吸收光谱与量子点的发射光谱重叠部分减少，导致TBA-dots与严重聚集的Au NPs之间的荧光共振能量转移效应减小，TBA-dots的荧光减弱程度下降（曲线g）。

实施例2

基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移检测凝血酶

在磷酸盐缓冲液（浓度10 mM，pH 7.4，含50 mM NaCl，5 mM KCl，4 mM MgCl₂）中，将80>

由图3A可见，Au NPs具有良好的分散性；向Au NPs溶液中加入TBA-dots后，TBA-dots通过Au-N键作用组装到Au NPs表面并形成“壳”结构包裹着Au NPs，导致Au NPs聚集（图3B），同时，由于Au NPs的吸收光谱与TBA-dots的发射光谱有部分重叠，TBA-dots与Au NPs发生FRET使得TBA-dots荧光减弱；当样品中存在凝血酶时，凝血酶可以与两个TBA-dots结合，作为桥梁拉近TBA-dots包裹Au NPs的距离，使更多的Au NPs聚集（图3C），导致Au NPs的最大吸收峰进一步红移而使得TBA-dots与Au NPs之间的FRET减弱，TBA-dots荧光不被猝灭（图4），荧光强度与凝血酶浓度呈正相关，据此可对凝血酶进行检测。由图4可见，随着凝血酶浓度的增加，TBA-dots的荧光逐渐增强，该荧光强度与凝血酶浓度在8-160 nM范围内呈良好的线性关系，检测限为6.5 nM，实现了对凝血酶的快速和灵敏性检测。

为了论证本方法对凝血酶检测的选择性，以Au NPs+生物量子点为空白(Blank)，选取牛血清蛋白(BSA)、辣根过氧化酶(HRP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、胰蛋白酶(Try)、α-糜蛋白酶(α-CT)以及血红蛋白(Hb)为干扰组分进行考察。由图5可见，只有与凝血酶(Tb)作用时，Au NPs的最大吸收峰才会发生明显红移，最大吸收峰移动值(Δλ_max)正移达68>max移动均很小。以上结果表明，本发明方法对凝血酶检测有良好的选择性。