一种简单有效的桑叶多糖检测方法

摘要

本发明公开了一种简单有效的桑叶多糖检测方法，具体是先分别提取桑叶水溶性糖和桑叶总糖，然后分别水解转化成还原性糖，利用3，5‑二硝基水杨酸(DNS)比色法测定桑叶水溶性糖提取液和桑叶总糖提取液在540nm处的吸光值，根据葡萄糖标准曲线分别计算测定液中桑叶水溶性糖提取液和桑叶总糖提取液相当于葡萄糖的质量，再计算桑叶水溶性糖和桑叶总糖(以还原糖计)的含量，并按桑叶多糖(％)＝[桑叶总糖(％)－桑叶水溶性糖(％)]×0.9计算桑叶多糖含量；本发明的方法避免了因硫酸遇水剧烈放热使显色条件难以控制的问题，同时测定过程不受单糖组分的干扰，并且操作简单、安全，结果稳定、可靠，适合检测大量桑叶样品多糖含量。

说明书

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种简单有效的桑叶多糖检测方法。

背景技术

桑叶为桑科(Moraceae)桑属(MorusL.)桑种(MorusalbaL.)植物的叶，含有蛋白质、无机盐、维生素、多糖、多酚、黄酮、生物碱等多种功能性成分，卫生部将其列为药食两用型中草药。

现代研究药理表明，桑叶多糖作为桑叶活性成分之一，具有显著的降血糖作用。目前，桑叶多糖含量检测方法主要是蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，苯酚-硫酸法主要用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定。用这两种方法测定桑叶多糖时，实际上得到的是总糖含量，因此要准确检测桑叶多糖含量必须先分离纯化得到纯度较高的桑叶多糖，或者将得到的总糖结果减去还原糖结果(还原糖结果需通过其它方法进行测定)。但是分离纯化获得纯度较高的桑叶多糖步骤繁琐，重现性差；而蒽酮-硫酸法测定总糖结果还会受色氨酸含量较高的蛋白质的影响，稳定性较差；苯酚-硫酸法实验条件要求严格(如对苯酚的要求很高等)，测定过程中受多种条件限制，重现性较差。因此，现有检测方法均不能简单、准确、高效地反映桑叶中多糖的含量。因此，该领域急需研发一种简单、准确、快速检测桑叶多糖的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑叶多糖的检测方法，操作简单、安全，结果稳定、可靠，适合检测大量桑叶样品多糖含量。

为实现上述发明目的，本发明利用糖类单糖、低聚糖和多糖三大类，在一定条件下，低聚糖和多糖都可以水解为具有还原性的单糖。而DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸溶液)与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物(3-氨基-5-硝基水杨酸)，该化合物在540nm处有最大吸收，且在一定范围内，还原糖的量与吸光值呈线性关系。因此本发明先以DNS比色法测定桑叶中总糖和水溶性糖的含量，再利用公式：桑叶多糖(％)＝[桑叶总糖(％)－桑叶水溶性糖(％)]×0.9，计算得到桑叶多糖的含量。为此，提供如下技术方案：

一种简单有效桑叶多糖的检测方法，分别提取桑叶水溶性糖和桑叶总糖，然后水解转化成还原性糖，分别得桑叶水溶性糖提取液和桑叶总糖提取液，再利用3，5-二硝基水杨酸比色法测定桑叶水溶性糖提取液和桑叶总糖提取液在540nm处的吸光值，然后根据葡萄糖标准曲线分别计算测定液中桑叶水溶性糖提取液和桑叶总糖提取液相当于葡萄糖的质量，再按如下公式计算桑叶水溶性糖和桑叶总糖的含量：

式中：m₂——查曲线所得测定液中水溶性糖相当于葡萄糖质量，mg；

m₃——查曲线所得测定液中总糖相当于葡萄糖质量，mg；

V₀——测定液体积，mL；

V₂——水溶性糖提取液体积，mL；

V₃——总糖提取液体积，mL；

N₂——水溶性糖提取液稀释倍数；

N₃——总糖提取液稀释倍数；

M——桑叶样品质量，g。

并按照如下公式计算桑叶多糖：

桑叶多糖(％)＝[桑叶总糖(％)－桑叶水溶性糖(％)]×0.9。

上述公式中，总糖是指桑叶中单糖、低聚糖和多糖的总和(淀粉、纤维素等除外)，水溶性糖是指桑叶中单糖、低聚糖的总和，总糖和水溶性糖均以水解转化为还原糖的含量进行计算，0.9是还原糖(以葡萄糖计)换算为桑叶多糖的系数。

本发明中，所述3，5-二硝基水杨酸溶液的配制方法如下：首先配制含酒石酸钾钠的温度为40～45℃的水溶液，然后加入NaOH溶液，再依次加入3，5-二硝基水杨酸、苯酚和亚硫酸氢钠，最后定容使酒石酸钾钠终浓度为185g/L，NaOH终浓度为0.524mol/L，3，5-二硝基水杨酸终浓度为6.3g/L，苯酚终浓度为5.0g/L和亚硫酸氢钠终浓度为5.0g/L。

本发明中，所述桑叶水溶性糖提取液的提取方法如下：取新鲜桑叶烘干至恒重，粉碎，然后加入蒸馏水水浴提取，记为提取液A，再依次加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，离心收集上清液，得桑叶还原糖提取液，然后向桑叶还原糖提取液中加入盐酸进行水解，调节pH至7.5-8.0，得桑叶水溶性糖提取液。上述离心原则上不低于6000rpm，离心10min，两次离心后收集的上清液往往不少于60mL，一部分用于还原糖的测定，另一部分用于后续水解转化，制备水溶性糖。

所述提取液A的制备方法如下：取新鲜桑叶在温度为50℃烘干至恒重，粉碎，然后加入相当于桑叶重量的60倍的蒸馏水，50℃水浴提取20min水浴，得提取液A。

上述水解中所述盐酸的加入量按浓盐酸与桑叶还原糖提取液体积比为3：50；所述水解是在70℃水浴下水解15min。

本发明中，所述桑叶总糖提取液的提取方法如下：取新鲜桑叶烘干至恒重，粉碎，然后加入蒸馏水充分溶解，用盐酸使总糖完全水解后，依次加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，调节pH至7.5-8.0，过滤，收集滤液，得桑叶总糖提取液。本发明中加入蒸馏水充分溶解桑叶粉时，先用少量水将桑叶粉调成糊状，再加入较多量的蒸馏水、混匀，其目的是使桑叶粉在水中充分分散开，有利于桑叶总糖和桑叶水溶性糖的提取。

所述盐酸加入量按桑叶与浓盐酸重量体积比为0.5：6(g/mL)，所述水解为在沸水浴下水解30min，过滤最好用单层尼龙布过滤，主要是由于该提取液中含有较多的黏多糖，用滤纸过滤极为复杂，同时排除滤纸组成物(碳水化合物)对还原糖测定的干扰。

所述烘干的条件为50℃；所述加入水的重量相当于桑叶重量的60倍；所述乙酸锌溶液中乙酸锌的浓度为219g/L；所述亚铁氰化钾溶液中亚铁氰化钾的浓度为106g/L。加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液最好沿着容量瓶壁加入，这样可以减少气泡的产生，方便定容。

最优选的，所述葡萄糖标准曲线的回归方程为y＝1.5175x-0.0578或y＝1.5802x-0.063。

上述提取过程中，还原糖提取液最好用50mL容量瓶量取，主要目的是精确控制还原糖提取液进行转化的体积，减小实验误差。

本发明中所指的浓盐酸是指质量分数超过37％的盐酸，在浓盐酸作用下可以将低聚糖、多聚糖水解为具有还原性的单糖(因为总糖、水溶性糖、多糖都是以还原糖计算)，并且盐酸的加入量、水浴温度、水浴时间是总糖、水溶性糖水解转化为还原性单糖的关键点，水解转化的条件过高、过低都会造成最后的测定值不准确。

本发明的有益效果在于：本发明利用DNS比色法测定桑叶中总糖和水溶性糖的含量，再利用公式：桑叶多糖(％)＝[桑叶总糖(％)－桑叶水溶性糖(％)]×0.9，计算得到桑叶多糖的含量；相对于传统的蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法，DNS比色法避免了因硫酸遇水剧烈放热使显色条件难以控制的问题，同时测定过程不受单糖组分的干扰，测定结果更接近真实值，而且总糖、水溶性糖提取过程简单，易操作，故本发明适合大量桑叶样品多糖含量的检测，进而筛选出多糖含量高的优势桑叶品种。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为实施例1葡萄糖标准曲线。

图2为实施例2葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中实验材料为新鲜的桑叶，取自于西南大学桑园，50℃下烘干至恒重，粉碎，过100目筛，-20℃低温环境下保存备用。

使用的试剂如下：

乙酸锌溶液配制：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL，制成乙酸锌溶液，终浓度为219g/L。

亚铁氰化钾溶液配制：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL，制成亚铁氰化钾溶液，终浓度为106g/L。

碘-碘化钾溶液配制：称取5g碘、10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中，制成碘-碘化钾溶液。

DNS试剂配制：配制500mL含185g酒石酸钾钠的热水溶液，向其中依次加入262mL浓度为2mol/L的NaOH溶液、6.3g3，5-二硝基水杨酸、5.0g苯酚和5.0g亚硫酸氢钠，搅拌溶解，冷却后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，贮存于棕色瓶中备用，该试剂即为DNS试剂，在室温(18～25℃)下放置7-10天后使用。

实施例1

一种桑叶多糖的检测方法，包括以下步骤：

(1)桑叶还原糖及水溶性糖的提取

a、称取桑叶粉1.00g于250mL锥形瓶中，加入60mL蒸馏水(先用少量水将桑叶粉调成糊状)，搅拌，50℃水浴20min，记为提取液A；

b、将步骤a所得提取液A(含残渣)依次转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗锥形瓶2-3次，将冲洗液一并转移到容量瓶中，再向容量瓶中依次加入3mL浓度为219g/L的乙酸锌溶液和3mL浓度为106g/L的亚铁氰化钾溶液，并用蒸馏水定容到100mL，记为提取液B；

c、用单层尼龙布过滤步骤b所得提取液B，滤液收集到50mL离心管中(考虑到提取液体积及后续用量，每个容量瓶内的提取液需用2个50mL离心管进行收集)；然后于10000rpm条件下离心10min，收集上清；将上清液再次在10000rpm条件下离心10min，收集上清液，该上清液即为桑叶还原糖提取液；

d、用50mL容量瓶量取50mL步骤c所得桑叶还原糖提取液，然后转移至100mL容量瓶中，往容量瓶中加入3mL浓盐酸，摇匀，70℃水浴15min后用流动水迅速冷却，然后倒入250mL锥形瓶中，调节pH至7.5-8.0，再转移至的100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗锥形瓶2-3次，将冲洗液一并转移到相应的容量瓶中，并定容到100mL，然后转移至50mL离心管中，记为桑叶水溶性糖待测液，贮存于4℃冰箱中备用；剩余的桑叶还原糖提取液保存于4℃冰箱，用于后续测定桑叶还原糖含量，记为桑叶还原糖待测液；

按照上述方法每个样品平行提取三份，得到三份还原糖待测液和三份水溶性糖待测液，最后测定结果取其算术平均值。

(2)桑叶总糖的提取

a、称取桑叶粉0.50g于150mL具塞三角瓶中，加入20mL蒸馏水(先用少量水将桑叶粉调成糊状)，搅拌均匀；

b、向上述三角瓶中加入6mL浓盐酸，沸水浴30min水解；

c、1-2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查总糖是否水解完全，若不呈现蓝色，则证明已经水解完全；

d、向上述三角瓶中加入30mL蒸馏水，摇匀后再加入2mL浓度为219g/L的乙酸锌溶液和2mL浓度为106g/L亚铁氰化钾溶液，用pH计调节pH至7.5-8.0；

e、将三角瓶中的液体(含残渣)转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗三角瓶2-3次，将冲洗液一并转移到上述容量瓶中，并定容到100mL，用单层尼龙布将容量瓶中的提取液过滤到50mL离心管中，贮存于4℃冰箱中备用，该提取液即为桑叶总糖提取液，记为桑叶总糖待测液。

每个样品平行提取三份，得到三份总糖待测液，最后测定结果取其算术平均值。

(3)DNS比色法测定桑叶还原糖、水溶性糖、总糖含量

a、分别取步骤(1)和(2)所得桑叶还原糖待测液、水溶性糖待测液、总糖待测液于10mL离心管中，10000rpm离心10min；

b、分别取各待测液0.4mL于10mL比色管中，加入0.4mL蒸馏水和0.6mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却到室温(18～25℃)，再向每管加入蒸馏水至刻度(10mL)，摇匀，以0.4mL蒸馏水代替待测液按相同方法操作做空白对照，于540nm波长处测定各管吸光度值；每个样品待测液平行测定两次，取平均值。

c、绘制葡萄糖标准曲线，首先配制葡萄糖标准溶液：准确称取葡萄糖103.6mg(预先在80℃烘至恒重)，加少量蒸馏水溶解后，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀后保存于4℃冰箱中备用，浓度为1.036mg/mL；然后取9支10mL比色管，分别加入0.00mL、0.08mL、0.16mL、0.24mL、0.32mL、0.40mL、0.48mL、0.56mL、0.64mL葡萄糖溶液(加入0.00mL葡萄糖溶液做空白对照)，加水稀释到0.80mL，再加入0.60mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入蒸馏水至刻度(10mL)，摇匀，于540nm波长处测定各管吸光度值。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝1.5175x-0.0578，R²＝0.9989(如图1)。

d、将样品吸光度值带入标准曲线y＝1.5175x-0.0578，得到各测定液相当于葡萄糖的毫克数，再根据公式即可计算出桑叶还原糖、桑叶水溶性糖、桑叶总糖及桑叶多糖的含量。

桑叶中还原糖、水溶性糖、总糖及多糖含量按如下公式进行计算：

还原糖(以葡萄糖计)％＝

水溶性糖(以葡萄糖计)％＝

总糖(以葡萄糖计)％＝

桑叶多糖(％)＝[桑叶总糖(％)－桑叶水溶性糖(％)]×0.9

式中：m₁——查曲线所得测定液中还原糖相当于葡萄糖毫克数，mg；

m₂——查曲线所得测定液中水溶性糖想当于葡萄糖毫克数，mg；

m₃——查曲线所得测定液中总糖相当于葡萄糖毫克数，mg；

V₀——测定液体积，V₀＝0.4mL；

V₁——还原糖提取液体积，V₁＝100mL；

V₂——水溶性糖提取液体积，V₂＝100mL；

V₃——总糖提取液体积，V₃＝100mL；

N₁——还原糖提取液稀释倍数，N₁＝1；

N₂——水溶性糖提取液稀释倍数，N₂＝2；

N₃——总糖提取液稀释倍数，N₃＝1；

M——桑叶样品质量，g。

计算得到桑叶还原糖、水溶性糖、总糖结果如表1所示：

表1、实施例1中桑叶还原糖、水溶性糖、总糖测定结果

注：每个样品平行提取三组，每组平行测定两次，两次测定的算术平均值为组内平均值，三组组内平均值的算术平均值为组间平均值，下同。

根据表1中的测定结果，可以求的实施例1中桑叶多糖的含量为：

桑叶多糖(％)＝(24.12％-13.19％)×0.9＝9.84％

实施例2

相关试剂配制、桑叶还原糖、水溶性糖、总糖的提取方法同实施例1。

葡萄糖标准溶液配制：按照实施例1的方法配制葡萄糖标准溶液，终浓度为1.056mg/mL。

葡萄糖标准曲线制作：取11支10mL比色管，分别加入0.00mL、0.08mL、0.16mL、0.24mL、0.32mL、0.40mL、0.48mL、0.56mL、0.64mL、0.72mL、0.80mL葡萄糖溶液(加入0.00mL葡萄糖溶液做空白对照)，加水稀释到0.80mL，再加入0.60mLDNS试剂，摇匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入蒸馏水至刻度(10mL)，摇匀，于540nm波长处测定各管吸光度值。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝1.5802x-0.0631，R²＝0.9997(如图2)。

样品中含糖量的测定及计算同实施例1。

实施例2中桑叶还原糖、水溶性糖、总糖测定结果见表2：

表2实施例2中桑叶还原糖、水溶性糖、总糖测定结果

根据表2中的测定结果，可以求的实施例2中桑叶多糖的含量为：

桑叶多糖(％)＝(34.56％-17.24％)×0.9＝15.59％

实施例1和实施例2结果表明：利用DNS比色法测定桑叶还原糖、水溶性糖和总糖，平行性好，且能通过计算求出桑叶多糖的含量。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。