稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体的制备方法及应用。包括1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒的制备：稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒采用溶剂热法制备，制得的直径为20～50纳米；2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒；3)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺。纳米载体的粒径为200～400纳米。制备的基因纳米载体的基因转染效率为35～55％，细胞存活率为80％～95％。可以通过在的照射，检测红色长余辉的位置来实时跟踪基因所到达的目的位置。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可实时跟踪外源基因的稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳 米载体的制备方法及应用。

背景技术

基因转染是一种非常常规的生物和医药技术，但是通常的基因转染用的试剂是相对 分子质量为25,000的聚醚酰亚胺(PEI)，虽然该PEI比相对分子质量为600的PEI的 转染效率高，但是其细胞毒性也比相对分子质量为600的PEI大得多，因此将相对分子 质量为600的PEI连接至一纳米微球上便可以成功制备出一种转染效率高，细胞毒性低 的新型基因转染载体。

此外，用常规的基因转染试剂进行转染细胞时，很难方便的示踪基因载体的具 体位置，也就无法判定目标细胞是否有外源基因的的进入。稀土镨元素掺杂的红色 长余辉发光材料是一种在紫外光照射后，能够持续的发射出红光的新型发光材料， 这种在体外照射以后再植入体内的方法，克服了传统的光损伤和激发光难以穿透组 织的传统缺点。因此稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米发光材料在医学和生物学中 的应用相对于其他材料，具有极大的优越性。于是将镨元素掺杂红色长余辉材料制 作成为一种基因载体，就可以实现实时跟踪外源基因以及靶细胞的功能。因此，研 制出一种具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优 势的新型基因纳米载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研 和临床应用前景。

发明内容

本发明涉及一种可实时跟踪外源基因的稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳 米载体的制备方法及应用。

本发明的稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体的制备方法；步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒的制备：稀土镨元素掺杂的红色长余 辉纳米颗粒采用溶剂热法制备，制得的直径为20～50纳米；

2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒；

3)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接分子量为600的聚醚酰亚 胺。

所述步骤1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒的制备方法如下：

1)将2克Ca(NO)₃·4H₂O,600毫克Zn(NO)₂·6H₂O溶解至5～50毫升的无水乙醇中， 再加入100～200微升0.01mol/L的Pr(NO)₃；

2)另取一容器加入3.5毫升的钛酸正丁酯和500微升浓硝酸，混匀后与步骤1)混 合液混匀，于300～400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至80～150℃直至稀土盐溶液完 全蒸干，变成淡黄色固体；

3)冷却至50～60℃以下，将0.1～10克的淡黄色固体转移至一耐高温的缸锅中， 并放入马弗炉中；调节马弗炉温度并升温至700～1100℃，煅烧1～5小时；

4)待反应结束后，将样品冷却至50～60℃以下，得到红色长余辉材料；

5)取0.1～10克的上述红色长余辉材料至一研钵中，加入0.5～5毫升去离子水， 研磨1～3小时；

6)待研磨结束后，以1000～1800转/分钟，离心1～3分钟，取1～5毫升上清溶 液，以12,000～13,000转/分钟，离心1～10分钟，真空干燥沉淀，得到红色长余辉纳 米颗粒。

所述步骤2)水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒制备方法如下：

1)取红色长余辉纳米颗粒10～30毫克加入一反应容器中，超声完全溶解至5毫升 的乙醇中；

2)在反应容器中配制浓度为1％～2％的十六烷基三甲基溴化铵的溶液10～20毫升；

3)加入1～5毫升的无水乙醇和100～200微升1摩尔/升的二乙醇胺，于450～550 转/分钟，70～80℃加热条件下，搅拌反应10～30分钟；

4)向反应容器中加入200～300微升的正硅酸乙酯于400～500转/分钟，70～80℃ 加热条件下搅拌反应10～20分钟，然后关闭加热再于400～500转/分钟条件下，搅拌 反应30～45分钟；

5)反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～20分钟，并用无水乙醇洗 涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒；

6)取制得的二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒20～100毫克，用无水乙醇配制 成10～50毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

7)向反应容器中加入0.6～1克氯化钠，于400～500转/分钟，60～80℃加热条 件下搅拌反应4～8小时；

8)反应结束后，静止5～15分钟，将上清转移至一离心管中，以10,000～11,000 转/分钟，离心10～15分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀1～3遍，得到介孔二氧化硅包裹 的红色长余辉纳米颗粒；

9)取介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒10～20毫克，用无水乙醇配制成 10～100毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

10)加入20～50毫克的3-溴丙酸，以80～95W的功率超声完全溶解3-溴丙酸；

11)于400～500转/分钟，20～25℃条件下搅拌反应5～7小时；

12)待反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～15分钟，并用去离子 水洗涤沉淀1～3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒。

所述步骤3)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接分子量为600的聚 醚酰亚胺制备步骤如下：

1)取羧基化的介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒10～50毫克，用无水乙醇 配制成10～50毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

2)加入300～500微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400～500转/分 钟，20～30℃条件下搅拌反应5～7小时；

3)反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～15分钟，并用去离子水洗 涤沉淀1～3遍，即得到介孔二氧化硅包裹的红色长余辉基因纳米载体。

应用稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质 粒DNA至Hela细胞。

转染方法步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体吸附质粒DNA：将红色长余辉基因纳 米载体溶解至100～150微升的无菌去离子水中；取一无菌的1.5毫升的离心管，加入 80～100微升的OPTI-MEM无血清培养基和0.3～0.6微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒 DNA并充分混匀，再加入与质粒DNA的质量体积比为1：1～2的红色长余辉基因纳米载 体，并混匀后静止30～40分钟。

2)将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染基因至动物细胞：将上述含 有外源基因质粒DAN和红色长余辉基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔 板的海拉细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养3～4小时后吸取培养液，并加 入200～300毫升的新鲜完全培养液；培养18～20小时后于荧光显微镜观察并计算转染 效率。

稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体的粒径为200～400纳米。可实时跟踪 外源基因的稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体的基因纳米载体的基因转染效 率为35～55％，细胞存活率为85％～95％。本载体可通过体外紫外照射后与质粒DNA附和 后转染细胞，实时跟踪纳米载体所处的位置。

本发明的优势在于：1)制备的基因纳米载体的基因转染效率为35～55％，细胞存活 率为80％～95％。2)可以通过在的照射，检测红色长余辉的位置来实时跟踪基因所到达 的目的位置。

附图说明

图1：用溶胶凝胶法制备的介孔稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米基因载体的透射 电子显微镜照片。

图2：将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)基因 至人宫颈癌细胞(Hela细胞)后的转染结果。

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

1.一种稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米材料的制备方法；步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒采用高温煅烧法制得：将2克 Ca(NO)₃·4H₂O,600毫克Zn(NO)₂·6H₂O溶解至5～50毫升的无水乙醇中，再加入100～200 微升0.01mol/L的Pr(NO)₃。

2)另取一容器加入3.5毫升的钛酸正丁酯和500微升的市售浓硝酸，充分混匀后 与上述混合液混匀，于300～400转/分钟磁力搅拌条件下，加热至80～150℃直至稀土 盐溶液完全蒸干，变成淡黄色固体。

3)冷却至50～60℃以下，将0.1～10克的上述淡黄色固体转移至一耐高温的缸锅 中，并放入马弗炉中；调节马弗炉温度并升温至700～1100℃，煅烧1～5小时。

4)待反应结束后，将样品冷却至50～60℃以下，得到红色长余辉材料。

5)取0.1～10克的上述红色长余辉材料至一研钵中，加入0.5～5毫升去离子水， 研磨1～3小时。

5)待研磨结束后，以1000～1800转/分钟，离心1～3分钟，取1～5毫升上清溶 液，以12,000～13,000转/分钟，离心1～10分钟，真空干燥沉淀保存备用，得到红色 长余辉纳米颗粒。

2.稀土镨元素掺杂的红色长余辉材料介孔二氧化硅纳米颗粒的改性，具体步骤如 下：

1)取步骤1中制得的红色长余辉纳米颗粒10～30毫克加入一反应容器中，超声完 全溶解至5毫升的乙醇中。

2)在反应容器中配制浓度为1％～2％的十六烷基三甲基溴化铵的溶液10～20毫升；

3)加入1～5毫升的无水乙醇和100～200微升1摩尔/升的二乙醇胺，于450～550 转/分钟，70～80℃加热条件下，搅拌反应10～30分钟；

4)向反应容器中加入200～300微升的正硅酸乙酯于400～500转/分钟，70～80℃ 加热条件下搅拌反应10～20分钟，然后关闭加热再于400～500转/分钟条件下，搅拌 反应30～45分钟；

5)反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～20分钟，并用无水乙醇洗 涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒；

6)取制得的二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒20～100毫克，用无水乙醇配制 成10～50毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

7)向反应容器中加入0.6～1克氯化钠，于400～500转/分钟，60～80℃加热条 件下搅拌反应4～8小时；

8)反应结束后，静止5～15分钟，将上清转移至一离心管中，以10,000～11,000 转/分钟，离心10～15分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀1～3遍，得到介孔二氧化硅包裹 的红色长余辉纳米颗粒；

9)取介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒10～20毫克，用无水乙醇配制成 10～100毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

10)加入20～50毫克的3-溴丙酸，以80～95W的功率超声完全溶解3-溴丙酸；

11)于400～500转/分钟，20～25℃条件下搅拌反应5～7小时；

12)待反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～15分钟，并用去离子 水洗涤沉淀1～3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒。

3.如步骤2所述的方法，其特征是介孔二氧化硅包裹的稀土镨元素掺杂的红色长 余辉基因纳米载体制备步骤如下：

1)取羧基化的介孔二氧化硅包裹的红色长余辉纳米颗粒10～50毫克，用无水乙醇 配制成10～50毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；

2)加入300～500微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400～500转/分 钟，20～30℃条件下搅拌反应5～7小时；

3)反应结束后，以10,000～11,000转/分钟，离心10～15分钟，并用去离子水洗 涤沉淀1～3遍，即得到介孔二氧化硅包裹的红色长余辉基因纳米载体。

4.稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒 DNA至Hela细胞。

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体吸附质粒DNA：将权利要求4所述中 制得的红色长余辉基因纳米载体溶解至100～150微升的无菌去离子水中。取一无菌的 1.5毫升的离心管，加入80～100微升的OPTI-MEM无血清培养基和0.3～0.6微克的绿 色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入与质粒DNA的质量体积比为1：1～2 的红色长余辉基因纳米载体，并混匀后静止30～40分钟。

2)将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染基因至动物细胞：将上述含 有外源基因质粒DAN和红色长余辉基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔 板的海拉(Hela)细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养3～4小时后吸取培养 液，并加入200～300毫升的新鲜完全培养液。培养18～20小时后于荧光显微镜观察并 计算转染效率。

实施例1：

稀土镨元素掺杂的红色稀土长余辉基因纳米载体的制备方法,具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒采用溶剂热法制得：具体物质的摩尔分 数比为氯化钇：氯化镱：氯化镨为750:250：3，将上述三种物质加入到2毫升去离子水 中，于100转/分钟磁力搅拌条件下，加热至100℃直至稀土盐完全溶液变成白色固体。 待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80℃以下，用移液管加入2毫升油酸及5毫 升十八烯，并升温至150℃使盐溶液完全溶解。冷却至60℃以下，加入溶有50毫克氢 氧化钠、100毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液；调节温度并升温至120℃，采用油泵抽真 空10分钟。通入氩气，迅速升温到280℃，维持在100转/分钟磁力条件下，搅拌反应 0.5小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。

2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒：取 上述步骤制得的红色长余辉纳米颗粒2毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以50W的功率超声混匀。再 称取50毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二 氯苯，以50W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于100转/分钟，100℃磁力搅 拌条件下反应2小时。待反应结束后，以11,000转/分钟，离心20分钟，并用去离子 水洗涤沉淀1遍，即制得水溶性的红色长余辉纳米颗粒。

3)水溶性稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI)：将 上述步骤制得的水溶性红色长余辉纳米颗粒溶解至2毫升的去离子水中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入50微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于 20℃加热，100转/分钟磁力条件下，搅拌反应6小时。待反应结束后，以11,000转/ 分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1遍，即制得可以吸附DNA的红色长余辉 基因纳米载体。

实施例2：

稀土镨元素掺杂的红色稀土长余辉基因纳米载体的制备方法,具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒采用溶剂热法制得：具体物质的摩尔分 数比为氯化钇：氯化镱：氯化镨为750:250：4，将上述三种物质加入到3毫升去离子水 中，于300转/分钟磁力搅拌条件下，加热至120℃直至稀土盐完全溶液变成白色固体。 待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80℃以下，用移液管加入5毫升油酸及10 毫升十八烯，并升温至160℃使盐溶液完全溶解。冷却至60℃以下，加入溶有75毫克 氢氧化钠、200毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液；调节温度并升温至120℃，采用油泵抽 真空30分钟。通入氩气，迅速升温到300℃，维持在300转/分钟磁力条件下，搅拌反 应0.75小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。

2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒：取 上述步骤制得的红色长余辉纳米颗粒8毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以80W的功率超声混匀。再 称取100毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二 氯苯，以80W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于300转/分钟，120℃磁力搅 拌条件下反应4小时。待反应结束后，以10,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子 水洗涤沉淀2遍，即制得水溶性的红色长余辉纳米颗粒。

3)水溶性稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI)：将 上述步骤制得的水溶性红色长余辉纳米颗粒溶解至3毫升的去离子水中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入100微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于 30℃加热，300转/分钟磁力条件下，搅拌反应9小时。待反应结束后，以10,000转/ 分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即制得可以吸附DNA的红色长余辉 基因纳米载体。

实施例3：

稀土镨元素掺杂的红色稀土长余辉基因纳米载体的制备方法,具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒采用溶剂热法制得：具体物质的摩尔分 数比为氯化钇：氯化镱：氯化镨为750:250：5，将上述三种物质加入到5毫升去离子水 中，于500转/分钟磁力搅拌条件下，加热至150℃直至稀土盐完全溶液变成白色固体。 待水份完全水蒸干后，关闭加热并冷却至80℃以下，用移液管加入10毫升油酸及30 毫升十八烯，并升温至180℃使盐溶液完全溶解。冷却至60℃以下，加入溶有100毫 克氢氧化钠、300毫克氟化铵的5毫升甲醇溶液；调节温度并升温至120℃，采用油泵 抽真空40分钟。通入氩气，迅速升温到320℃，维持在500转/分钟磁力条件下，搅拌 反应1小时。待反应结束后加入丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理，以备后用。

2)采用配体交换法制备水溶性羧基化稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒：取 上述步骤制得的红色长余辉纳米颗粒10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺，以100W的功率超声混匀。 再称取200毫克的无水柠檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的 二氯苯，以100W的功率超声混匀。将上述两种溶液混匀，于500转/分钟，150℃磁 力搅拌条件下反应6小时。待反应结束后，以11,000转/分钟，离心20分钟，并用去 离子水洗涤沉淀3遍，即制得水溶性的红色长余辉纳米颗粒。

3)水溶性稀土镨元素掺杂的红色长余辉纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI)：将 上述步骤制得的水溶性红色长余辉纳米颗粒溶解至5毫升的去离子水中并转移至一10 毫升的玻璃瓶中，然后加入200微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于 80℃加热，500转/分钟磁力条件下，搅拌反应12小时。待反应结束后，以9,000转/ 分钟，离心5分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即制得可以吸附DNA的红色长余辉基 因纳米载体。

实施例4：

稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA 至Hela细胞，具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体吸附质粒DNA：将权利要求3所述中 制得的红色长余辉基因纳米载体溶解至100微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫 升的离心管，加入50微升无血清培养基OPTI-MEM和0.3微克的绿色荧光蛋白(GFP) 质粒DNA并充分混匀，再加入1微升装红色长余辉基因纳米载体，并混匀后静止10分 钟。

2)将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染基因至动物细胞：将上述含 有外源基因质粒DAN和红色长余辉基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔 板的海拉(Hela)细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4小时后吸取培养液， 并加入200毫升的新鲜完全培养液。培养24小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表 达效率，基因表达效率如图2所示。

实施例5：

稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA 至Hela细胞，具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体吸附质粒DNA：将权利要求3所述中 制得的红色长余辉基因纳米载体溶解至100～500微升的无菌去离子水中。取一无菌的 1.5毫升的离心管，加入100微升无血清培养基OPTI-MEM和0.1微克的绿色荧光蛋白 (GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入1～5微升装红色长余辉基因纳米载体，并混匀后 静止20分钟。

2)将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染基因至动物细胞：将上述含 有外源基因质粒DAN和红色长余辉基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔 板的海拉(Hela)细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6小时后吸取培养液， 并加入300毫升的新鲜完全培养液。培养36小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表 达效率，基因表达效率如图2所示。

实施例6：

稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染外源绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA 至Hela细胞，具体步骤如下：

1)稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体吸附质粒DNA：将权利要求3所述中 制得的红色长余辉基因纳米载体溶解至500微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫 升的离心管，加入200微升无血清培养基OPTI-MEM和3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质 粒DNA并充分混匀，再加入1～5微升装红色长余辉基因纳米载体，并混匀后静止30分 钟。

2)将稀土镨元素掺杂的红色长余辉基因纳米载体转染基因至动物细胞：将上述含 有外源基因质粒DAN和红色长余辉基因纳米载体的复合物全部加入至一24孔板或48孔 板的海拉(Hela)细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养8小时后吸取培养液， 并加入500毫升的新鲜完全培养液。培养48小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表 达效率，基因表达效率如图2所示。

实施例7：

形态观察、粒径及其分布测定。取介孔红色长余辉纳米基因载体溶液经离心分离后， 取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状 态并拍照。透射电镜下观察到介孔红色长余辉纳米基因载体呈均匀规则的球形粒子，其 直径在80～150nm范围内可控。所制得的纳米载体如图1所示。

本发明公开和提出的稀土铥元素掺杂的蓝色上转换纳米基因载体的制备及应用，本 领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法 和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制 备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。