一株纺锤芽孢杆菌及其在干旱山地造林中的应用

摘要

本发明公开了一种纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)L106，已于2013年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7666。本发明的纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)L106，应用到金银花的干旱山地造林中，同接种普通根际促生细菌均相比，可显著提高造林成活率、存活率，同时可促进造林植物的生长，提高植物的抗干旱能力。因此，本发明为提高植物的抗旱能力提供了优良的菌株资源，为提高干旱山地造林成活率提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纺锤芽孢杆菌及其在干旱山地造林中的应用。

背景技术

随着全球气候与环境的变化，加之降水季节和地域分布极不均匀，水资源短缺日趋明显， 土壤有效含水量逐年减少，必将影响植物个体的生长、发育和繁殖。在一些干旱瘠薄山地地 区，土壤养分贫瘠，水资源短缺，造林成活率极低，对生态环境产生严重影响，如何提高这 些地区的造林成活率和存活率显得尤为重要。

目前，通过接种外源基因的和人工合成菌剂来提高植物在干旱环境中适应能力，是近年 来国内外研究的一个热点领域。PGPR是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对 病原菌有拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用。目前关于 PGPR筛选及应用研究报道很多，大量文献证明，PGPR可改善植物生长的根际土壤生态环境， 尤其是促进根际土壤的群落结构多样性，促进植物生长和干物质积累。本发明人从核桃根际 土壤中筛选出了一株适宜干旱环境中应用的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)L90，可提高核 桃的干旱适应能力，已经获得专利授权，专利号：201310654963.9。然而，干旱生境中，大 量微生物不能成活，不同的环境条件，诸如气象、温度、水分、土壤性质或其他土著微生物 活力等均会对细菌生长造成影响，在干旱生境中接种一些常用的PGPR对植物抗旱能力影响 有限。因此，继续筛选干旱生境下应用的根际促生细菌，对提高植物的抗旱能力，提高干旱 瘠薄本山地的造林成活率，改善生态环境具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种纺锤芽孢杆菌及其在干旱山地造林中的 应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106，已于2013年5月31日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7666，保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

含有上述纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106的组合物。

一种菌剂，其活性成分上述的纺锤芽孢杆菌。

所述的菌剂还包括载体；所述载体为固体载体或液体载体。

所述菌剂的剂型为液剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

一种复配菌，包括纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106。

上述的纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106、菌剂或复配菌在干旱山地造林中的应用。

优选：所述的干旱山地为金银花的干旱山地。

所述菌剂的制备方法：将纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106接入牛肉膏蛋白胨培 养基振荡发酵培养制成。

优选：应用的具体步骤为：将上述的菌液稀释90-150倍(优选100倍)，均匀浇灌至苗 木周围即可。

本发明的有益效果：

本发明的纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)L106，应用到金银花的干旱山地造林中，同 接种普通根际促生细菌均相比，可显著提高造林成活率、存活率，同时可促进造林植物的生 长，提高植物的抗干旱能力。因此，本发明为提高植物的抗旱能力提供了优良的菌株资源， 为提高干旱山地造林成活率提供了新的方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

1.菌株的分离：

采集山东省新泰市汶南镇长期处于干旱环境的果园土壤4个。通过梯度稀释法，从土样 中分离出细菌分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否 纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。向含有L-色氨 酸的R₂A液体培养基中接菌，28℃，180rpm，摇床培养4d。取50微升菌悬液滴于白色陶瓷 板上，同时加入50微升Salkowski比色液(50ml35％HCLO₄+1ml0.5mol/LFeCl₃)。将加入 50mg/LIAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红 者表示能够分泌IAA，初筛出分泌IAA的细菌。然后通过小麦保绿法筛选出14株保绿效果 较好的菌株，结合萝卜子叶增重法，最终通过金银花的干旱胁迫盆栽试验筛选出1株具有应 用潜力的细菌，记为L106。

2.菌株的鉴定

(1)菌落特征及菌体形态

纺锤芽孢杆菌L106在LB平板上培养24h后形成乳白色菌落，不透明，圆形，边缘整 齐光滑，中间有突起褶皱，菌体细胞大小为(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm，产芽孢，G⁺，细 胞呈杆状。培养的细胞经扫描电镜观察，细胞呈杆状,周生鞭毛,无荚膜,细胞质均匀。芽孢 端生,孢囊膨大,

(2)生理生化特征

革兰氏染色试验阳性，马尿酸盐水解试验阴性，酪氨酸水解试验阴性，淀粉水解试验阴 性，明胶液化试验阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气阴性，木糖产酸试验阴性，麦芽 糖产酸试验阴性，伏-普试验阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，硝酸盐还原实验阴性。

(3)产吲哚乙酸(IAA)能力测定

将纺锤芽孢杆菌L106接种于LB培养基，28℃，180rpm摇床培养4d。用分光光度法 测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积 Salkowski(50mL35％HClO₄+1mL0.5MFeCl₃)比色液，避光静置30min，测定其OD530 值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的 标准曲线计算IAA的含量。通过测定，纺锤芽孢杆菌L13产IAA含量为92.51μg/(mL·OD₆₀₀)^-1。

(4)解磷能力分析

菌株在固体培养基上解磷能力的测定：分别把菌株接种于无机磷固体培养基中，分别倒 置于37℃、28℃恒温箱中培养7d，观察透明圈的产生情况。结果表明，L106不具备解磷能 力。

(5)产蛋白能力分析

采用Folin酚法。将1mL原发酵液加2mL质量分数为0.5％的酪蛋白液在pH值7.0、37℃ 水浴15min，再用质量分数为10％的三氯乙酸灭活，然后取1mL上述反应液的离心上清液 加1mLFolin酚在5mL0.55mol/L的Na2CO3的碱性条件下37℃水浴15min测660nm下的 吸光度值。以加灭活酶液的反应系统为空白。在此反应条件下定义：每1min生成1ug酪氨酸 所需酶量定义为一个酶活。L106发酵24h后酶活达到28.54ug/ml，48h后酶活达到69.67ug/ml。

(6)16SrDNA序列分析

将所测16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示与GenBank数据库中的序列比对，结果表明： L106同Bacillusfusiformis在一个最小分支，进化距离最近。L106同Bacillusfusiformis(D84013) 的相似度为98.47％，将L106鉴定为纺锤芽孢杆菌Bacillusfusiformis。并进行保藏，保藏日期： 2013年5月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7666，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 具体的16SrDNA序列如下：

TGCTGGCTGACAGTAGAGAGATGCAGTCGAGCGAACAGAAAAGGAGCTTGCTCCTTTG ACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCCTATAGTTTGGGATAAC TCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTCTTTTGCTTCATGGTGAAAGACTGAAA GACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTA ACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGG CGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTC TGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTGACGGTACCTTATTA GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTG TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCC CACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAA AGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCG AAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA CTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATAT AGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTA GTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGT TGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT GCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGA AGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAGAGATGAGTTACCCTAACCC

3.盆栽试验

选择4种不同的植物根际促生细菌，分别为：纺锤芽孢杆菌L13(保藏号：CGMCC No.7068，简称L13)、乙酸钙不动杆菌X128(保藏号：CGMCCNo.7071，简称：X128)、蜡 样芽孢杆菌L90(保藏号：CGMCCNo.7069，简称：L90)和本发明的纺锤芽孢杆菌L106(保 藏号：CGMCCNo.7666，简称：L106)。将植物根际促生细菌接入牛肉膏蛋白胨培养基(牛 肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.0-7.2，以上均为质量百分比)，于37℃， 180rpm条件下振荡培养2d。发酵液6000rmin^-1下离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体3 次后，无菌生理盐水调节菌悬液(2.12×10⁸cfu/mL)制成接种剂。盆栽用盆高25cm，宽30cm， 每盆装土13kg，选择基本一致的金银花容器苗，定殖。30d后，取配置好的4种不同菌液 10ml，稀释至150ml，分别均匀的浇灌于金银花苗根系周围，然后浇水至田间持水量的80％， 同时设置浇灌等量无菌生理盐水试验，正常管理。60d后，开始进行干旱胁迫，控制水分含 量为田间持水量的40％左右。21d后，测定金银花的光合特性及叶片相对含水量结果具体见 表1。可以看出，干旱环境下接种L106可显著提高金银花的光合速率和叶片相对含水量，这 说明同接种其他菌种相比，L106更能够减轻金银花在干旱胁迫条件下受到的抑制。因此，L13 在提高金银花抗旱能力中最具应用前景。

表1干旱胁迫21d后，测定不同处理的金银花光合特性及叶片相对含水量

4.造林实验

按照盆栽实验的方法制造L106菌液，在莱芜市莱城区苗山镇北苗山村的牛旺泉北山安排 造林试验，安排造林试验。造林苗木选用金银花容器苗。批量挖好树穴后，定植金银花容器 苗，定植后取5ml的L106菌液稀释100倍，均匀浇灌至容器苗周围，设置浇灌等量的水作 为对照。调查造林当年调查成活率，并于翌年调查存活率和干重，结果如表2所示。可以看 出，接种L106后不仅可显著促进金银花的生长，且不同程度的提高了金银花的造林成活率和 保存率。因此，L106在金银花造林中具有很大的应用价值。

表2不同处理侧柏的生长、成活率及保存率

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属 领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性 劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。