一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法及用途

摘要

本发明涉及一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法及提取物的用途。本发明所述的毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法具有很高的提取率和优异的分离效果，能够得到多种活性化合物，所提取的活性化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌表现出较高的抗菌活性，在抗菌领域具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法及用途，属于植物提取领域。

背景技术

毛叶山桐子，又称为水冬瓜，是山桐子的变种。其果实中主要含有脂肪酸、酚类、糖甙、生物碱、维生素E等，并具有一定的生物活性，被广泛应用于抗菌、杀菌、抗氧化、强心、降血压等领域。

基于毛叶山桐子提取物产品广谱性应用的巨大需求，我国黄河流域以南的大部分省份例如：浙江、江苏、安徽、湖北、河南、山东、广东、江西、贵州、四川、云南、重庆、陕西等地均出现大面积人工栽种，产品研发机构和生产厂家也应运而生。

目前，从天然植物中提取抗菌物质的研究有很多，这些提取物的种类主要由挥发油、有机酸、生物碱、鞣质、某些内酯等。

例如，CN1740137A公开了一种从葵花粕中提取纯化绿原酸的方法，而绿原酸具有抗菌消炎、利胆、止血及增高白血球数量的作用。

CN1789395A公开了具有抑菌和/或杀菌作用的藏药异叶青兰挥发油及其在制备具有抑菌和/或杀菌作用的产品中的应用。

CN101084989A公开了同时制备苦参总黄酮提取物和总生物碱提取物的制备方法，苦参总黄酮提取物和苦参总生物碱提取物具有抗菌杀虫、抗病毒、抗炎，可用于抗菌和杀菌等领域。

周燕等(周燕等，水冬瓜果肉的非油脂化学成分[J].天然产物研究与开发,2003,15(1):13-17)发现水冬瓜果皮的乙醇提取物用石油醚脱脂后的浸膏对腊状芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的生长具有明显的抑制作用，而且发现它对离体蟾蜍心脏的作用实验表明该萃取物具有一定的强心作用，但未对各单体化合物做进一步的活性研究。葛红光等(葛红光,吴婉蛾,陈开勋.水冬瓜籽中天然抗氧化剂研究[J].中国油脂,1998,23(6):49-51)用烘箱法测试水冬瓜种子提取物抗氧化活性时，发现它具有很强的抑制猪油氧化作用。他们将水冬瓜种子乙醇提取物以水悬浮，分别以乙酸乙酯、正丁醇萃取，发现正丁醇萃取物用量为4×l0^-4％时其抗氧化性已强于2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)的用量2×l0^-4％。

基于其良好的生物医药活性，研究人员还开展了对该植物的化学成分研究。周燕等(周燕等，水冬瓜果肉的非油脂化学成分[J].天然产物研究与开发,2003,15(1):13-17)从水冬瓜果肉乙醇浸膏的正丁醇萃取物还分离出常见化合物1,2-顺-环己二醇和邻苯二酚。KimSeungHyun等(KimSeungHyun等，Idesolide:ANewSpiroCompoundfromIdesiapolycarpa[J].Org.Lett.，2005,7(15):3275–3277)从水冬瓜果实甲醇提取物分离到结构复杂的醇类物质，并对该甲醇提取物的氯仿部分中得到一单体的螺环化合物，应用NMR、MS和单晶X射线衍射鉴定并将其命名为idesolide。在2007年，KimSeungHyun等(KimSeungHyun等，InhibitoryactivityofphenolicglycosidesfromthefruitsofIdesiapolycaroaonlipopolysaccharide-inducednitricoxideproductioninBV2microglia[J].PlantaMedica,2007,73(2):167-169)又从水冬瓜果实甲醇提取物的乙酸乙脂部分分离得到1-hydroxy-6-oxocyclohex-2-enecarboxylicacidmethylester，后者可能是前者的分解产物。

虽然人们已经发现山桐子属植物含有重要的酚性糖甙、二萜等活性成分，毛叶山桐子果实早已被用于杀虫、除草等农业活动，但化学成分与生物活性报道较少。

因而，针对现有技术缺陷，本发明旨在开发一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法，采用简单、快捷的提取方法提取出四个化合物，并对其结构进行了分析和确认，分别为β-香树脂醇、β-谷甾醇、二十碳酸、6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。同时，化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇、6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌表现出较高的抗菌活性，将在抗菌剂、杀菌剂、消毒剂、清洁剂、清洗剂、防腐剂等领域具有应用前景。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明人进行了潜心研究，在付出大量创造性劳动后，从而完成了本发明。

本发明涉及一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法及用途，所述提取方法不仅简单、便捷，而且提取率较高，同时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌表现出较高的抗菌活性。更具体而言，本发明涉及一种水冬瓜中抗菌成分即β-香树脂醇、β-谷甾醇和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷的提取方法，以及它们在抗菌剂、杀菌剂、消毒剂、清洁剂、清洗剂、防腐剂领域中的应用。

具体而言，第一方面，本发明提供了一种毛叶山桐子中抗菌成分的提取方法，包括以下步骤：

(1)从干燥的毛叶山桐子果实分离出果皮和种子，将种子粉碎后得干粉，以乙酸乙酯为溶剂微波浸提3-5次，微波功率为500-1000W，每次10-20分钟，分离提取液，浓缩提取液得乙酸乙酯提取浸膏，分离所得的滤渣再用质量百分比浓度为70％的乙醇提取4次，每次10小时，合并提取液，浓缩至无醇味，得乙醇提取浸膏；取乙醇提取浸膏，经100-200目硅胶柱，干法上样，硅胶柱先后以二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇进行洗脱，从而将其分为3个部分，分别为二氯甲烷部分、乙酸乙酯部分和甲醇部分。

(2)将步骤(1)所得乙酸乙酯提取浸膏经固相柱层析，以环己烷-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，分别得到化合物β-香树脂醇和化合物β-谷甾醇；

(3)将上述步骤(1)中乙醇提取浸膏层析柱洗脱后得到的乙酸乙酯部分，过大孔吸附树脂柱，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，分别得到化合物二十碳酸CH₃(CH₂)₁₈COOH和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

其中，β-香树脂醇、β-谷甾醇、6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷的结构式如下：

在本发明的水冬瓜中抗菌成分的提取方法中，所述步骤(1)中的微波功率为500-1000W，例如为500W、600W、700W、800W、900W或1000W，更优选为600-800W，最优选为700W。

在本发明的水冬瓜中抗菌成分的提取方法中，所述步骤(2)的具体操作如下：将步骤(1)所得乙酸乙酯提取浸膏经固相柱层析，以环己烷-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，梯度洗脱混合溶剂中环己烷、丙酮的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1和5:1；收集两者体积比为30:1、25:1、20:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥，得到化合物β-香树脂醇；收集两者体积比为15:1、10:1和5:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥，得到化合物β-谷甾醇。

在本发明的水冬瓜中抗菌成分的提取方法中，所述步骤(3)的具体操作如下：将上述步骤(1)中乙醇提取浸膏层析柱洗脱后得到的乙酸乙酯部分，过大孔吸附树脂柱，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，梯度洗脱混合溶剂中石油醚、乙酸乙酯的体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1和5:1，收集25:1和20:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥得到化合物二十碳酸CH₃(CH₂)₁₈COOH；收集15:1、10:1和5:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥得到6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

在本发明的水冬瓜中抗菌成分的提取方法中，所述步骤(2)中的固相柱为中性氧化铝柱。

其中，所述中性氧化铝的粒度为100-500目，最优选为100-200目。

在本发明的水冬瓜中抗菌成分的提取方法中，所述步骤(3)中的大孔吸附树脂为DM301树脂、AB-8树脂、DA201树脂、D101树脂、X-5树脂或DM130树脂。

其中，所述大孔吸附树脂优选为AB-8树脂、DM301树脂、DA201树脂或者D101树脂，最优选为D101树脂。

第二方面，本发明涉及使用上述方法提取得到的β-香树脂醇、β-谷甾醇或6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

第三方面，本发明涉及上述提取到的活性化合物的用途。

本发明人发现，通过本发明方法提取得到的化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇、6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌表现出较高的抗菌活性，因而可应用到抗菌剂、杀菌剂、消毒剂、清洁剂、清洗剂、防腐剂等领域。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式仅用于例举，而并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。

实施例1

(1)从干燥的毛叶山桐子果实分离出果皮和种子。将种子粉碎后得干粉，以乙酸乙酯用微波浸提5次，微波功率为：700W，每次15分钟，浓缩提取液得乙酸乙酯提取浸膏，分离所得的滤渣再用质量百分比浓度为70％的乙醇提取4次，每次10小时，合并提取液，浓缩至无醇味，得乙醇提取浸膏。取乙醇提取浸膏，经规格为100-200目粒度范围的硅胶柱，干法上样，硅胶柱先后以二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱。根据TLC检测的结果，将其分为3个部分，分别为二氯甲烷部分、乙酸乙酯部分和甲醇部分。

(2)将步骤(1)所得乙酸乙酯提取浸膏经100-200目中性氧化铝进行柱层析，以环己烷-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，梯度洗脱混合溶剂中环己烷、丙酮的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1和5:1；收集两者体积比为30:1、25:1、20:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥，得到化合物β-香树脂醇；收集两者体积比为15:1、10:1和5:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥，得到化合物β-谷甾醇。

(3)将上述步骤(1)中乙醇提取浸膏层析柱洗脱后得到的乙酸乙酯部分，过D101大孔吸附树脂柱，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，梯度洗脱混合溶剂中石油醚、乙酸乙酯的体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1和5:1，收集25:1和20:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥得到化合物二十碳酸CH₃(CH₂)₁₈COOH；收集15:1、10:1和5:1的洗脱流分，旋蒸除去溶剂，干燥得到6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

实施例2-6

除将实施例1步骤(1)中提取微波功率分别替换为500W、600W、800W、900W、1000W外，分别以与实施例1的相同方式实施了实施例2-6。

实施例7-9

除将实施例1步骤(3)中D101大孔吸附树脂分别替换为AB-8树脂、DM301树脂、DA201树脂外，以与实施例1的相同方式实施了实施例7-9。

上述实施例1-9得到的四个化合物的表征数据分别如下：

β-香树脂醇

m.p.：183-185℃。

IR(KBr)cm^-1：2919、2872、1463、1034。

EI-MSm/z：426[M]⁺。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz)δ：0.78(3H,s)、0.82(3H,s)、0.86(6H,s)、0.93(3H,s)、0.95(3H,s)、1.04(3H,s)、1.11(3H,s)，5.18(1H,t,J＝3.4Hz,H-12)，3.22(1H,dd,J＝4.4,11.2Hz,H-3α)，其中0.78(3H,s)、0.81(3H,s)、0.86(6H,s)、0.92(3H,s)、0.95(3H,s)、1.01(3H,s)、1.10(3H,s)为8个角甲基单峰，为五环三萜类化合物；

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：38.6、27.5、79.1、39.6、55.1、18.2、32.5、38.6、47.3、37.1、23.3、21.6、145.1、39.8、26.1、27.0、32.3、47.3、46.6、31.1、34.6、37.1、28.1、15.4、15.4、16.6、26.1、38.2、33.1、23.5。

β-谷甾醇

m.p.：135-138℃。

IR光谱显示有-OH(3433cm^-1)、-C＝C-基团(1630cm^-1，弱)。

EI-MSm/z：414[M]⁺。

¹H-NMR(CDCl₃)δ:5.35(1H,d,J＝5.2Hz)、3.50(1H,m)、1.01(3H,s)、0.92(3H,d,J＝6.8Hz)、0.91(3H,d,J＝6.7Hz)、0.84(3H,t,J＝7.3Hz)、0.82(3H,d,J＝7.2Hz)、0.66(3H,s)。

¹³C-NMR(CDCl₃)：37.1、31.5、71.6、42.1、140.5、121.5、31.8、32.0、50.1、36.4、21.0、39.6、42.1、56.6、24.2、28.0、56.0、11.6、19.2、36.0、18.6、34.0、26.0、45.7、29.0、19.6、19.2、23.0、11.9。

二十碳酸

m.p.：47-48℃。

IR：-C＝O(1707cm^-1)，长链CH₂(2920、2851、1466、730cm^-1)，

EI-MSm/z：312.2[m]⁺、284.2、256.2、185.1、171.1、129.0、111.0、97.0、83.0。

¹H-NMR(CDCl³)δ：0.75ppm(3H,CH₃)，1-2ppm内有17个CH₂，2-3ppm内有1个个CH₂。

6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷

m.p.：152-153℃。

IR：糖基(3422cm^-1处宽而钝的峰)、-C＝C-(1636cm^-1)、-C＝O(1740cm^-1)、-C-O-C-(1077cm^-1、1046cm^-1)、CH₂(2825cm^-1、1474cm^-1)。

EI-MSm/z：301.4、162.0、139.9、123.0、121.9。

¹H-NMR(CD₃OD)δ：7.06(1H,t,J＝7.7Hz)、6.86(1H,d,J＝7.6Hz)、6.81(1H,dd,J＝7.7Hz)、6.11(1H,m)、5.78(1H,dd)、5.53(1H,d,J＝12.2Hz)、5.31(1H,d,J＝12.5Hz)、4.60(1H,d,J＝5.8Hz)、3.84(1H,m)、3.76(1H,m)、3.52(3H,m)、3.42(1H,m)、2.90(1H,m)、2.63(1H,m)、2.52(2H,m)。

13C-NMR(CD₃OD)：144.5、131.4、120.9、126.9、118.1、151.3、65.1、107.4、75.2、77.9、80、78.4、62.4、79.3、129.6、132.8、27.2、36.9、207.6、171.8。

对比例1

除将实施例1中“微波浸提5次，微波功率为：700W，每次15分钟”替换为“以乙酸乙酯为溶剂在40℃下提取5次，每次2h”外，以与实施例1的相同方式实施本对比例1，得到化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇、二十碳酸和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

对比例2-3

除将实施例1步骤(2)中的混合溶剂环己烷-丙酮分别替换为环己烷-乙酸乙酯、环己烷-石油醚外，以与实施例1的相同方式实施本对比例2-3，经过TLC检测发现，在步骤(2)中β-香树脂醇和β-谷甾醇很难分开，导致其产率很低。

这证明当改变混合溶剂中的丙酮时，对于产物的分离效果有着显著的影响。

对比例4-5

除将实施例1步骤(3)中的大孔吸附树脂分别替换为“粒度为300-400目的硅胶柱色谱”和“粒度为100-200目的中性氧化铝柱色谱”外，以与实施例1的相同方式实施本对比例4-5，而得到化合物6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷。

将所有实施例和对比例中提取到的每个化合物的重量除以原水冬瓜种子的总重量而得出提取率，化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇、二十碳酸和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D葡糖苷的提取率如表1所示。

表1

由上表可以看出：

1.当进行微波萃取时，提取率要显著高于未进行微波萃取时的提取率，且当微波功率为700W时具有最好的提取效果。

2.步骤(3)中使用特定的大孔吸附树脂进行分离时，提取率要远高于硅胶柱色谱和中性氧化铝柱色谱，但D101树脂的提取效果要优于其它树脂。

3.当步骤(2)中改变洗脱混合溶剂的组分时，能够显著地影响β-香树脂醇和β-谷甾醇的分离，可见该步骤中的混合溶剂的类型选择非常关键和重要。

性能测试及稳定性测试

通过下述实验测定了各实施例得到的本发明提取到的化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D-葡糖苷的杀菌性能。

取标准菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(441490)菌株少许，分别接种于营养肉汤培养基中，37℃培养18h。取18h培养的各菌株营养肉汤培养物，用营养肉汤作10^-3稀释用于实验。取白色念珠菌菌株少许，接种于改良马丁培养基中，35℃培养24h。取24h培养的白色念珠菌培养物，用改良马丁培养基10^-3稀释用于实验。用二倍稀释法(试管法)配制样品，即受试化合物分别配成初浓度为10mg/ml，取0.1ml加5.9ml营养肉汤稀释过滤备用，对于每个受试化合物取灭菌试管8支，第1管加入受试药稀释液1ml，第2-8管各加1ml营养肉汤，分别取受试药稀释液1ml加入第2管中，混匀后取1ml至第3管，依次稀释，第7管吸出1ml弃去，第8管不加药液作为对照。每管加入稀释菌液0.1ml，37℃培养24h。取出观察细菌生长情况。如药液管混浊，即表示细菌生长，供试药物无抑菌作用；如药液管清亮则表示细菌生长受到抑制，其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液，即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。取盐酸环丙沙星片(广州白云制药有限公司，规格：0.25g/片，配成0.05g/m1溶液)、制霉素片(浙江震元制药有限公司，规格：500mg/片，配成200mg/ml溶液)，按上述方法，依次稀释，培养，作阳性对照，结果见下表2。

表2

由上表可以看出，本发明提取的化合物β-香树脂醇、β-谷甾醇和6-羟基-2-[[[(1-羟基-6-氧代-2-环己烯基)羰基]氧]甲基]苯基-β-D-葡糖苷具有良好的杀菌活性可用于抗菌剂、杀菌剂、消毒剂、清洁剂、清洗剂、防腐剂等领域。

应当理解，这些实施例的应用仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。