潜在EZH2小分子抑制剂及其合成方法

摘要

本发明公开了一种潜在EZH2小分子抑制剂及其合成方法。其合成方法的具体步骤如下：①将5?巯基?1?苯基四氮唑和4?氯乙酰乙酸乙酯在强碱作用下反应得到第一中间体；②将第一中间体在强碱作用下和盐酸胍反应得到第二中间体；③将第二中间体和异氰酸酯类或者异硫氰酸酯类化合物反应，生成目标化合物。本发明分离过程简单，不需要柱层析分离，步骤简单，方便进行工业化生产。本发明合成的目标化合物有很好的EZH2抑制活性，为恶性肿瘤药物的研发提供了一类新的小分子结构，这类小分子结构具有多样性，进一步的研究有助于开它的药用价值。

说明书

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，尤其涉及EZH2小分子抑制剂及其合成方法。

背景技术

在过去的几年，表观遗传修饰，如DNA的甲基化、组蛋白的甲基化和乙酰化已经显 示出对肿瘤的治疗有着良好的前景。研究发现，在血液性疾病和实体瘤中，如霍奇金病、非 霍奇金瘤、前列腺癌、乳腺癌、咽喉癌，都发现了EZH2的过表达，这表明EZH2的过表达与肿瘤 的产生及恶化都有着紧密的联系。因此，很多研究人员将其列为一个治疗癌症的重要靶点， 开发相应的抑制剂。这几年里，已经有几个有效的药物被用作临床抗肿瘤新药,如5-氮杂胞 苷,5-氮-2-脱氧胞苷，和GSK126。进一步的研究发现，组蛋白的甲基化是一个高度可逆的过 程，它与多个肿瘤的发生和发展都有着紧密联系。GSK126是第一个进入临床的组蛋白甲基 化抑制剂，并取得了良好的效果。所以，对于EZH2的深入研究就变得十分的必要，只有更全 面的了解EZH2的结构和生物功能，才能开发出更多高效、高选择性的抑制剂，为恶性肿瘤的 治疗带来新的希望。

在对PRC2的研究更加的深入后，几种潜在的EZH2抑制剂正逐渐出现在人们的视野 中。这些抑制剂中，DZNep可以通过和H3K27me3相互作用来抑制EZH2的表达，这样通过间接 的作用就可以达到使肿瘤细胞被抑制的目的。DZNep干扰S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的 新陈代谢，这样就降低了细胞的生存时间和能力，进而间接的抑制甲基化反应。DZNep诱导 细胞凋亡能力与抑制PRC2的途径有着紧密的关系，虽然确切的机制尚未能够研究清楚。此 外，已有文献报道，DZNep和组蛋白去乙酰酶抑制剂是互相作用的。同时，它还与激活沉默基 因的DNA甲基转移酶抑制剂相互协作。作为一个抗病毒化合物,DZNep在人体内的毒性很小。 同时，它在癌细胞的表观遗传途径中也有着很重要的作用，所以它可能是一种有前景的抗 癌候选药物。

在过去几年里的测试，发现这些小分子有很好的选择性，并且对特定细胞的抑制 活性也很高。不像其他类的一些小分子，同时对很多的细胞都有抑制的效果，没有很好的选 择性，达不到杀死特定恶性肿瘤细胞的目的。近期，通过研究发现，淋巴瘤中的EZH2都是高 度表达的,所以要抑制住EZH2的过表达,这样可以使淋巴瘤不会继续的增殖和恶化。研究人 员在前列腺癌和骨髓癌中也观察到EZH2发生了突变和失活。为此，研究人员开发了一些抑 制剂,它可以与酶蛋白相互作用,占用SAM的结合位点,再来和SAM竞争,这样EZH2的高表达 就可以得到有效的抑制,通过这个理念，从而开发出有效的高选择性竞争性抑制剂。

通过PRC2复合物的高通量生物筛选实验，来确定EZH2甲基转移酶的活性。几个有 潜力的抑制小分子已经被筛选出来。虽然活性位点的结构还没有确定，但保守域SET结构显 示了两个基本的结合口袋：一个是用于SAM的甲基供体，另一个是用于Lys27的基质。在人体 中已经发现了50多个SET结构域蛋白，所以抑制剂对EZH2中的SET结构域的选择变得很重 要。

在2012年年底,几个SAM的竞争型抑制剂已经被发现,化合物EPZOO5687对EZH2的 选择性与另外的15个PMTs相比,超过500倍。EPZ005687还可以抑制EZH2上的Y641和A677突 变引起的H3K27甲基化，发现该化合物可以有选择性的杀死由EZH2突变引起的淋巴瘤细胞。

EI1是Novartis发现的一个EZH2的抑制剂小分子,它表现出很高的选择性和抑制 率。EI1可以激活PRC2的目标基因，使EZH2失去H3K27的甲基化功能。同时在细胞测试中，EI1 在EZH2的野生型和Y641的突变出有着很高的抑制活性。在B细胞淋巴瘤中，对EZH2的Y64突 变抑制可以减少细胞的扩散与凋亡，缩短细胞的周期阻滞。

在这些抑制剂中，最有潜力的是GSK126，它的抑制效果突出，IC50达到纳摩级别。 它对EZH2的选择性是对20多种人体含有或不含有SET结构域甲基转移酶选择性的1000多 倍，也超过对EZH1选择性的150倍，GSK126能够有效的抑制扩散在DLBCL细胞株的EZH2突变 体。更重要的是，在动物实验中GSK126也有很好的细胞瘤抑制效果。EZH2的超表达与肿瘤的 恶化密切相关，GSK126为判断EZH2的表达是否是肿瘤发展的所需条件提供了参考。

总的说来，PRC2作为转录因子和基因活化子的功能被用来作为探索药物的基础。 尽管目前还没有批准临床或治疗的化合物出现，应做出更多的努力来开发EZH2的甲基转移 酶抑制剂。EZH2作为一个抗肿瘤的新靶点，进一步的发现和设计EZH2的抑制剂是十分必要 的，可以为肿瘤的治疗提供更多的方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一类潜在EZH2小分子抑制剂及 其合成方法。本发明通过计算机药效团模拟筛选出了好的分子结构，合成了活性好的小分 子，为恶性肿瘤的治疗提供一些参考。

本发明提供了一种潜在EZH2小分子抑制剂结构，进一步的设计了有效的合成路 线，并设计提供了一种关键的中间体。通过关键中间体的合成，进一步合成目标分子。

本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种潜在EZH2小分子抑制剂，其具有通式(1)所示结构：

其中：R₁为氧或硫，R₂选自苯基、取代苯基、苯甲酰基或者萘基中任一种；R₂为氧或 硫。

上述式(1)中，R₁为氧或硫，R₂选自苯基、4-卤素苯基、4-卤代烷基苯基、苯甲酰基或 者萘基中任一种；R₂为氧或硫。

本发明的潜在EZH2小分子抑制剂，其合成中间体具有通式(2)所示结构：

本发明还提供一种潜在EZH2小分子抑制剂的合成方法，具体步骤如下：

①将5-巯基-1-苯基四氮唑和4-氯乙酰乙酸乙酯在强碱作用下反应得到式(3)所 示结构的中间体；

②将式(3)所示结构的中间体在强碱作用下和盐酸胍反应得到式(2)所示结构的 中间体；

③将式(2)的中间体和异氰酸酯类或者异硫氰酸酯类化合物反应，生成式(1)所示 结构的目标化合物；其合成的化学反应方程式如下所示：

上述步骤①中，采用的反应溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇任一种或两种；采用的强 碱为氢氧化钾或氢氧化铯中任意一种；反应温度在15℃-75℃之间。

上述步骤②中，强碱选自氢氧化铯、甲醇钠、乙醇钠或LDA中任一种；反应溶剂采用 无水甲醇或无水乙醇，反应温度在50℃-170℃之间。

上述步骤②中，式(3)所示结构的中间体、盐酸胍和强碱的摩尔比为1:(2.05- 2.15)：(2.05-2.15)。

上述步骤③中，反应溶剂为非质子溶剂。

本发明的有益效果在于：

本发明合成路线简单，分离过程简便，有利于进行扩大生产。本发明合成的此类小 分子抑制剂有很好的EZH2抑制活性，为恶性肿瘤药物的研发提供了一类新的小分子结构， 这类小分子结构具有多样性，进一步的研究有助于开它的药用价值；

具体实施方式

实施例1

FTCI-2362

取1-苯基-5-巯基–1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶，滴加30ml甲醇，搅拌 至白色固体完全溶解。搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h，点 板反应完全。减压旋干甲醇，向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解，再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次，合并有机相，干燥，减压回收乙酸乙酯，得到无色油状液体2.82g(93％)。

取上一步得到的油状物1.5g(4.9×10-3mol)，加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.8×10-3mol)，加入含有0.53g(9.8×10-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后，旋干乙醇，水洗后收集有机相旋干。加入15ml去离子水，然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机相旋干得粗产物。用 丙酮-正己烷重结晶，最终得到关键中间体白色固体1.13g(77％)。

取中间体0.64g(2.1×10^-3mol)溶解于30ml乙腈中，加入2-萘基异氰酸酯，常温反 应5h，点板检测反应完成，生成目标物分子0.93g(96％)¹HNMR(501MHz,DMSO)δ10.02(s, 1H),8.06(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(d,J＝7.4Hz,1H),7.77(d,J＝ 8.2Hz,1H),7.54(ddt,J＝24.7,14.9,7.6Hz,9H),6.18(s,1H),4.48(s,2H)。

实施例2

FTCI-2377

取1-苯基-5-巯基–1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶，滴加30ml甲醇，搅拌 至白色固体完全溶解。搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h，点 板反应完全。减压旋干甲醇，向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解，再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次，合并有机相，干燥，减压回收乙酸乙酯，得到无色油状液体2.82g(93％)。

取上一步得到的油状物1.5g(4.9×10-3mol)，加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.8×10-3mol)，加入含有0.53g(9.8×10-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后，旋干乙醇，水洗后收集有机相旋干。加入15ml去离子水，然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机相旋干得粗产物。用 丙酮-正己烷重结晶，最终得到关键中间体白色固体1.13g(77％)。

将0.2g(0.66mmol)中间体溶解于15ml乙腈，加入对氯苯甲酰异硫氰酸酯0.15g (0.792mmol)，40℃回流反应8h，有白色固体析出，为目标物分子。¹HNMR(501MHz,DMSO)δ 7.97(s,2H),7.60(d,J＝67.3Hz,7H),6.78(s,2H),5.62(s,1H),4.25(s,2H),1.22(s,2H)。

实施例3

FTCI-2369

取1-苯基-5-巯基–1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶，滴加30ml甲醇，搅拌 至白色固体完全溶解。搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h，点 板反应完全。减压旋干甲醇，向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解，再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次，合并有机相，干燥，减压回收乙酸乙酯，得到无色油状液体2.82g(93％)。

取上一步得到的油状物1.5g(4.9×10-3mol)，加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.8×10-3mol)，加入含有0.53g(9.8×10-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后，旋干乙醇，水洗后收集有机相旋干。加入15ml去离子水，然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机相旋干得粗产物。用 丙酮-正己烷重结晶，最终得到关键中间体白色固体1.13g(77％)。

苯甲酰氯的无水乙腈溶液(1.4058g,0.01mol)(50毫升)逐滴加入到硫氰酸钾悬浮 液(0.9718克，0.01摩尔)无水乙腈(50毫升)中。将反应混合物在回流下加热45分钟，然后冷 却到室温。过滤，取滤液，得到苯甲酰异硫氰酸酯的乙腈溶液。取30ml上述溶液，向其中加入 0.2g(0.66mmol)中间体，回流反应8h，有浅黄色固体析出，过滤取滤渣，干燥得到目标物分 子固体0.2g(71％)。¹HNMR(501MHz,DMSO)δ7.94(s,1H),7.60(d,J＝67.3Hz,9H),6.67(s, 2H),5.66(s,1H),4.25(s,2H),1.24(s,2H)。

实施例4

FTCI-2301

取1-苯基-5-巯基–1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶，滴加30ml甲醇，搅拌 至白色固体完全溶解。搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h，点 板反应完全。减压旋干甲醇，向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解，再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次，合并有机相，干燥，减压回收乙酸乙酯，得到无色油状液体2.82g(93％)。

取上一步得到的油状物1.5g(4.9×10-3mol)，加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.8×10-3mol)，加入含有0.53g(9.8×10-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后，旋干乙醇，水洗后收集有机相旋干。加入15ml去离子水，然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机相旋干得粗产物。用 丙酮-正己烷重结晶，最终得到关键中间体白色固体1.13g(77％)。

将0.3g(1×10-3mol)中间体用重蒸THF15ml溶解，搅拌冰浴下滴加TEA0.5ml，冰 浴下滴加含有4-氯甲基苯甲酰氯0.21g(1.1×10^-3mol)的THF溶液滴加完毕，室温搅拌反应 3h，点板反应完成，减压旋干THF，加入饱和氯化铵溶液洗涤，再用二氯甲烷萃取水相，合并 有机相干燥旋干柱层析最终得到目标物分子0.2g(55％)。¹HNMR(501MHz,DMSO)δ8.10(d,J ＝8.1Hz,2H),7.67(d,J＝6.5Hz,7H),7.13(s,2H),6.68(s,1H),4.89(s,2H),4.58(s,2H)。

应用实施例

采用MTT法进行细胞抑制率检测，测试方法如下：

1.接种细胞：用含10％胎/小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-105 个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200μL。

2.培养细胞：同一般培养条件，培养1-2天(原代细胞不同，可根据试验目的和要求 决定培养时间，神经元7-10天，心肌细胞8-14天)。

3.吸去原培养基，每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物(原代细胞例 外)。

4.培养24或48h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用pH＝7.4的PBS配制，避光保存)10- 20μl.(每孔培养基为100μL，加10μl，每孔培养基为200μL，则加20μLl)。

5.37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮细胞需要离 心后再吸弃孔内培养上清液)。

6.每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

7.比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时 间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。根据方法获得的细胞抑制率结果如表1所示。

表1细胞抑制率测试结果