竹叶黄酮结合卡利比克毕赤酵母防治苹果采后病害的方法

摘要

本发明公开了竹叶黄酮结合卡利比克毕赤酵母防治苹果采后病害的方法，属于水果采后病害生物防治领域。将卡利比克毕赤酵母活化,接种到NYDB培养基中培养20h，离心得到菌体，将卡利比克毕赤酵母菌体用两倍终浓度的竹叶黄酮稀释成1×108 cells/mL的菌悬液（竹叶黄酮的终浓度为100μg/mL?500μg/mL之间)；将菌悬液均匀喷洒于苹果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温（20℃）条件下存放。本发明利用竹叶黄酮和卡利比克毕赤酵母结合使用提高其对苹果采后病害生物防治的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种竹叶黄酮(BLF)结合卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)防治苹果采后病害的方法，属于水果采后病害生物防治领域。

背景技术

苹果是世界四大水果之一，是世界温带地区栽培的最重要的果树树种，在世界果品市场中占有重要的地位。苹果的营养成分十分丰富。含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素C、维生素B1、维生素B2、胡萝卜素以及钙、磷、铁、柠檬酸、酒石酸等有机酸以及果胶、纤维素等。目前，全世界苹果生产国(地区)有80个左右，中国和南美是近20年来苹果发展最快的国家和地区。2001年世界苹果面积568.5万公顷，产量6.3×10¹⁰千克，其中我国苹果面积240.1万公顷，产量2.4×10¹⁰千克万吨，占世界苹果总面积和总产量的42.2％和38.2％，均位居世界首位。

苹果采后病害造成的损失是巨大的。根据一般保守的估计，我国苹果采后损失为10％-30％左右。导致苹果采后损失及品质恶化的因素有很多，包括由于水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质裂变；由于采后逆境造成的生理代谢失调；由于采后成熟衰老造成的水果组织结构的崩溃和由于病原物侵染造成的腐烂等。其中由于病原菌侵染造成的腐烂是导致水果采后损失的主要原因。引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多，但每种水果占优势的致病菌一般有2-3种。例如，苹果采后由真菌引起的病害主要为扩展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病及由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病。病原真菌对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上的严重损失，而且许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物会引起严重的食品安全问题，苹果上的主要致病菌扩展青霉(P.expansum)会产生棒曲霉素(patulin)。展青霉素又称棒曲霉素，是青霉属、曲霉属、丝衣霉属等霉菌代谢产生的一种有毒的真菌代谢产物，具有致癌、致畸变甚至致死等不良影响。

长期以来，控制果蔬采后病害的主要措施是使用杀菌剂。根据最新数据统计，杀菌剂在农作物病害防治市场约占26％份额，2011年销售金额高达133亿美元。化学杀菌剂具有经济、杀菌效果好、见效快的特点，常用的控制水果采后病害的化学杀菌剂主要有抑霉唑(Imazzlii)、苯菌灵(Benomyl)、双胍盐(Guazatine)。但过去十多年，公众和科学界对于食品和环境中农药(尤其杀菌剂)残毒问题的关注日益增加。杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有害于人类健康。美国国家科学院(NAS)的报道(1987)指出，杀菌剂的应用对人类健康造成了危害；全美9种致瘤化合物的销售量中，杀菌剂占90％左右，在用于食物的全部农药中，杀菌剂构成60％的致瘤危险。此外，高频率地使用单一种类的杀菌剂会使病原菌产生抗药性问题，使杀菌剂的防治效果大大降低。

因此，研究并利用化学杀菌剂的替代物来防治植物尤其果蔬的病害，是人类面临的一项紧迫任务。生物杀菌剂既能减轻有害微生物对果蔬侵染，又能保护环境，是生产安全性食品的有效方法。因而研究天然生物杀菌剂取代农药进行果蔬采后病害的防治，对减少食品中农药的残留，保护环境，确保人体健康，增加果蔬出口，都具有深刻的意义。

当前国际上越来越重视用有益微生物进行水果采后病害生物防治的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方向之一。酵母菌由于遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容，因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。

自从1953年，Gutter等首次报道了枯草芽孢杆菌对柑桔果实病原菌有拮抗作用以来，利用拮抗菌进行水果采后病害的生物防治目前已取得了突破性的进展，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法。例如在美国，自1979年美国环境保护署批准使用首个生物防治微生物作为生防菌以来，截止到2004年已有26个微生物(14种细菌和12种真菌)被该机构认可并注册。毕赤酵母(Pichia guilliermondii)是国际上最早被报道能抑制果实病原真菌的生物防治酵母，而Candida oleophilia isolate I-182已经在1995年作为生物杀菌剂在美国环境保护署(EPA)登记，并已经由美国Ecogen公司商业化。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隐球酵母(Cryptococcus albidus)也已经商业化，商品名为Yield Plus。

到目前为止，果蔬采后生物防治的研究已有半个世纪的历史，但实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于文献报道的拮抗菌大多用来防治果蔬伤口处的病原菌，而不是直接用在果蔬表皮防治正常果蔬的病原菌入侵；另一方面，在商业生产条件下，由于环境条件的不确定性，其防效或者达不到要求或者不稳定，且与化学杀菌剂相比防治成本较高；拮抗菌作为保鲜剂，其使用方式不及化学杀菌剂方便。此外，拮抗酵母需要较高浓度下才能有效作用的特点也将产生很大的经济成本压力。这些因素都影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的商业使用。因此拮抗酵母生物防治的效力必须得到进一步的提高和改进。

生防效果是判定拮抗菌好差的一个重要指标，也是判定微生物拮抗菌能否应用于实际生产的依据。最近几年的研究表明，可以从下面几个方面来提高拮抗菌的生防效果。1.使用拮抗菌的混合物混合使用拮抗菌有三大优点：(1)可以拓宽作用范围，防治多种病原菌；(2)可以增强有效性，减少使用频率；(3)可允许结合不同生物防治特征。2.与化学杀菌剂结合使用生物制剂与化学杀菌剂有效地结合起来，使得用比传统杀菌剂剂量更少的杀菌剂控制病害成为可能，从而把杀菌剂的使用量降低到对人体的安全剂量以下的水平，降低果蔬的农药残留。3.使用佐剂使用某些佐剂可以增加拮抗微生物群体数并增强其存活率，进而增加拮抗菌的生防能力。4.与某些金属离子混合使用5.结合其他措施的效果许多研究表明将热处理、冷藏等方法与生防拮抗菌结合使用，可以加强拮抗菌的抑菌效果。

竹叶黄酮是从竹叶中提取出来的具有生理活性的生物黄酮，是一种高效的生物抗氧化剂(Anti-Oxidant)，现代动物毒理实验充分证明了竹叶黄酮的安全可靠性。作为竹叶功能提取物，竹叶黄酮富含黄酮类物质，被广泛应用于食品添加剂。竹叶含有天然活性成分，具有多方面的生物功能作用和非常好的自由基清除作用。另外，作为食品添加剂，研究表明竹叶黄酮作为抗氧化剂和拮抗酵母结合使用，可以提高抗氧化酶活性和拮抗酵母对氧化胁迫的耐受性，从而提高其对水果采后病害的生物防治效力。

卡利比克毕赤酵母已经被证明具有拮抗效力，本发明利用竹叶黄酮和卡利比克毕赤酵母结合使用提高其对水果采后病害生物防治的效力，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。

发明内容

本发明利用竹叶黄酮(BLF)和卡利比克毕赤酵母结合使用，提高该酵母对水果采后病害的生物防治效力。与卡利比克毕赤酵母单独处理相比，竹叶黄酮和卡利比克毕赤酵母结合使用，可以明显地增强该酵母对苹果青霉病的抑制作用，防治其采后腐烂。本发明具有安全，高效，成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。

本发明采用的技术方案

本发明提供了竹叶黄酮结合卡利比克毕赤酵母防治苹果采后病害的方法，按照下述步骤进行：将卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)活化，用NYDB培养基培养卡利比克毕赤酵母，离心得到菌体，配制含竹叶黄酮的1×10⁸cells/mL的酵母菌悬液；将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温(20℃)条件下存放。

其中所述的NYDB培养基为：牛肉浸膏8g，酵母膏5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，pH自然。

其中所述的配制含竹叶黄酮的1×10⁸cells/mL酵菌悬液方法，按照下述步骤进行：将菌体用无菌水稀释制备成2×10⁸cells/mL菌悬液,与浓度为两倍终浓度的竹叶黄酮按体积比1:1混合，而竹叶黄酮的最终浓度为100μg/mL-500μg/mL。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)为本实验室筛选，其拮抗效力强,对人体无害。

(2)本发明所使用的竹叶黄酮(BLF)来源广泛，价格低廉，无毒无害。

(3)本发明使用竹叶黄酮和卡利比克毕赤酵母结合使用，与单独使用竹叶黄酮处理或卡利比克毕赤酵母处理相比，可以显著提高卡利比克毕赤酵母的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。

(4)本发明使用竹叶黄酮和卡利比克毕赤酵母结合使用，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对苹果青霉病的控制效果。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液；0.01％BLF：100μg/mL的竹叶黄酮(BLF)；0.025％BLF：250μg/mL的竹叶黄酮(BLF)；0.05％BLF：500μg/mL的竹叶黄酮(BLF)；0.01％BLF+Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液(含终浓度为100μg/mL的BLF)；0.025％BLF+Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液(含终浓度为250μg/mL的BLF)；0.05％BLF+Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液(含终浓度为500μg/mL的BLF)。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

图2为竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对苹果自然腐烂的影响。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；0.01％BLF：100μg/mL的竹叶黄酮；Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液；0.01％BLF+Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液(含终浓度为100μg/mL的BLF)。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

实施例1卡利比克毕赤酵母(P.carribbica)系本实验室筛选得到，申请中国发明专利并授权，专利号ZL201010198119.6，专利名称卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法。于NYDA(NYDB培养基的基础上添加2％的琼脂(质量计))培养基4℃低温保存。NYDB培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水l000ml，自然pH。

培养程序为：(1)固体活化：将卡利比克毕赤酵母接种于NYDA培养基中,在28℃培养48h；(2)液体培养：在250ml的三角瓶中装入50ml的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的卡利比克毕赤酵母，在180rpm，28℃条件下培养20h；(3)离心分离再悬浮：上述酵母培养混合物在8000g条件下，离心10min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为2×10⁸cells/ml，再用灭过菌的蒸馏水或竹叶黄酮(BLF)溶液稀释到所需浓度。

实施例2竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对苹果采后青霉病的抑制效果

一)试验方案

供试的果实经过精细挑选,尽量选择果实均匀一致,表面无擦伤！机械伤和病虫伤害。将苹果用无菌打孔器打孔,表面伤口为5mm(直径)×3mm(深)。每个伤口处等量加入30μl以下处理液：(1)1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(含各浓度竹叶黄酮)；(2)1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液；(3)无菌水。3h后,再向水果伤口处分别接种30μL以下致病菌孢子悬浮液：向苹果伤口处接种5×10⁴spores/mL的扩展青霉(Penicillium>

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

二)试验结果

按照上述步骤试验,统计水果的腐烂率结果如下:

如图1中所示，对照组的发病率约为91.7％，单独的酵母处理组发病率为22.2％，因此P.caribbica在20℃下能够有效控制由扩展青霉造成苹果的采后病害。与此同时，与卡利比克毕赤酵母单独处理组相比，竹叶黄酮能显著地提高酵母的生防效果。其中100ug/ml BLF结合卡利比克毕赤酵母处理组有最好的防腐效果，其苹果青霉病病害发病率仅为5.6％，即效果最为显著。

实施例3竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对苹果自然腐烂和贮藏品质的影响

一)试验方案

将以下处理液均匀喷于水果表面,自然晾干:(1)1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液(BLF浓度为100μg/mL)；(2)1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液；(3)BLF(浓度为100μg/mL)和(4)无菌水。然后,将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封。20℃(RH95％)的恒温培养箱中贮藏35天。从第10天开始每隔5天取出水果统计腐烂水果个数,并观察腐烂情况。35天后，测果实贮藏品质。每处理重复3次,整个实验重复2次。竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对水果自然腐烂的抑制效果以发病率表示。

1、发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

2、品质测定方法如下：

(1)总可溶性固形物含量：用手持式糖量计测定，采用手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。

(2)褐变度：从6个果实上称取20g果肉，加40ml蒸馏水迅速研磨，10000×g，4℃条件下离心10mim，取上清液10ml加入95％乙醇15ml，10000×g，4℃条件下离心10mim，取上清液于420nm测定吸光度值，以此表示褐变程度。每处理3次重复。

(3)可滴定酸度：采用滴定法，从5个水果取样，称取10g样品，加蒸馏水迅速研磨，定容至100mL，过滤，取10mL滤液，用0.1mol/L NaOH进行滴定至pH 8.1，滴定后进行计算，结果以含苹果酸的百分数表示。

(4)Vc含量：2，6-二氯酚靛酚法。从5个水果上取5g样品加5mL 2％草酸研磨匀浆，倒入100mL容量瓶，用1％草酸洗涤残渣，加1mL 30％硫酸锌，摇匀。再加1mL 15％亚铁氰化钾(除色素)，用1％草酸定容，摇匀过滤。取过滤液4mL，然后向各管加入2，6-二氯酚靛酚染料溶液，随即加入二甲苯5mL，迅速摇动约0.5min，静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液在500nm波长下测定吸光度。根据测定液的光密度值查标准曲线，求出相应的维生素C(Vc)的含量，结果用毫克Vc/100g水果表示。

二)试验结果

1、按照上述步骤试验,统计的自然腐烂率结果如下：

从图2可以看出,35天后，BLF单独处理组，卡利比克毕赤酵母单独处理组，卡利比克毕赤酵母和BLF结合处理的苹果果实发病率均显著低于对照组(79.4％)。竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合处理组果实腐烂率最低，仅为8.3％，这显著低于单独使用BLF和卡利比克毕赤酵母的自然腐烂率。说明BLF(浓度为100μg/mL)可以显著提高卡利比克毕赤酵母对苹果采后病害的防治效果。

2、按照上述步骤试验，统计的贮藏品质结果如下：

表1竹叶黄酮与卡利比克毕赤酵母结合使用对苹果贮藏品质的影响

注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；0.01％BLF：100μg/mL的竹叶黄酮；Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液；0.01％BLF+Pc：1×10⁸cells/ml的P.carribbica酵母菌悬液。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

从表1可以看出,35天后，与对照组相比，经BLF与卡利比克毕赤酵母结合处理的苹果其Vc含量、可滴定酸和褐变度无显著差异，可溶性固形物显著降低，对各项品质指标均不产生有害影响。