作为用于治疗癌症的RAF抑制剂的1-(5-叔丁基-2-芳基-吡唑-3-基)-3-2-氟-4-(3-氧代-4H-吡啶并2，3-B吡嗪-8-基)氧基苯基脲衍生物

摘要

本发明总体上涉及治疗化合物的领域。更确切地说，本发明涉及某些1(5叔丁基2芳基吡唑3基)3[2氟4[(3氧代4H吡啶并[2,3b]吡嗪8基)氧基]苯基]脲化合物(在此称为“TBAP化合物”)，所述化合物尤其抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)。本发明还涉及包括此类化合物的药物组合物，以及此类化合物和组合物在体外与在体内两者均抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)、以及治疗包括以下各项的病症的用途：增殖性病症；癌症(包括例如恶性黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌)；炎症；免疫病症；病毒性感染；纤维化病症；与RAF(例如BRAF、CRAF等)的突变形式相关的病症；通过抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)而改善的病症；通过抑制突变体BRAF而改善的病症；通过抑制BRAF和CRAF而改善的病症；与RAS突变和/或MAPK途径活化相关的病症；通过抑制SRC、p38、FGFRA、VEGFR2(KDR)、和/或LCK而改善的病症；等等。

说明书

相关申请

本申请涉及：2013年11月25日提交的英国专利申请号1320729.5，其内容通过引用 以其全文结合在此。

技术领域

本发明总体上涉及治疗化合物的领域。更确切地说，本发明涉及某些1-(5-叔丁 基-2-芳基-吡唑-3-基)-3-[2-氟-4-[(3-氧代-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-8-基)氧基]苯基] 脲化合物(在此称为“TBAP化合物”)，所述化合物尤其抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)。本发明 还涉及包括此类化合物的药物组合物，以及此类化合物和组合物在体外与在体内两者均抑 制RAF(例如BRAF、CRAF等)、以及治疗包括以下各项的病症的用途：增殖性病症；癌症(包括 例如恶性黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌)；炎症；免疫病症；病毒性感染；纤维化病症；与RAF (例如BRAF、CRAF等)的突变形式相关的病症；通过抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)而改善的病 症；通过抑制突变体BRAF而改善的病症；通过抑制BRAF和CRAF而改善的病症；与RAS突变和/ 或MAPK途径活化相关的病症；通过抑制SRC、p38、FGFRA、VEGFR-2(KDR)、和/或LCK而改善的 病症；等等。

背景

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RAF、增殖性病症、和癌症

直接或间接控制细胞生长和分化的基因中的突变通常被认为是癌症的主要原因。 恶性肿瘤通过一系列逐步的进行性变化发展而来，这些变化导致癌细胞的生长控制特性的 消失(即连续的不受控的增殖)、侵袭周围组织的能力、转移至不同器官部位的能力、血管生 成的刺激、对细胞凋亡的抗性、逃避免疫系统的能力、异常代谢途径、以及局部炎症。小心控 制的体外研究己经帮助限定了表征正常细胞与赘生性细胞生长的因素，并且己经导致对控 制细胞生长和分化的特异性蛋白质的鉴定。

RAF是RAS鸟嘌呤-核甘酸结合/GTP酶蛋白的关键下游靶标，并且介导由RAF-MEK- ERK组成的MAP激酶级联的活化。被活化的ERK是这样一种激酶：其随后靶向于许多负责介导 (除其他外)所述途径的生长、存活和转录功能的蛋白质。这些蛋白包括转录因子ELK1、C- JUN、Ets家族(包括Ets1、2和7)和FOS家族。RAS-RAF-MEK-ERK信号传导途径响应于很多细胞 刺激物而活化，所述细胞刺激物包括生长因子如EGF、PDGF、KGF等。因为所述途径是生长因 子作用的主要靶标，所以己经发现RAF-MEK-ERK的活性在很多因子依赖性肿瘤中上-调。在 全部肿瘤中约有20％经历了RAS蛋白之一的活化突变，这一观察表明所述途径在肿瘤发生 中有更为广泛的重要性。

RAF致癌基因家族包括三种高度保守的基因，称为ARAF、BRAF和CRAF(也称为Raf- 1)。RAF基因编码蛋白激酶，所述蛋白激酶被认为在调节细胞增殖的信号传导过程中起重要 的调节作用。RAF基因编码高度保守的丝氨酸-苏氨酸-特异性蛋白激酶，其在与RAS直接结 合后被募集到质膜，这是RAF活化中的最初事件。RAF蛋白是信号传导途径的一部分，所述信 号传导途径被认为由以下项组成：受体赂氨酸激酶、p21RAS、RAF、Mek1(ERK活化剂或MAPKK) 激酶和ERK(MAPK)激酶，其最终将若干细胞底物(包括转录因子)磷酸化。通过这种途径进行 的信号传导能够在不同细胞背景中介导分化、增殖或致癌性转化。因此，RAF激酶被认为在 正常细胞信号传导途径中起着基础性的作用，使得大量生长因子与它们的净效应(即细胞 增殖)偶联。由于RAF蛋白是RAS蛋白的直接的下游效应子，所以针对RAF激酶的疗法被认为 可用于治疗RAS-依赖性的肿瘤。

RAF激酶被差异性地调节和表达。CRAF在己经检查过的所有器官和所有细胞系中 都表达。ARAF和BRAF似乎也是无所不在的，但最多是在泌尿生殖组织和脑组织中分别进行 高表达。由于BRAF在神经组织中高表达，因此曾经认为其限于这些组织，但是已经发现其表 达是更为广泛的。尽管所有RAF蛋白均能与活化的RAS结合，但是BRAF最强烈地被致癌性RAS 激活。

BRAF在癌症中是重要的，因为它在以下各项中是突变的：约一半的恶性黑色素瘤 和乳头状甲状腺癌、30％的低级卵巢癌、15％的结直肠癌、和非常高频率于毛发细胞白血病 中，以及以较低频率发生于许多其他癌症中，总计7％的人癌症。参见例如http:// www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/。胰腺癌的特定亚型，即胰腺的KRAS2野生型髓 样癌，在30％的样品中存在BRAF突变(参见，例如卡尔霍恩(Calhoun)等人，2003)。相比之 下，ARAF和CRAF突变在人类癌症中非常稀少。

超过100种不同的突变已经描述于癌症的BRAF中，但是单一突变(在位置600处用 谷氨酸(E)取代缬氨酸(V))占癌症的总BRAF突变的约80％。这种突变激活BRAF-500倍，并且 允许其刺激组成型ERK和NFkB信号传导，从而刺激存活和增殖。因此，^V600EBRAF可以转化细 胞，例如成纤维细胞和黑色素细胞。抑制癌细胞中的^V600EBRAF抑制细胞增殖并在体外、在体 内诱导细胞凋亡，其抑制肿瘤细胞生长，从而证实^V600EBRAF为治疗靶标。

在黑色素瘤中鉴定的其他V600BRAF突变是V600K、V600D和V600R(参见，例如戴维 斯(Davies)等人，2002；万(Wan)等人，2004；朗(Long)等人，2011；鲁宾斯坦(Rubinstein)等 人，2010)。还在除了600的位置中鉴定了具有BRAF突变的次要的黑色素瘤亚组。这些非- V600位置BRAF突变体并不一定直接激活BRAF激酶活性，但需要CRAF的存在以反式激活它们 的MAPK信号传导(参见，例如斯莫利(Smalley)等人，2009)。在此类情况下，RAF活性的抑制 仍然将是癌症治疗中的有益目标。

重要的是，已经显示抑制突变体BRAF的药物例如威罗菲尼(vemurafenib) (PLX4032，RG7204，Zelboraf)(参见例如弗莱厄蒂(Flaherty)等人.，2010)和达拉菲尼 (dabrafenib)(GSK-2118436)(参见例如法尔霍克(Falchook)等人，2012)可以在其肿瘤表 达致癌性BRAF的患者中介导令人印象深刻的反应(综述于萨拉马(Salama)等人，2013)。具 体而言，威罗菲尼已经在突变体BRAF驱使的黑色素瘤中显示有希望的结果(参见例如查普 曼(Chapman)等人，2011；索斯曼(Sosman)等人，2012)。美国食品与药品管理局(FDA)在2011 年批准它用于治疗V600EBRAF突变晚期转移性或不可切除的黑色素瘤，并且欧洲药品管理 局(EMA)在2012年批准它作为单一疗法用于治疗患有任何BRAFV600突变阳性不可切除的 或转移性黑色素瘤的成年患者。FDA和EMA在2013年批准达拉菲尼用于相同的适应症。

这些数据证实突变体BRAF作为黑色素瘤中的治疗靶标以及针对其他其中BRAF被 突变的癌症和增生性疾病的潜在靶标。这种证据及其他证据表明抑制RAF(例如BRAF)活性 会有益于治疗癌症，并且抑制RAF(例如BRAF)活性可能特别有益于含有组成型活化的BRAF 突变的那些癌症。

对BRAF抑制剂的抗性

尽管能够介导显著临床反应，用威罗菲尼和达拉菲尼治疗的大多数患者最终对治 疗有进展(参见例如弗莱厄蒂(Flaherty)等人，2010；索斯曼(Sosman)等人，2012)，这归因 于抗性的获得，其可以通过若干机制介导(参见例如苏利文(Sullivan)等人，2011)。此外， 约30％的患者呈现原发抗药性并且没有反应，尽管存在BRAF突变(参见例如查普曼 (Chapman)等人，2011)。

在KRAS中的突变(G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、G13D)已经被建议作为用于 鉴定对突变体BRAF抑制剂治疗不敏感的肿瘤的预测性标志物(参见例如哈提瓦西里欧 (Hatzivassiliou)等人，2011)。NRAS的Q16K突变赋予对BRAF抑制剂威罗菲尼的抗性(参见 例如纳扎里安(Nazarian)等人，2010)。类似地，对用BRAF抑制剂达拉菲尼治疗的抗性是通 过NRAS蛋白的Q16K和A146T突变来预测(参见例如格雷格(Greger)等人，2012)。RAS通过突 变的活化导致RAF二聚作用(CRAF与BRAF蛋白的异源二聚体和/或CRAF/BRAF同源二聚体的 形成)随着通过MAPK级联增加的信号传导和增加的细胞增殖而增加(参见例如布利卡科斯 (Poulikakos)等人2010)。

CRAF(和CRAF中的突变)的上调是在用BRAF抑制剂治疗的抗性黑色素瘤中所见的 另一抗性机制(参见例如海多恩(Heidorn)等人，2010；梦特娇(Montagut)等人，2008；安东 尼(Antony)等人2013)。因此，多个RAF亚型(尤其是BRAF和CRAF)的全RAF(panRAF)抑制剂很 可能在RAS-突变型黑色素瘤和其他RAS突变型癌症中具有增强的效应，并且解决对选择性 BRAF抑制剂的ー个关键抗性机制。

BRAFV600E基因的拷贝数增加与BRAF-突变型黑色素瘤(参见例如史(Shi)等人， 2012)和结直肠癌(参见例如科科伦(Corcoran)等人，2010)中的BRAF抑制剂抗性相关联。这 两者模型对BRAF和MEK伴随的抑制是敏感的，但仅扩增的BRAF-突变型黑色素瘤单独对MEK 抑制剂是敏感的。这种抗性机制很可能对全RAF抑制比对仅BRAF抑制是更敏感的。

在一些黑色素瘤中，经由BRAFV600E的剪接变体亚型的表达获得了对威罗菲尼的 抗性。BRAFV600E的61kDa剪接变体(p61BRAFV600E)缺乏编码RAS结合结构域的外显子4-8， 并且是对威罗菲尼有抗性的。在不存在活化的RAS下，p61BRAFV600E是组成型二聚的。显示 p61BRAFV600E的二聚化对于介导BRAF抑制剂抗性是关键的(参见例如布利卡科斯 (Poulikakos)等人，2011)。

BRAF和CRAF基因融合是MAPK途径活化的替代性机制。已经在以下各项中鉴定了这 些活化基因融合产物：前列腺癌症、胃癌和黑色素瘤(SLC45A3-BRAF和ESRP1-RAF1)(参见例 如拉马沙米(Palanisamy)等人，2010)、甲状腺癌(AKAP9-BRAF)(参见例如希安比(Ciampi) 等人，2005)和儿科星形细胞瘤(KIAA1549-BRAF)(参见例如西韦特(Sievert)等人，2013)。 表达RAF融合物(例如SLC45A3-BRAF)的模型中的一些是对BRAF和MEK抑制敏感的；相反， KIAA1549-BRAF模型对PLX4720有抗性，但是对第二代BRAF抑制剂敏感。

Ras的激酶抑制(KSR)是RAS-RAF-MEK-ERK途径的保守性正调控因子。KSR1与MEK组 成型地相互作用并且已知KSR1在MEK与RAF共定位在质膜中起着重要作用。KSR1通过在RAS- 突变或活化的RAS细胞中的BRAF抑制剂来参与MAPK途径活化(参见例如麦克凯(McKay)等 人，2011)。已经提出了所述途径的药物活化的两个机制。一个机制涉及CRAF-KSR1二聚体的 形成，通过所述KSR1-CRAF二聚体具有MEK和MEK磷酸化的复合物形成(参见例如胡(Hu)等 人，2011)。在另一个机制中，KSR1与BRAF二聚化，并且与BRAF-CRAF异源二聚体竞争，所述 BRAF-CRAF异源二聚体是MEK磷酸化的驱动物。表明具有KSR1较低表达的RAS活化细胞将会 显示更反常的途径活化(参见例如麦克凯(McKay)等人，2011)。在两个机制中，全RAF抑制剂 很可能降低途径活化，而与KSR1表达水平无关。

受体酪氨酸激酶(RTK)的过表达是对BRAF抑制剂有抗性的另一个机制。在BRAF-突 变型结直肠癌中，EGFR(表皮生长因子受体)的过表达导致EGFR-介导的MAPK途径再活化以 及对威罗菲尼的抗性(参见例如科科伦(Corcoran)等人，2012)。在对药物有抗性的BRAF-突 变型黑色素瘤细胞系中，EGFR-SFK-STAT3信号传导可以在黑色素瘤中在体外和在体内介导 对BRAF抑制剂的抗性(参见例如吉洛提(Girotti)等人，2013)。Src家族激酶SFK在黑色素瘤 细胞中介导对BRAF抑制剂的抗性中起着关键作用(参见例如吉洛提(Girotti)等人，2013； 韦尔加尼(Vergani)等人，2011)。在威罗菲尼抗性品系中观察到SFKsLYN、YES和FYN的升高 的磷酸化。抗性细胞的生长是对SFK抑制敏感的：达沙替尼(Dasatinib)以及SRC和LYN二者 的耗尽均抑制抗性细胞在体外的侵入。至关重要的是，SFK信号传导在来自对威罗菲尼具有 抗性的患者的肿瘤中得以增加，并且达沙替尼抑制小鼠中的这种肿瘤的生长和转移。

科科伦(Corcoran)等人，2012，“EGFR-介导的MAPK信号传导的再活化促成BRAF-突 变型结直肠癌对用威罗菲尼的RAF抑制不敏感”，癌症发现(CancerDiscovery)，第2卷，第 227-235页。

发现PDGFR-β在对威罗菲尼有抗性的突变体BRAF细胞系中过表达和过度磷酸化， 并且在来自患者的威罗菲尼-抗性肿瘤的若干案例中上调，表明这种机制可能是临床相关 的(参见例如纳扎里安(Nazarian)等人，2010)。PDGFR-β的上调可以通过激活其他ERK1/2- 依赖性下游途径(PI3K、PLCγ)来驱使抗性。

机械学研究显示IGFR1信号传导在细胞中介导增加的PI3K/AKT信号传导，使得所 述细胞获得BRAF抑制剂抗性，并且所述抗性可以通过用PI3K和MEK抑制剂或者IGF1R和MEK 抑制剂的组合处理细胞而逆转(参见例如维拉努埃瓦(Villanueva)等人，2011)。这一发现 的等同关联(translationalrelevance)由以下观察证实：来自对威罗菲尼失效的患者的5 个黑色素瘤标本中的1个表达增加的IGFR1水平(参见例如维拉努埃瓦(Villanueva)等人， 2011)。

通过间质上调生长因子是抗性的机制。在患有BRAF-突变型黑色素瘤的患者中的 HGF的间质细胞表达与对RAF抑制剂治疗的先天抗性之间已经显示显著相关性(参见例如威 尔逊(Wilson)等人，2012)。要求保护cMET和/或它们的配体作为用于鉴定对BRAF抑制剂不 易感的肿瘤的预测标志物(参见例如哈提瓦西里欧(Hatzivassiliou)等人，2011；施特劳斯 曼(Straussman)，2012)。RAF以及HGF或MET的双重抑制导致药物抗性的逆转，表明RAF加上 HGF或MET抑制的联合疗法为一种潜在的治疗策略(参见例如哈提瓦西里欧 (Hatzivassiliou)等人，2011；施特劳斯曼(Straussman)，2012)。

FGFR1参与黑色素瘤进展，并且FGFR1的敲除导致黑色素瘤在体内生长的抑制(参 见例如王(Wang)等人，1997)。成纤维细胞生长因子(FGF)从用PLX4032进行治疗中解救了一 些BRAF突变细胞(参见例如威尔逊(Wilson)等人，2012)，并且FGFR1抑制与多重激酶/BRAF 抑制剂索拉非尼(sorafenib)和特异性BRAF抑制剂RG7204是协同增效的(参见例如梅茨纳 (Metzner)等人，2012)。这些发现表明RTK(如EGFR、PDGFR-β、HGFR、IGF1R和FGFR)以及SFK的 抑制应当把选择性BRAF抑制剂的许多抗性机制作为目标，并且因此在BRAF突变型肿瘤中具 有实用性，使得这些肿瘤对BRAF-选择性抑制剂变得有抗性。

癌症和RAS

RAS蛋白是小-鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，其是生长因子、细胞因子和激素受体的下 游。这些细胞表面受体激活称作鸟嘌呤-核苷酸交换因子(GNEF)的蛋白，所述鸟嘌呤-核苷 酸交换因子用GDP代替RAS蛋白上的GTP，从而刺激RAS活化。称作GTP酶-激活蛋白(GAP)的其 他蛋白刺激RAS的固有GTP酶活性，从而促进GTP水解并将RAS返回至其失活的GDP-结合状 态。活化的RAS结合至若干效应蛋白，包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶的RAF家族、以 及Ral鸟嘌呤-核苷酸交换因子。这些效应物进而调控控制细胞增殖、衰老、存活和分化的信 号传导途径的活性。在哺乳动物中存在三种RAS基因，称作HRAS、KRAS和NRAS，并且它们提供 重叠但不保守的功能。

RAS蛋白在癌症中也是重要的。20％-30％的人肿瘤在RAS基因之一中藏匿体细胞 功能获得性(gain-of-function)突变。最通常地，它们涉及用于甘氨酸12(G12)、甘氨酸13 (G13)和谷氨酰胺61(Q61)的密码子，并且这些突变通过不同的机制损害RAS的GAP-刺激的 固有GTP酶活性，从而将其陷入在活性GTP-结合状态中，并使得其促进肿瘤发生。参见例如 唐沃德(Downward)等人，2003；杨格(Young)等人，2009；博斯(Bos)等人，1989。

(*)引证的最经常突变的RAS(KRAS或NRAS或HRAS)。

其他癌症具有RAS家族基因的较小频率的突变，但是它们的突变是预后的预测性， 例如神经母细胞瘤(8％NRAS突变)、胃腺癌(6％KRAS突变)。

RAS和RAF

活性RAS蛋白激活一些下游效应物，包括RAF家族的蛋白质。存在三种RAF蛋白，即 ARAF、BRAF和CRAF。活化的RAF磷酸化并激活称为MEK的第二蛋白激酶，其然后磷酸化并激活 称为ERK的第三蛋白激酶。ERK磷酸化众多的胞质和核底物，由此调节细胞过程，例如增殖、 存活、分化和衰老。

然而，值得注意的是，在癌细胞中，致癌性RAS不通过BRAF发信号，而是排他性地通 过CRAF发信号以激活MEK。

在绝大多数的癌症中，BRAF和RAS突变是相互排斥的。这提供了遗传证据，以表明 这些蛋白质是在相同的途径上并且它们在癌细胞中驱动相同的程序。然而，在癌细胞中致 癌性BRAF与致癌RAS功能之间存在着明显的差异。首先，RAS激活若干途径，然而BRAF是唯一 已知的用以激活MEK/ERK途径。因此，BRAF突变型细胞更依赖于MEK/ERK信号传导并因此对 BRAF或MEK抑制剂显著更敏感于其中RAS被突变的细胞。参见例如加内特(Garnett)等人， 2004；韦尔布罗克(Wellbrock)等人，2004；格雷-朔普费尔(Gray-Schopfer)等人，2007；萧 提(Solit)等人，2006。

除突变之外，MAPK级联中的信号传导蛋白质在许多恶性肿瘤中被过表达。例如， HRAS和NRAS在宫颈癌中被过表达。RAS突变在肾上腺皮质癌中是罕见的，但是具有RAS、BRAF 和EGFR的突变的肿瘤的收集群体通过所述途径展示增加的信号传导并且可以是MAPK途径 抑制剂的靶标(参见例如古刀拉(Kotoula)等人，2009)。低级卵巢癌症和腹膜癌响应于用 MEK抑制剂司美替尼阻断MAPK途径，与RAS/RAF突变状态无关。在葡萄膜黑色素瘤中，MAPK途 径通过GNAQ的突变而激活，其占50％的葡萄膜黑色素瘤(参见例如高迪(Gaudi)等人， 2011)。cRAF在多种原代人癌症，例如肺癌、肝癌、前列腺癌、原发性神经外胚层瘤、头颈部鳞 状细胞癌中过表达(参见例如达莫达尔雷迪(DamodarReddy)等人，2001；黄(Hwang)等人， 2004；穆克特吉(Mukterjee)等人，2005；施雷克(Schreck)等人，2006；莉娃(Riva)等人， 1995)。MAPK途径在74％的急性髓性白血病患者样品中被激活(参见例如米莱拉(Milella) 等人，2001)。在神经纤维瘤1型中，NF1肿瘤抑制基因的丧失导致过度激活的RAS信号传导和 失调的Ras/ERK信号传导，后者对于NF1外周神经肿瘤的生长是关键的(参见例如杰森 (Jessen)等人，2013)。一种全RAF抑制剂引起针对BRAF突变型肿瘤及针对RAS突变型肿瘤的 MAPK途径的有效阻断并且对于具有MAPK信号传导途径失调的癌症具有广泛应用。

因此，具有RAS、RAF和EGFR的活化突变的癌症；或者RAS、RAF和EGFR(包括其任何亚 型)的过表达的癌症可以对全RAF(例如CRAF和BRAF)抑制是特别敏感的。具有导致上调的 RAF-MEK-ERK途径信号的其他异常的癌症还可以对用全RAF(例如CRAF和BRAF)活性的抑制 剂进行治疗是特别敏感的。此类异常实例包括生长因子受体的组成型活化；一种或多种生 长因子受体的过表达；一种或多种生长因子的过表达；KSR-介导的途径活化；以及BRAF或 CRAF基因融合。

在其他疾病中的MAPK途径

RAF-MEK-ERK途径在很多受体和刺激物的下游发挥功能，表明在细胞功能的调节 中具有广泛作用。出于这种原因，RAF的抑制剂可以发现在与经由此途径上调的信号传导有 关的其他疾病病症中有效用。RAF-MEK-ERK途径还是非转化的细胞对生长因子作用的正常 响应的重要组分。因此，RAF的抑制剂可用于其中存在不适当的或过度的正常组织增殖的疾 病中。这些疾病包括，例如，肾小球肾炎和银屑病。

炎症细胞的功能是由很多因素控制的，这些因素的作用通过不同的信号传导途径 介导。虽然一些关键促炎功能由p38Map激酶介导(例如TNF释放)，但是其他功能是由其他途 径介导的。具体而言，RAF-MEK-ERK途径是许多炎症细胞中的重要的活化和增殖信号。具体 而言，B和T淋巴细胞需要RAF-MEK-ERK途径的活化以用于效应群体的克隆扩增和生成(参见 例如坎特雷尔(Cantrell)，2003；格奥特(Genot)等人，2000)。以T-细胞增殖(T-细胞活化和 生长)为特征的炎症病症如组织移植排斥、内毒素性休克和肾小球肾炎已经参与包括RAF的 细胞信号传导途径。

已经在疾病模型的很多模型中证明了MAPK/ERK信号传导的活化，并且使用例如 MEK抑制剂对所述途径的抑制已经显示在例如以下这些不同的疾病中是潜在有益的：

●疼痛：在疼痛模型中的功效证明：MEK途径在持续疼痛的背角神经元中被上调 (参见例如纪(Ji)等人，2002；宋(Song)等人，2005；马(Ma)等人，2005；卡里姆(Karim)等人， 2006)；神经性疼痛中的Mek抑制剂(参见例如狄克逊(Dixon)等人，2001)。

●中风：在中风模型中的功效证明：通过抑制MEK对局部缺血性脑损伤具有显著的 神经保护作用(参见例如王(Wang)等人.，2003；王(Wang)等人.，2004；麦德达西(Maddahi) 等人，2010)。

●糖尿病：在糖尿病并发症中的证明(参见例如藤田(Fujita)等人，2004)。

●炎症：在炎症模型中的功效证明(参见例如捷夫(Jaffee)等人，2000；塔尔哈默 (Thalhamer)等人，2008；吉勃特(Geppert)等人，1994)。

●关节炎：在实验性骨关节炎中的功效证明(参见例如佩尔蒂埃(Pelletier)等 人，2003)；类风湿性关节炎的模型(参见例如春(Chun)等人，2002；达德利(Dudley)等人， 2000)；综述于塔尔哈默(Thalhamer)等人，2008中。

●心脏重塑，例如，在代谢综合征中(参见例如阿斯里(Asrih)等人，2013)。

●器官损伤，例如，在顺铂诱导的肾损伤中(参见例如乔(Jo)等人，2005)。

●血红蛋白病：镰状细胞病，β-地中海贫血，血红蛋白H疾病(参见例如泽娜迪 (Zennadi)等人，2012)。

●哮喘(参见例如布里奇斯(Bridges)等人，2000)。

●移植排斥(参见例如吉尔伯特森(Gilbertsen)等人，2000)。

●败血症性休克(参见例如吉勃特(Geppert)等人，1994)。

●病毒感染，例如乙型肝炎(参见例如本(Benn)等人，1994)，丙型肝炎(参见例如 张(Zhang)等人，2012)，人体免疫缺损病毒(HIV)(参见例如杨(Yang)等人，1999)，艾伯斯 坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)(参见例如福田(Fukuda)等人，2007)，HPV(参见例如佩 恩(Payne)等人，2001)，与卡波西肉瘤相关的人疱疹病毒-8(HHV)(参见例如安可达(Akula) 等人，2004)，人巨细胞病毒(参见例如约翰逊(Johnson)等人，2001)，柯萨奇病毒B3(参见例 如罗(Luo)等人，2002)，博尔纳病毒(参见例如普朗兹(Planz)等人，2001)，流感病毒(参见 例如佩雷西卡(Pleschka)等人，2001)。

●慢性感染和自身免疫性疾病，例如，通过抑制调节T-细胞活性(参见例如克伊缇 尔(Kjetil)等人，2013)。

●动脉粥样硬化(参见例如缪拉(Miura)等人，2004)。

●再狭窄(参见例如格拉夫(Graf)等人，1997)。

●心肌症(参见例如洛伦兹(Lorenz)等人，2009)。

●心肌缺血再灌注损伤(参见例如邹基(Zouki)等人，2000)。

●银屑病(参见例如哈泽(Haase)等人，2001)。

●阿尔茨海默病(参见例如梅伊(Mei)等人，2006)和其他诱导性神经病症，例如 HTLV-I-相关的脊髓病/热带痉挛性寄生虫或神经退行性疾病(例如帕金森病)或经由CD44 剪接-变体调节的淀粉样侧索硬化(参见例如平纳(Pinner)等人，2009)。

●慢性阻塞性肺病(参见例如默瑟(Mercer)等人，2006)。

●炎症肠病(参见例如洛温柏格(Lowenberg)等人，2005)。

●纤维生成疾病，例如囊性纤维化(参见例如李(Li)等人，1998)，肝纤维化，例如 肝硬化(参见例如戴维斯(Davies)等人，1996)。

●遗传性RAS突变导致一组统称为rasopathy的疾病。已经提出将靶向这些疾病中 的MAPK途径作为这些类型疾病例如努南综合征(参见例如顾(Gu)等人，2013)、心脏-面-皮 肤综合征(参见例如阿拉斯田崎(Anastasaki)等人，2012)和毛细管畸形(参见例如维克库 拉(Vikkula)等人，2004)的治疗方法。

RTK

受体酪氨酸激酶(RTK)在生物化学信号跨越细胞质膜的传递中是重要的。这些跨 膜分子在特征上由通过质膜中的节段与胞内酪氨酸激酶结构域连接的胞外配体-结合结构 域组成。配体与受体的结合导致与受体有关的酪氨酸激酶活性的刺激，所述刺激导致受体 及其他胞内蛋白质二者上的酪氨酸残基的磷酸化，从而引起多种细胞响应。迄今，已经鉴定 了至少十九种不同的RTK亚族，通过氨基酸序列同源性来定义。

FGFR

信号传导性多肽的成纤维细胞生长因子(FGF)家族调节不同系列的生理功能，包 括有丝分裂、创伤愈合、细胞分化与血管生成以及发育。正常和恶性细胞的生长以及增殖都 受到这些细胞外信号传导分子的局部浓度变化的影响，所述分子作为自分泌以及旁分泌因 子起作用。自分泌FGF信号传导在类固醇激素-依赖性癌症的进展中和对于非激素依赖状态 是特别重要的(参见例如鲍尔斯(Powers)等人，2000)。

FGF和它们的受体在若干组织和细胞系中的表达水平增加，并且认为过度表达促 成恶性表型。此外，一些致癌基因是编码生长因子受体的基因的同系物，并且在人胰腺癌中 存在FGF-依赖性信号传导异常活化的可能性(参见，例如小泽征尔(Ozawa)等人，2001)。

两种原型(prototypic)成员是酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF1)和碱性成 纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)，并且迄今为止，已经鉴定了至少二十种不同的FGF家族成 员。细胞对FGF的响应经由编号为1至4的四种类型的高亲和性跨膜酪氨酸-激酶成纤维细胞 生长因子受体(FGFR-1至FGFR-4)而传递。一旦配体结合，受体就二聚化并使特异性胞质酪 氨酸残基自磷酸化或转磷酸化，以传递细胞内信号，所述信号最终到达核转录因子效应器。

FGFR-1(FGFRA)途径的破坏应当影响肿瘤细胞增殖，因为这种激酶除了在增殖的 内皮细胞中以外还在很多肿瘤类型中被活化。FGFR-1在与肿瘤有关的脉管组织中过表达和 活化已经表明了这些分子在肿瘤血管生成中的作用。

FGFR-2对酸性和/或碱性成纤维细胞生长因子以及角化细胞生长因子配体具有高 亲和性。FGFR-2还在成骨细胞生长和分化期间传播FGF的有力成骨效应。FGFR-2中引起复杂 的功能改变的突变被证明诱导颅缝的异常骨化(颅缝骨接合)，这意味着FGFR信号传导在膜 内骨形成中起主要作用。例如，在以过早的颅缝骨化为特征的阿佩尔(Apert)(AP)综合征 中，大多数情况都与FGFR-2中引起功能获得性的点突变有关(参见例如雷蒙尼(Lemonnier) 等人，2001)。

雷蒙尼等人，2001，“在阿佩尔颅缝骨接合中，N-钙粘蛋白和蛋白激酶C在通过 S252W成纤维细胞生长因子受体2突变诱导的成骨细胞基因激活中的作用(RoleofN- cadherinandproteinkinaseCinosteoblastgeneactivationinducedbythe S252Wfibroblastgrowthfactorreceptor2mutationinApert craniosynostosis)”，骨骼和矿物质研究杂志(J.BoneMiner.Res.)，第16卷，第832-845 页。

人骨骼发育中的若干严重异常，包括阿佩尔、克鲁宗(Crouzon)、杰克逊-威斯 (Jackson-Weiss)、比尔-史蒂文森皮肤旋纹(Beare-Stevensoncutisgyrata)和斐弗 (Pfeiffer)的综合征，都与FGFR-2中突变的发生有关。大多数(如果不是全部的话)斐弗综 合征(PS)病例也是由FGFR-2基因的新生(denovo)突变所导致的(参见例如迈耶斯 (Meyers)等人，1996；普洛波(Plomp)等人，1998)，并且最近显示，FGFR-2中的突变打破了支 配配体特异性的主要规则之一。即，成纤维细胞生长因子受体的两种突变体剪接形式 FGFR2c和FGFR2b已经获得了与非典型FGF配体结合和被其活化的能力。这种配体特异性的 丧失导致异常的信号传导，并且表明这些疾病综合征的严格表型起因于FGFR-2的异位配体 依赖性活化(参见例如余(Yu)等人，2000)。

FGFR-3受体酪氨酸激酶的活化突变(例如染色体易位或点突变)产生失控的、组成 型活性的FGFR-3受体，这些受体已经参与多发性骨髓瘤和膀胱癌与宫颈癌(参见例如鲍尔 斯(Powers)等人，2000)。因此，FGFR-3抑制将可用于治疗多发性骨髓瘤、膀胱癌与宫颈癌。

血管生成

慢性增殖疾病经常伴有深刻的血管生成，所述血管生成可以促进或维持炎症和/ 或增殖性状态，或者其通过血管的侵袭性增殖引起组织破坏。参见例如福尔克曼 (Folkman)，1995；福尔克曼，1997；福尔克曼等人，1992。

血管生成通常用于描述新的或替代性的血管形成，或者新生血管形成。它是一种 必要的和正常的生理过程，通过其在胚胎中建立脉管系统。在大多数正常的成年组织中，除 了排卵、月经和伤口愈合的部位外，通常不发生血管生成。然而，很多疾病的特征在于持续 和失控的血管生成。例如，在关节炎中，新的毛细血管侵袭关节并破坏软骨(参见例如科尔 维尔-纳什(Colville-Nash)和斯科特(Scott)，1992)。在糖尿病(以及很多不同的眼科疾 病)中，新的血管侵袭黄斑或视网膜或者其他眼部结构，并且可以导致失明(参见例如阿龙 (Alon)等人，1995)。己经将动脉粥样硬化的过程与血管生成相联系(参见例如卡隆 (Kahlon)等人，1992)。已经发现肿瘤生长和转移是血管生成-依赖性的(参见例如福尔克曼 (Folkman)，1992；登尼顿(Denekamp)，1993；菲德勒(Fidler)和埃利斯(Ellis)，1994)。

对主要疾病中牵涉血管生成的认识己经伴随着鉴定和开发血管生成抑制剂的研 究。这些抑制剂通常按照对血管生成级联中的离散靶标的响应进行分类，例如内皮细胞通 过血管生成信号的活化；降解酶类的合成和释放；内皮细胞迁移；内皮细胞的增殖；以及毛 细血管的形成。因此，血管生成在很多阶段发生，并且己经努力去发现和开发阻断这些不同 阶段的血管生成的化合物。

很多出版物传授了通过不同机理发挥作用的血管生成抑制剂在以下疾病中是有 益的，例如癌症和转移的(参见例如奥赖利(O’Reilly)等人，1994；英格博(Ingber)等人， 1990)、眼科疾病(参见例如弗里德兰德(Friedlander)等人，1995)、关节炎(参见例如皮科 克(Peacock)等人，1992；皮科克等人，1995)、以及血管瘤(参见例如塔拉博莱蒂 (Taraboletti)等人，1995)。

VEGFR

血管内皮生长因子受体(VEGF)(一种多肽)在体外对于内皮细胞是促有丝分裂的 并且在体内刺激血管生成反应。也己经将VEGF与不适当的血管生成相联系(参见例如皮内 多(Pinedo)等人，2000)。一种或多种VEGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK催化参与调节细胞 生长和分化的蛋白质中的特异性酪氨酰残基的磷酸化(参见例如威尔克斯(Wilks)等人， 1990；考特尼奇(Courtneidge)等人，1993；库珀(Cooper)等人，1994；保尔森(Paulson)等 人，1995；钱(Chan)等人，1996)。

己鉴别出VEGF的三种RTK受体：VEGFR-1(Flt-1)；VEGFR-2(Flk-1或KDR)和VEGFR-3 (Flt-4)。这些受体与血管生成有关且参与信号传导(参见穆斯托宁(Mustonen)例如等人， 1995)。

特别感兴趣的是VEGFR-2(KDR)，其是主要表达于内皮细胞中的跨膜受体RTK。 VEGFR-2通过VEGF的活化是使肿瘤血管生成起始的信号传导途径中的关键步骤。VEGF表达 对于肿瘤细胞可以是组成型的并且也可以响应于某些刺激因素而上调。一种此类刺激因素 是缺氧，其中VEGF表达在肿瘤和相关宿主组织两者中均被上调。VEGF配体通过与VEGFR2的 细胞外VEGF结合位点结合而活化VEGFR-2。这导致VEGFR的受体二聚化和VEGFR-2的细胞内 激酶结构域处的酪氨酸残基自-磷酸化。激酶结构域运作以将磷酸酯自ATP转移至酪氨酸残 基，因此对VEGFR-2下游的信号传导蛋白提供结合位点，最终导致血管生成的起始(参见例 如麦克马洪(McMahon)等人，2000)。

在VEGFR-2的激酶结构域结合位点的抑制会阻断酪氨酸残基的磷酸化作用并起破 坏血管生成的起始的作用。

VEGFR-2(和VEGFR-3)主要定位于支持大部分实体瘤的肿瘤脉管系统(血液和/或 淋巴)，并且被显著上调。VEGF信号传导抑制剂的作用的主要临床机构可能是通过靶向肿瘤 血管而不是肿瘤细胞(参见例如史密斯(Smith)等人，2010)，尽管其他机制已经被描述。已 经显示作为单一试剂或与化学疗法组合给予的血管内皮生长因子(VEGF)靶向剂有益于患 有晚期恶性肿瘤的患者(参见例如埃利斯(Ellis)等人，2008)。

KDR在其他疾病中起关键作用，并且KDR的抑制剂可以发现在这些病症中有效用。

动脉粥样硬化：KDR强烈表达于血管生成过程中的内皮细胞上和人粥样硬化血管 的腔内皮两者上，但不是在正常动脉或静脉中(参见例如贝戈雷(Belgore)等人，2004)。 VEGF与VEGF受体2(KDR，人；Flk-1，小鼠)之间的相互作用对于病理性血管生成是关键的并 且已经牵涉于动脉粥样硬化损伤的发展(参见例如井上(Inoue)等人，1998)。针对KDR的疫 苗接种导致T-细胞活化、新生-血管生成的抑制、以及独立于雄性和雌性小鼠两者的高胆固 醇血症的动脉粥样硬化的显著减少(参见例如彼得万(Petrovan)等人，2007)。

肥胖症：在饮食诱导的肥胖症过程中脂肪组织中的新血管的形成主要归因于血管 生成而不是从头血管发生。通过阻断VEGFR2而不是VEGFR1的抗-血管生成治疗可以限制脂 肪组织扩大(参见例如塔姆(Tam)等人，2009)。

视网膜病和黄斑病变：VEGF-VEGFR系统的异常激活密切参与年龄相关性黄斑变性 (AMD)的进展。因此，对抗VEGF-A₁₆₅的适体、VEGF-中和抗体(Fab型)和VEGF-Trap现在被批准 用于AMD治疗(参见例如玛莎布米(Masabumi)等人，2013)。贝瓦珠单抗(Bevazucimab)，一种 抗-VEGF抗体，在标示外(off-label)用于病状例如AMD、糖尿病性视网膜病和糖尿病性黄斑 水肿(DME)(参见例如罗特索(Rotsos)等人，2008)。

神经性疼痛综合征：VEGF和VEGFR2参与经性疼痛的发病机理。CCI大鼠中的抗- rVEGF治疗可以通过降低VEGFR2和P2X2/3受体在DRG神经元上的表达来抑制透射神经性疼 痛信号传导的传递而减轻慢性神经性疼痛(参见例如林(Lin)等人，2010)。

类风湿性关节炎：PTK787/ZK222584，一种具有针对VEGFR的特异性活性的受体酪 氨酸激酶抑制剂，并且展现出对VEGF-R2(KDR)的强抑制以及对VEGFR1(Flt-1)、Flk-1(KDR 的小鼠同系物)和Flt-4(发现于淋巴系统中的受体)的轻微更弱抑制，在具有胶原诱导的关 节炎的小鼠中抑制膝肿胀达40％、严重性得分(达51％)和全球组织学得分(参见例如格赛 欧思(Grosios)等人，2004)。

TIE

血管生成素1(Ang1)，内皮特异性受体酪氨酸激酶TIE-2的配体，是一种血管原因 子(参见例如戴维斯(Davis)等人，1996；帕尔塔内恩(Partanen)等人，1992；戴维斯等人， 1994；戴维斯等人，1996；阿里塔洛(Alitalo)等人，1996；戈多希(Godowski)等人，1997)。首 字母缩略词TIE代表“含有Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶”。TIE用于鉴定一类受体酪氨 酸激酶，这些激酶仅仅在血管内皮细胞和早期造血细胞中表达。通常，TIE受体激酶的特征 在于存在EGF-样结构域和免疫球蛋白(IG)样结构域，其由细胞外折叠单位组成，通过链内 二硫键稳定(参见例如帕尔塔内恩(Partanen)等人，1999)。与在血管发育早期阶段期间发 挥功能的VEGF不同，Ang1及其受体TIE-2在血管发育的晚期阶段、即血管重塑(重塑是指血 管内腔的形成)和成熟期间发挥功能(参见例如扬科普洛斯(Yancopoulos)等人，1998；彼得 斯(Peters)等人，1998；苏蕊(Suri)等人，1996)。

因此，预期TIE-2的抑制将用于破坏由血管生成引发的新脉管系统的重塑和成熟， 从而中断血管生成过程。

p38

p38是38kDa的MAPK家族成员，其响应于胁迫而活化并且在免疫应答和细胞存活及 分化中起着重要的作用。已经描述了四种p38MAPK激酶；这些蛋白质共有高度的同源性(p38 α、β、γ、和δ)。p38MAPK可以通过不同的刺激物如生长因子、炎症细胞因子、或多种环境胁迫 而激活。p38MAPK进而可以激活多个下游靶标，包括蛋白激酶、胞质底物、转录因子和染色质 重塑因子。p38MAPK通过细胞因子和细胞应激的强激活大体上促进细胞生长的抑制并诱导 细胞凋亡(参见例如综述于夸德拉多(Cuadrado)等人，2010中)。最近，已经发现p38α在维持 体内平衡和相关病理中起着重要的作用。p38α在疾病中众所周知的和最广泛报道的作用是 与其在细胞因子信号传导和促进病理炎症中的功能有关。几项研究已经显示p38α如何可以 介导一系列疾病模型，包括类风湿性关节炎、银屑病、阿尔茨海默病、炎症肠病、克罗恩氏 病、肿瘤发生、心血管疾病和中风。此外，存在着p38MAPK在发展和维持多种肺疾病例如哮 喘、囊性纤维化、特发性肺纤维化、和慢性阻塞性肺疾病中的作用的证据。因此，p38α是令人 感兴趣的药物靶标，尤其是因为其在炎症疾病中的重要作用(参见例如综述于厄兹蒂尔克- 温德尔(Oeztuerk-Winder)等人，2012中)。吡啶基-咪唑药物例如SB203580是第一个被鉴定 的p38MAPK抑制剂，其竞争性地结合在ATP-结合口袋上，并且已经广泛地用来研究p38MAPK 功能(参见例如库尔撒德(Coulthard)等人，2009)。

SRC

c-SRC属于非-受体SRC家族激酶(SFK)。这些蛋白质参与很多细胞事件，例如增殖、 存活和细胞运动性。因此，SRC信号传导的超活化有助于肿瘤发展的不同方面。c-SRC的最突 出功能是其在细胞膜经由其SH2和SH3结构域与跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)的广泛相互作 用。c-SRC与很多RTK相互作用，所述RTK包括表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受 体2(HER2)、血小板-衍生的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素-样生长因子-1受体(IGF-1R)和 c-Met/肝细胞生长因子受体(HGFR)。通过这些相互作用，c-SRC整合和调节RTK信号传导并 直接转导存活信号至下游效应物，例如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Akt、和信号传导子及转录 激活子3(STAT3)(参见例如张(Zhang)等人，2012)。其他膜受体例如整联蛋白也可以激活c- SRC，因此触发信号级联，所述信号级联调节细胞迁移粘附和侵入。通过与p120连环蛋白相 互作用的c-Src活化促进细胞-细胞粘着连接的解离，从而增强细胞运动性。c-SRC直接使稳 定粘着斑复合物的粘着斑激酶(FAK)磷酸化，所述粘着斑复合物由FAK、桩蛋白、RhoA和其他 组分组成，并且增强细胞粘附于细胞外基质。此外，c-SRC在调节肿瘤微环境中起着重要的 作用。c-SRC于缺氧中的活化通过血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)和白细 胞介素-8(IL-8)的表达的刺激而促进血管生成(参见例如耶特曼(Yeatman)等人，2004)。

对于很多类型的癌症来说，靶向SFK是良好建立的治疗方法。达沙替尼 (Dasatinib)是可口服的小分子多激酶抑制剂，其有力地抑制SRC-家族激酶(SRC、LCK、YES、 FYN)，而且还有BCR-ABL、c-KIT、PDGFR-α和β、以及肝配蛋白受体激酶(参见例如林道尔 (Lindauer)等人，2010)。最近的研究已经报道了Src也参与炎症相关信号传导途径。很多研 究已经显示c-SRC在巨噬细胞-介导的炎症反应中起着关键作用。重要的是，多种炎症疾病 是与巨噬细胞活化密切相关的；因此，对于巨噬细胞-介导的疾病来说，c-SRC抑制可以表示 有用的治疗策略(参见例如边(Byeon)等人，2012)。

Lck

Lck(淋巴细胞特异性激酶)是SFK的激酶，这些SFK是T-细胞活化的关键，并且Lck 的活性通过T-细胞受体(TCR)来诱导。由Lck启动的TCR信号导致基因调节事件，从而导致抗 原特异性T-细胞的细胞因子释放、增殖和存活，由此扩增特异性免疫应答。预期Lck的抑制 提供新的治疗方法用于治疗T-细胞-介导的自身免疫病和炎症疾病和/或器官移植排斥(参 见例如马丁(Martin)等人，2010)。

已知的化合物

尼古列斯库-杜瓦斯(Niculescu-Duvaz)等人，2006，描述了某些咪唑并[4,5-b]吡 啶-2-酮和噁唑并[4,5-b]吡啶-2-酮化合物，其尤其抑制RAF(例如BRAF)活性，并且其可用 于治疗增殖性病症如癌症。其中所示的许多化合物具有5-(叔丁基)-2-(苯基)-吡唑-3-基 基团或5-(叔丁基)-2-(吡啶基)-吡唑-3-基基团。然而，在每一情况下，所述苯基和吡啶基 基团是未取代的、对位取代的、或邻,对位二取代的；没有一个化合物是间位取代的。示出以 下化合物：

尼古列斯库-杜瓦斯(Niculescu-Duvaz)等人，2007，描述了某些咪唑并[4,5-b]吡 啶-2-酮和噁唑并[4,5-b]吡啶-2-酮化合物，其尤其抑制RAF(例如BRAF)活性，并且其可用 于治疗增殖性病症如癌症。其中所示的许多化合物具有5-(叔丁基)-2-(苯基)-吡唑-3-基 基团。然而，在每一情况下，所述苯基基团是未取代的或对位取代的；没有一个化合物是间 位取代的。示出以下化合物：

施普林格(Springer)等人，2009，描述了某些吡啶并[2,3-b]吡嗪-8-取代的化合 物，其尤其抑制RAF(例如BRAF)活性，并且其可用于治疗增殖性病症如癌症。其中所示的许 多化合物具有5-(叔丁基)-2-(苯基)-吡唑-3-基基团或5-(叔丁基)-2-(吡啶基)-吡唑-3- 基基团。然而，在每一情况下，所述苯基和吡啶基基团是未取代的或对位取代的；没有一个 化合物是间位取代的。示出以下化合物：

尼古列斯库-杜瓦斯(Niculescu-Duvaz)等人，2009，描述了某些芳基-喹啉基化合 物，其尤其抑制RAF(例如BRAF)活性，并且其可用于治疗增殖性病症如癌症。其中所示的许 多化合物具有5-(叔丁基)-2-(苯基)-吡唑-3-基基团。然而，在每一情况下，所述苯基基团 是未取代的或对位取代的；没有一个化合物是间位取代的。示出以下化合物：

施普林格(Springer)等人，2011，描述了某些1-(5-叔丁基-2-苯基-2H-吡唑-3- 基)-3-[2-氟-4-(1-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-7-基氧基)苯基]脲化 合物，其尤其抑制RAF(例如BRAF)活性，并且其可用于治疗增殖性病症如癌症。示出以下化 合物：

默里(Murray)等人，2011，描述了某些用于在治疗炎症疾病或呼吸病症中使用的 化合物。其中所示的一些化合物具有5-(叔丁基)-2-(苯基)-吡唑-3-基基团或5-(叔丁基)- 2-(吡啶基)-吡唑-3-基基团。然而，在每一情况下，所述苯基和吡啶基基团是未取代的、对 位取代的、或间、对位二取代的；没有一个化合物是间位取代的、对位-未取代的。示出以下 化合物：

许多具有5-(叔丁基)-2-(3-氟-苯基)-吡唑-3-基基团的化合物是已知的，包括以 下：

发明概述

本发明的一个方面涉及某些1-(5-叔丁基-2-芳基-吡唑-3-基)-3-[2-氟-4-[(3- 氧代-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-8-基)氧基]苯基]脲化合物(在此被称为“TBAP化合物”)，如 在此所描述。

本发明的另一个方面涉及组合物(例如，药物组合物)，所述药物组合物包括如在 此所描述的TBAP化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明的另一个方面涉及制备组合物(例如，药物组合物)的方法，所述方法包括 将如在此所描述的TBAP化合物与药学上可接受的载体或稀释剂混合的步骤。

本发明的另一个方面涉及在体外或在体内抑制RAF(例如，BRAF、CRAF等)功能(例 如，在细胞中)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的如在此所描述的TBAP化合物接 触。

本发明的另一个方面涉及如在此描述的TBAP化合物，用于在通过疗法治疗人体或 动物体的方法中使用，例如，用于在治疗如在此描述的病症(例如疾病)的方法中使用。

本发明的另一个方面涉及如在此描述的TBAP化合物在制造例如用于在治疗的方 法中使用(例如，用于在治疗如在此描述的病症(例如，疾病)的方法中使用)的药物中的用 途。

本发明的另一个方面涉及治疗方法，例如，治疗如在此所描述的病症(例如疾病) 的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者优选地以药物组合物的形式给予治疗有效量的 如在此所描述的TBAP化合物。

本发明的另一个方面涉及试剂盒，所述试剂盒包括(a)如在此所描述的TBAP化合 物，优选地被提供为药物组合物并且在合适的容器中和/或具有合适的包装；和(b)使用说 明书，例如，关于如何给予所述化合物的书面说明。

本发明的另一个方面涉及TBAP化合物，所述TBAP化合物可通过如在此所描述的合 成方法、或包括如在此描述的合成方法的方法获得的。

本发明的另一个方面涉及TBAP化合物，所述TBAP化合物是通过如在此所描述的合 成方法、或包括如在此描述的合成方法的方法而获得的。

本发明的另一个方面涉及如在此所描述的新颖中间体，其适合用于在此描述的合 成方法中使用。

本发明的另一个方面涉及如在此所描述的此类新颖中间体于在此描述的合成方 法中的用途。

正如本领域技术人员应当理解的一样，本发明的一个方面的特征和优选实施例也 将涉及本发明的其他方面。

发明详述

化合物

本发明的一个方面涉及某些1-(5-叔丁基-2-芳基-吡唑-3-基)-3-[2-氟-4-[(3- 氧代-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-8-基)氧基]苯基]脲化合物，其是结构上相关的以下化合物：

更具体地，本发明涉及某些相关的化合物，其额外地具有单一间位取代基(在此表 示为-Y)。

因此，本发明的一个方面涉及如下化合物，所述化合物选自具有以下化学式的化 合物、以及其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、和溶剂化物，其中＝X-和-Y是如在此定 义的(为了方便，在此统称为“TBAP化合物”)：

本发明的一些实施例包含以下：

(1)化合物，所述化合物选自具有下式的化合物、以及其药学上可接受的盐、N-氧 化物、水合物和溶剂化物：

其中：

＝X-独立地是＝CH-或＝N-；

-Y独立地是-Y¹、-Y²、-Y³、-Y⁴、-Y⁵、或-Y⁶；

-Y¹独立地是-F、-Cl、-Br、或-I；

-Y²是直链或支链的饱和C_1-4烷基；

-Y³是直链或支链的饱和C_1-4卤代烷基；

-Y⁴是-OH；

-Y⁵是直链或支链的饱和C_1-4烷氧基；并且

-Y⁶是直链或支链的饱和C_1-4卤代烷氧基。

注意，互变异构化可能是在3-氧代-3,4-二氢吡啶并[3,2-b]吡嗪-8-基基团上，如 下所示。除非另外指明，提及一种互变异构体旨在提及两种互变异构体。

是的互变异构体

注意当-X＝是-N＝并且-Y是-Y⁴(即-OH)时，互变异构化可能是在所得的2-羟基- 吡啶-4-基基团上，如下所示。除非另外指明，提及一种互变异构体旨在提及两种互变异构 体。

是的互变异构体

注意当＝X-是＝N-时，所得基团是吡啶基-4-基基团，并且可以形成一种N-氧化 物，如下所示。

为了避免疑义，术语“直链或支链饱和C_1-4卤代烷基”涉及具有1个或多个(例如1 个、2个、3个等)卤素(例如-F、-Cl、-Br、-I)取代基的直链或支链饱和C_1-4烷基基团。这种基 团的实例是-CF₃。

为了避免疑义，术语“直链或支链饱和C_1-4烷氧基”涉及基团-OR基，其中R是直链或 支链饱和C_1-4烷基基团。这种基团的实例是-OMe。

类似地，术语“直链或支链饱和C_1-4卤代烷氧基”涉及基团-OR基，其中R是直链或支 链饱和C_1-4卤代烷基基团。这种基团的实例是-OCF₃。

为了避免疑义：甲基缩写为-Me；乙基缩写为-Et；正-丙基缩写为-nPr；异-丙基缩 写为-iPr；正-丁基缩写作为-nBu；异-丁基缩写为-iBu；仲-丁基缩写为-sBu；叔-丁基缩写 为-tBu；并且苯基缩写为-Ph。

基团＝X-

(2)根据(1)所述的化合物，其中＝X-是＝CH-。

(3)根据(1)所述的化合物，其中＝X-是＝N-。

基团-Y

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y¹。

(5)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y²。

(6)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y³。

(7)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y⁴。

(8)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y⁵。

(9)根据(1)至(3)中任一项所述的化合物，其中-Y是-Y⁶。

基团-Y¹

(10)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话独立地是-F、- Cl、-Br。

(11)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话独立地是-F或- Cl。

(12)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话是-F。

(13)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话是-Cl。

(14)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话是-Br。

(15)根据(1)至(9)中任一项所述的化合物，其中-Y¹如果存在的话是-I。

基团-Y²

(16)根据(1)至(15)中任一项所述的化合物，其中-Y²如果存在的话独立地是- Me、-Et、-nPr、-iPr、-nBu、-iBu、-sBu、或-tBu。

(17)根据(1)至(15)中任一项所述的化合物，其中-Y²如果存在的话独立地是- Me、-Et、-nPr、或-iPr。

(18)根据(1)至(15)中任一项所述的化合物，其中-Y²如果存在的话独立地是-Me 或-Et。

(19)根据(1)至(15)中任一项所述的化合物，其中-Y²如果存在的话是-Me。

基团-Y³

(20)根据(1)至(19)中任一项所述的化合物，其中-Y³如果存在的话是

直链或支链的饱和C_1-4氟烷基。

(21)根据(1)至(19)中任一项所述的化合物，其中-Y³如果存在的话独立地是- CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂、或-CH₂CF₃。

(22)根据(1)至(19)中任一项所述的化合物，其中-Y³如果存在的话独立地是- CH₂F、-CHF₂、或-CF₃。

(23)根据(1)至(19)中任一项所述的化合物，其中-Y³如果存在的话是-CF₃。

基团-Y⁵

(24)根据(1)至(23)中任一项所述的化合物，其中-Y⁵如果存在的话独立地是-O- Me、-O-Et、-O-nPr、-O-iPr、-O-nBu、-O-iBu、-O-sBu、或-O-tBu。

(25)根据(1)至(23)中任一项所述的化合物，其中-Y⁵如果存在的话独立地是-O- Me、-O-Et、-O-nPr、或-O-iPr。

(26)根据(1)至(23)中任一项所述的化合物，其中-Y⁵如果存在的话独立地是-O- Me或-O-Et。

(27)根据(1)至(23)中任一项所述的化合物，其中-Y⁵如果存在的话是-O-Me。

基团-Y⁶

(28)根据(1)至(27)中任一项所述的化合物，其中-Y⁶如果存在的话是

直链或支链的饱和C_1-4氟烷氧基。

(29)根据(1)至(27)中任一项所述的化合物，其中-Y⁶如果存在的话独立地是-O- CH₂F、-O-CHF₂、-O-CF₃、-O-CH₂CH₂F、-O-CH₂CHF₂、或-O-CH₂CF₃。

(30)根据(1)至(27)中任一项所述的化合物，其中-Y⁶如果存在的话独立地是-O- CH₂F、-O-CHF₂、或-O-CF₃。

(31)根据(1)至(27)中任一项所述的化合物，其中-Y⁶如果存在的话是-O-CF₃。

一些优选的化合物

(32)根据(1)所述的化合物，所述化合物选自具有以下化学式的化合物以及其药 学上可接受的盐、N-氧化物、水合物和溶剂化物：

组合

应理解，出于清楚的目的描述于分开实施例的背景下的本发明的某些特征还可以 按组合形式提供于单个实施例中。相反地，出于简洁的目的描述于单个实施例的背景下的 本发明不同特征还可以分开地或以任何合适的亚组合形式提供。与由这些变量(例如，＝ X-、-Y、-Y¹、-Y²、-Y³、-Y⁴、-Y⁵、-Y⁶等)代表的化学基团有关的这些实施例的所有组合由本发 明具体地包含，并且在此披露为恰如各自以及每个组合被单独并且明确披露一样，其程度 使此类组合包括那些稳定的多种化合物(即那些可以被分离、表征、并且用于生物活性测试 的多种化合物)。此外，列举于描述此类变量的实施例中的化学基团的所有亚组合也被具体 地包括在本发明中并且在此进行了披露，就好像化学基团的每一与每个这样的亚组合被单 独地并且明确地在此披露一样。

基本上纯化的形式

本发明的一个方面涉及如在此描述的处于基本上纯化的形式和/或处于基本上不 含污染物的形式的TBAP化合物。

在一个实施例中，所述化合物处于基本上纯化的形式和/或处于基本上不含污染 物的形式。

在一个实施例中，所述化合物是以基本上纯化的形式，所述形式具有纯度为按重 量计至少50％，例如按重量计至少60％，例如按重量计至少70％，例如按重量计至少80％， 例如按重量计至少90％，例如按重量计至少95％，例如按重量计至少97％，例如按重量计至 少约98％，例如，按重量计至少99％。

在一个实施例中，所述化合物是以基本上不含污染物的形式，其中这些污染物表 示按重量计不超过50％，例如按重量计不超过40％，例如按重量计不超过30％，例如按重量 计不超过20％，例如按重量计不超过10％，例如按重量计不超过5％，例如按重量计不超过 3％，例如按重量计不超过2％，例如按重量计不超过1％。除非指定，否则这些污染物是指其 他化合物。

异构体

某些化合物可以按一种或多种具体的几何异构、旋光异构、对映异构、非对映异 构、差向异构、阻转异构、立体异构、互变异构、构象异构、或端基异构形式存在，这些形式包 括但不限于，顺式(cis)-和反式(trans)-形式；E-和Z-形式；c-、t-和r-形式；内(endo)-和 外(exo)-形式；R-、S-和内消旋-形式；D-和L-形式；d-和1-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇- 和烯醇化物-形式；同边(syn)-和对边(anti)-异构形式；向斜(synclinal)-和背斜 (anticlinal)-形式；α-和β-形式；直立和平伏形式；船式、椅式、扭曲式、信封式-、以及半椅 式形式；及其组合，在下文统称为“异构体”(或“异构体形式”)。

注意，除了如以下对互变异构形式的讨论外，在此所使用的术语“异构体”具体排 除结构(或构象)异构体(即原子间的连接不同而不是仅空间原子位置不同的异构体)。例 如，提及甲氧基基团(-OCH₃)不应理解为提及其结构异构体，即羟甲基基团(-CH₂OH)。类似 地，提及邻-氯苯基不应理解为提及其结构异构体间-氯苯基。但是，提及一类结构可以充分 地包括落入此类别内的结构异构形式(例如，C_1-7烷基包括正-丙基和异-丙基；丁基包括 正-、异-、仲-和叔-丁基；甲氧基苯基包括邻-、间-和对-甲氧基苯基)。

以上排除不涉及互变异构形式，例如酮-、烯醇-和烯醇化物-形式，如在例如以下 互变异构对中：酮/烯醇(说明如下)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/ 烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮、以及硝基/酸式硝基。

注意，特别地包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。 例如，H可以处于任何同位素形式，包括¹H、²H(D)、以及³H(T)；C可以处于任何同位素形式，包 括¹²C、¹³C、以及¹⁴C；O可以处于任何同位素形式，包括¹⁶O以及¹⁸O；以及类似物。

除非另外说明，提及一种具体化合物包括所有此类异构体形式，包括其混合物。此 类异构形式的制备方法和分离方法是本领域己知的或可通过改编在此所教导的方法或己 知方法以己知方式容易地获得。

盐类

可以方便的或令人希望的制备、纯化、和/或处理所述化合物的对应的盐，例如药 学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例讨论于贝尔热(Berge)等人，1977，“药学上可接 受的盐(PharmaceuticallyAcceptableSalts)”，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)，第66卷， 第1-19页中。

例如，如果化合物是阴离子的，或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以 是-COO-)，那么可以与一种适合的阳离子形成盐。适合的无机阳离子的实例包括，但不限于 碱金属离子，例如Na⁺和K⁺；碱土金属阳离子，例如Ca²⁺和Mg²⁺；以及其他阳离子，例如Al³⁺。适 合的有机阳离子的实例包括，但不限于铵离子(即NH₄⁺)和饱和的铵离子(NH₃R⁺、NH₂R₂⁺、NHR₃⁺、NR₄⁺)。一些适合的经取代的铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺，二乙胺，二环己胺， 三乙胺，丁胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌嗪，苄胺，苯基苄胺，胆碱，葡甲胺，以及氨丁三 醇，连同氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)。常见季铵离子的一个实例是N(CH₃)₄⁺。

如果化合物是阳离子的，或具有可以是阳离子的官能团(例如，-NH₂可以是-NH₃⁺)， 那么可以与适合的阴离子形成盐。适合的无机阴离子的实例包括，但不限于衍生自以下无 机酸的那些：盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，亚硫酸，硝酸，亚硝酸，磷酸，以及亚磷酸。

适合的有机阴离子的实例包括，但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基 苯甲酸，乙酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯甲酸，樟脑磺酸，肉桂酸，柠檬酸，依地酸，乙烷二磺 酸，乙烷磺酸，甲酸，富马酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，乙醇酸，羟基马来酸，羟基萘羧酸， 羟乙基磺酸，乳酸，乳糖酸，月桂酸，马来酸，苹果酸，甲烷磺酸，粘酸，油酸，草酸，棕榈的酸， 扑酸，泛酸，苯乙酸，苯磺酸，丙酸，丙酮酸，水杨酸，硬脂酸，琥珀酸，磺胺酸，酒石酸，甲基苯 磺酸，以及缬草酸。适合的聚合有机阴离子的实例包括，但不限于衍生自以下聚合酸的那 些：鞣酸，羧甲基纤维素。

除非另外说明，提及具体化合物也包括其盐形式。

N-氧化物

可以方便的或令人希望的制备、纯化、和/或处理所述化合物的相应的N-氧化物。 例如，可以将具有吡啶基的化合物制备、纯化和/或处理为相应的N-氧化物。

除非另外说明，提及具体化合物也包括其N-氧化物形式。

水合物和溶剂化物

可以方便的或令人希望的制备、纯化、和/或处理所述化合物的相应的溶剂化物。 在此以常规意义使用术语“溶剂化物”是指溶质(例如化合物、化合物的盐)和溶剂的复合 物。如果溶剂是水，溶剂化物可以方便地称为水合物，例如，一水合物、二-水合物、三水合物 等。

除非另外说明，提及具体化合物也包括其溶剂化物和水合物。

化学保护的形式

可以方便的或令人希望的制备、纯化、和/或处理处于经化学保护的形式的化合 物。术语“化学保护的形式”在此以常规化学意义被使用并且涉及一种化合物，其中一个或 更多个反应性官能团被保护免于在特定条件下(例如，pH、温度、辐射、溶剂以及类似物)不 希望的化学反应。在实践中，采用熟知的化学方法来可逆地使得官能团在特定条件下不反 应，否则所述官能团将是反应性的。以化学保护的形式，一个或更多个反应性官能团是处于 受保护的或进行保护的基团的形式(也称作受掩蔽的或进行掩蔽的基团或者被封端的或进 行封端的基团)。通过保护反应性官能团，可以进行涉及其他未受保护的反应性官能团的反 应，而不影响所述受保护的基团；通常在随后的步骤中可以除去保护基团，而基本上不影响 所述分子的其余部分。参见，例如，有机合成中的保护基团(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)(T.格林(T.Greene)和P.伍兹(P.Wuts)；第4版；约翰威利父子出版公 司(JohnWileyandSons)，2006)。

多种多样的此类“保护(protecting)”、“封端(blocking)”或“掩蔽(masking)”方 法被广泛使用并且在有机合成中是熟知的。例如，可以将具有两个非等效的反应性官能团 (两者在特定条件下均将是反应性的)的化合物衍生化以使得官能团其中之一“受保护”，并 因此在特定条件下不反应；因此受保护，所述化合物可以被用作有效地具有仅一个反应性 官能团的反应物。在所希望的反应(涉及其他官能团)完成之后，可以将所述受保护的基团 “脱保护”以使它返回到其原先的官能度。

例如，羟基基团可以保护为醚(-OR)或酯(-OC(＝O)R)，例如为：叔-丁基基醚；苄 基、二苯甲基(benzhydryl)(二苯甲基(diphenylmethyl))、或三苯甲基(trityl)(三苯基甲 基(triphenylmethyl))醚；三甲基甲硅烷基或叔-丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰酯(-OC (＝O)CH₃，-OAc)。

例如，醛或酮基团可以通过与例如一种伯醇反应而分别被保护为乙缩醛(R-CH (OR)₂)或缩酮(R₂C(OR)₂)，其中羰基(>C＝O)被转变为二醚(>C(OR)₂)。在酸存在下使用大量 过量的水来通过水解容易地再生醛或酮基团。

前药

可以方便的或令人希望的制备、纯化、和/或处理处于前药形式的化合物。如在此 所使用的术语“前药”涉及这样一种化合物，当其被代谢(例如在体内)时产生所希望的活性 化合物。典型地，所述前药是无活性的、或小于所希望的活性化合物的活性，但可以提供有 利的处理、给药、或代谢特性。

例如，一些前药是活性化合物的酯类(例如，一种生理学上可接受的代谢不稳定的 酯)。在代谢期间，所述酯基(-C(＝O)OR)被裂解以产生活性药物。此类酯可以通过例如母体 化合物中的任何羧酸基团(-C(＝O)OH)的酯化来形成，其中在适当情况下预先保护存在于 母体化合物中的任何其他反应性基团，随后脱保护(如果需要的话)。

而且，一些前药被酶促激活以产生活性化合物或一种这样的化合物，所述化合物 在进一步化学反应时产生了活性化合物(例如，如在ADEPT、GDEPT、LIDEPT中等)。例如，所述 前药可以是糖衍生物或其他糖苷缀合物，或可以是氨基酸酯衍生物。

化学合成

在此描述了用于本发明的化合物的化学合成的方法。这些和/或其他熟知的方法 可以按已知方式被修饰和/或改编，以便有助于本发明范围内的另外的化合物的合成。

可用于制备在此描述的化合物的通用实验室方法和程序的描述被提供于沃格尔 的实用有机化学教科书(Vogel’sTextbookofPracticalOrganicChemistry)，第5版， 1989，(编者：弗尼斯(Furniss)，汉纳福德(Hannaford)，史密斯(Smith)，和塔歇尔 (Tatchell))(由朗文出版社，英国出版)中。

用于合成吡啶化合物的方法具体被描述于杂环化学(HeterocyclicChemistry)， 第3版，1998，(编者：焦耳(Joule)，米尔斯(Mills)，和史密斯(Smith))(由查普曼和霍尔出 版社(Chapman&Hall)，英国出版)中。

在此描述的TBAP化合物可以经由关键中间体(2)来制备。这个中间体可以从可商 购的起始材料、2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(1)、以及3-氟-4-氨基苯酚来制备。中间体(2)可 以选择性地在氨基基团处被保护为例如BOC氨基甲酸酯，以提供中间体(3)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案1

中间体(3)也可以直接从2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(1)和N-BOC-保护的3-氟-4-氨 基苯酚来获得。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案2

经保护的中间体(3)的硝基按可以例如使用Pd/C和甲酸铵或氢、或者使用NiCl₂和 NaBH₄被还原以给出氨基基团，以给出二氨基中间体(4)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案3

吡啶并吡嗪酮可以从中间体(4)通过与乙醛酸乙酯或乙醛酸反应而获得。异构体 (5)和(6)两者均可以从(4)与乙醛酸乙酯或乙醛酸的反应而获得。两种异构体的比率可以 受试剂和溶剂的选择影响，使得一种异构体被优先获得。所希望的异构体(5)可以通过柱色 谱法或从混合物中的选择性结晶而从所述混合物分离。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案4

保护基团(PG)的脱保护，例如使用针对Boc保护基团的四丁基氟化铵(TBAF)，产生 常见的中间体(7)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案5

使关键中间体(7)与3-叔-丁基-5-异氰酸基-1-芳基-1H-吡唑(10)反应，以提供相 应的脲(11)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案6

对应的异氰酸酯(10)可以，例如，通过使胺(9)与光气、三光气或它们的衍生物反 应，或通过相应的羧酸(8)至酰基叠氮化物(例如二苯基磷酰基叠氮化物)的转化、随后进行 克尔蒂斯重排(Curtiusrearrangement)而获得。这些试剂仅出于说明的目的被鉴定，并且 应当注意，其他适合的试剂是本领域中已知的，其也可以被用来将胺或羧酸转化为异氰酸 酯。

此类方法的实例在以下方案中展示。

方案7

所希望的羧酸(8)可以例如通过相应的间位取代的苯基或吡啶基硼酸(R是H)或硼 酸酯(R是烷基)(12)与3-叔丁基-1H-吡唑-5-甲酸酯的反应、随后将酯水解成羧酸而获得。 硼酸酯B(OR)₂包括环状酯，例如4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案8

所希望的胺(9)可以例如通过相应的间位取代的苯基或吡啶基肼(14)与4,4-二甲 基-3-氧代戊腈的反应而获得。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案9

在一种替代性方法中，使中间体(7)与活化的3-叔-丁基-5-氨基-1-芳基-1H-吡唑 的氨基甲酸酯反应，以提供相应的脲。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案10

相应的活化氨基甲酸酯可以例如通过胺(9)与氯甲酸酯的反应而获得，例如与氯 甲酸苯酯反应以形成(3-(叔丁基)-1-芳基-1H-吡唑-5-基)氨基甲酸苯酯(15)或与1-甲基 乙烯基氯甲酸酯反应以形成1-甲基乙烯基(3-(叔丁基)-1-芳基-1H-吡唑-5-基)氨基甲酸 酯。

可替代地，常见中间体(7)的氨基位置可以通过例如与氯甲酸苯酯或1-甲基乙烯 基氯甲酸酯反应而活化。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案11

如此形成的活化氨基甲酸酯然后可以与芳香胺反应以提供相应的脲。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案12

示于以上方案10-12中的活化氨基甲酸酯仅仅是实例。也可以使用本领域中已知 的其他活化氨基甲酸酯，包括例如4-硝基苯基氨基甲酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸 酯。

在一种替代性方法中，在环化之前，首先形成脲。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案13

在一个替代性方法中，可以将氨基苯酚转化成脲以形成中间体(20)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案14

然后可以将中间体(20)与(1)偶联以提供(17)。例如，如以上在方案13中所描述的 进一步转化导致产物(11)。

这种方法的实例在以下方案中展示。

方案15

组合物

本发明的一个方面涉及组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括如在此所描 述的TBAP化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的另一个方面涉及制备组合物(例如，药物组合物)的方法，所述方法包括 将如在此所描述的TBAP化合物与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。

用途

在此描述的TBAP化合物适用于以下各项的治疗：例如，增殖性病症(如“抗-增生 剂”)、癌症(如“抗癌剂”)、炎症疾病(如“抗炎剂”)、病毒感染(如“抗病毒剂”)、神经退行性 疾病(如“抗-神经退行剂”)、纤维化疾病(如“抗-纤维化剂”)等。

在抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)的方法中的用途

本发明的一个方面涉及在体外或在体内抑制RAF(例如，BRAF、CRAF等)功能(例如， 在细胞中)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的如在此所描述的TBAP化合物接触。

本领域普通技术人员容易能够确定候选化合物是否抑制RAF(例如BRAF、CRAF等)。 例如，适合的测定在此被描述或者是本领域中已知的。

在一个实施例中，所述方法在体外进行。

在一个实施例中，所述方法在体内进行。

在一个实施例中，所述TBAP化合物以药学上可接受的组合物形式提供。

可以处理任何类型的细胞，包括动物脂肪、肺、胃肠(包括例如肠、结肠)、乳腺(乳 房)、卵巢、前列腺、肝脏(肝)、肾脏(肾)、膀胱、胰腺、脑和皮肤细胞。

例如，可以使细胞样品在体外生长，并使化合物与所述细胞接触，并观察化合物对 这些细胞的效应。作为“效应”的实例，可以确定细胞(例如活的或死的等)的形态学状态。若 发现化合物对细胞施加影响，则这可以用作化合物在治疗具有相同细胞类型的细胞的患者 的方法中的功效的预测标志物或诊断标志物。

在抑制细胞增殖等的方法中的用途

在此描述的TBAP化合物，例如(a)调节(例如抑制)细胞增殖；(b)抑制细胞周期进 程；(c)促进细胞凋亡；或(d)这些中的一种或多种的组合。

本发明的一个方面涉及一种在体外或在体内调节(例如抑制)细胞增殖(例如，细 胞的增殖)、抑制细胞周期进程、促进细胞凋亡、或这些中的一种或多种的组合的方法，所述 方法包括使细胞与有效量的如在此所描述的TBAP化合物接触。

在一个方面，所述方法是在体外或在体内调节(例如抑制)细胞增殖(例如，细胞的 增殖)的方法，所述方法包括使细胞与有效量的如在此所描述的TBAP化合物接触。

在一个实施例中，所述方法在体外进行。

在一个实施例中，所述方法在体内进行。

在一个实施例中，所述TBAP化合物以药学上可接受的组合物形式提供。

可以处理任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠(包括例如肠、结肠)、乳腺(乳 房)、卵巢、前列腺、肝脏(肝)、肾脏(肾)、膀胱、胰腺、脑和皮肤细胞。

本领域普通技术人员容易能够确定候选化合物是否调节(例如抑制)细胞增殖、 等。例如，在此描述了测定法，其可以方便地用来评估由具体化合物提供的活性。

例如，可以使细胞样品(例如来自肿瘤)在体外生长，并使化合物与所述细胞接触， 并观察化合物对这些细胞的效应。作为“效应”的实例，可以确定细胞(例如活的或死的等) 的形态学状态。若发现化合物对细胞施加影响，则这可以用作化合物在治疗具有相同细胞 类型的细胞的患者的方法中的功效的预测标志物或诊断标志物。

在治疗方法中的用途

本发明的另一个方面涉及如在此描述的TBAP化合物，用于在通过疗法治疗人体或 动物体的方法中使用，例如，用于在治疗如在此描述的病症(例如疾病)的方法中使用。

在制造药物中的用途

本发明的另一个方面涉及如在此描述的TBAP化合物在制造例如用于在治疗的方 法中使用(例如，用于在治疗如在此描述的病症(例如，疾病)的方法中使用)的药物中的用 途。

在一个实施例中，所述药物包括TBAP化合物。

治疗方法

本发明的另一个方面涉及治疗方法，例如，治疗如在此所描述的病症(例如疾病) 的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者优选地以药物组合物的形式给予治疗有效量的 如在此所描述的TBAP化合物。

治疗的病症-增殖性病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是增殖性病症的治疗。

如在此所使用，术语“增殖性病症”涉及所不希望的过量或异常细胞的不想要或失 控的细胞增殖，例如赘生性或增生性生长。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：增殖性病症，其特征在于良性、恶化 前或恶性细胞增殖。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：增生；赘生物；肿瘤(例如组织细胞 瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)；癌症；银屑病；骨疾病，纤维增殖性病症((例如结缔组 织的纤维增殖性病症)；肺纤维化；动脉粥样硬化；或血管的平滑肌细胞增殖(例如血管成形 术后的狭窄或再狭窄)。

治疗的病症-癌症

在一个实施例(例如，在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途的实 施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是癌症的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是癌症转移的治疗。

在癌症中包括的是：

(1)癌，包括衍生自复层鳞状上皮的肿瘤(鳞状细胞癌)和出现在器官或腺体中的 肿瘤(腺癌)。实例包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌。

(2)肉瘤，包括：骨肉瘤和骨原性肉瘤(骨)；软骨肉瘤(软骨)；平滑肌肉瘤(平滑 肌)；横纹肌肉瘤(骨骼肌)；间皮肉瘤和间皮瘤(体腔的膜内层)；纤维肉瘤(纤维组织)；血管 肉瘤和血管内皮瘤(血管)；脂肪肉瘤(脂肪组织)；神经胶质瘤和星形细胞瘤(发现于脑中的 神经原性结缔组织)；粘液肉瘤(原始胚性结缔组织)；间充质和混合型中胚层肿瘤(混合型 结缔组织型)。

(3)骨髓瘤。

(4)黑色素瘤，包括例如浅层扩散型黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性小痣黑色素 瘤、肢端黑色素瘤、以及葡萄膜黑色素瘤。

(5)造血肿瘤，包括：骨髓性和粒细胞性白血病(骨髓的和粒细胞性的白血球系列 的恶性肿瘤)；淋巴白血病、淋巴细胞白血病或成淋巴细胞性白血病(淋巴样和淋巴细胞型 血细胞系列的恶性肿瘤)；真性红细胞增多症(也称为红细胞增多症)(各种血细胞制品但以 红细胞为主的恶性肿瘤)。

(6)淋巴瘤，包括：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

(7)混合型，包括例如腺鳞癌；混合型中胚层肿瘤；癌肉瘤；畸胎癌。

在一个实施例中，所述癌症的特征在于、或特征进一步在于癌症干细胞。

在一个实施例中，所述治疗是癌症的治疗，所述癌症对用抗体(例如已知的抗体， 例如立法批准的抗体)进行的治疗有抗性。在一个实施例中，所述治疗是黑色素瘤的治疗， 所述黑色素瘤对用抗体(例如已知的抗体，例如立法批准的抗体)进行的治疗有抗性。已知 用于治疗黑色素瘤的此类抗体的实例包括：结合至CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4) 的抗体，例如易普利姆玛(批准的)；结合至PD-1(程序性细胞死亡1受体)的抗体，例如派姆 单抗(批准的)和纳武单抗(批准的)；结合至PD-L1(程序性死亡配体1)的抗体，例如 MEDI4736(在临床试验中)和MPDL3280A(在临床试验中)；结合至黑色素瘤抗原糖蛋白NMB的 抗体和抗体缀合物，例如格莱木单抗-维多汀(glembatumumabvedotin)(在临床试验中)； 结合抗肿瘤内皮标志物1的抗体，例如欧土希珠单抗(在临床试验中)；结合至VEGF的抗体， 例如贝伐珠单抗(bevacizumab)，单独或与标准化疗或低-剂量IFN-α2b组合(在临床试验 中)；结合至神经节苷脂GD3的抗体，例如KW-2871(在临床试验中)；结合整联蛋白亚型如α_vβ₁、α_vβ₃、α_vβ₅和α_vβ₆的抗体，例如英妥木单抗(在临床试验中)。

抗癌效应可以通过一种或多种机制产生，包括但不局限于，细胞增殖的调控、细胞 周期进程的抑制、血管生成(新血管的形成)的抑制、转移的抑制(肿瘤从其来源的扩散)、细 胞迁移的抑制(癌细胞至身体其他部分的扩散)、侵入的抑制(肿瘤细胞至邻近正常结构的 扩散)、凋亡的促进(程序性细胞死亡)、通过坏死的死亡、或通过自噬诱导死亡。在此描述的 化合物可以用于治疗在此描述的癌症，独立于在此所论述的机制。

治疗的病症-炎症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是炎症(例如炎症病症或反应)的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是急性炎症(例如，由急性感染介导)的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是慢性炎症(例如，由慢性感染介导)的治疗。

在一个实施例中，所述炎症疾病选自以下各项的炎症疾病：肺(例如，哮喘；慢性阻 塞性肺病(COPD))；眼(例如葡萄膜炎)；和胃肠道(例如克罗恩氏病；溃疡性结肠炎)。

在一个实施例中，所述炎症疾病选自：

(i)具有炎症组分的肺疾病或病症，例如囊性纤维化、肺动脉高压、肺结节病、特发 性肺纤维化、并且特别是COPD(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘、以及儿科哮喘；

(ii)具有炎症组分的皮肤疾病或病症，例如特应性皮炎、过敏性皮炎、接触性皮 炎、以及银屑病；

(iii)具有炎症组分的鼻疾病或病症，例如过敏性鼻炎、鼻炎、以及鼻窦炎；

(iv)具有炎症组分的眼疾病或病症，例如结膜炎、过敏性结膜炎、干燥性角膜结膜 炎(干眼症)、青光眼、糖尿病性视网膜病、黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水肿)、视网膜中央 静脉阻塞(CRVO)、干性和/或湿性年龄相关性黄斑变性(AMO)、白内障术后炎症，并且特别是 葡萄膜炎(包括后葡萄膜炎、前葡萄膜炎、和全葡萄膜炎)、角膜移植物和角膜缘细胞移植排 斥；以及

(v)具有炎症组分的胃肠道疾病或病症，例如谷蛋白敏感性肠病(乳糜泻)；嗜酸性 食道炎；肠移植物抗宿主疾病，并且特别是克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。

在一个实施例中，所述炎症疾病选自：囊性纤维化；肺高血压；肺结节病；特发性肺 纤维化；慢性阻塞性肺病(COPD)(包括慢性支气管炎和肺气肿)；哮喘；儿科哮喘；特应性皮 炎；过敏性皮炎；接触性皮炎；银屑病；过敏性鼻炎；鼻炎；鼻窦炎；结膜炎；过敏性结膜炎；干 燥性角膜结膜炎(干眼症)；青光眼；糖尿病性视网膜病；黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水 肿)；视网膜中央静脉阻塞(CRVO)；干性和/或湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)；白内障手术 炎症；葡萄膜炎(包括后葡萄膜炎、前葡萄膜炎、和全葡萄膜炎)；角膜移植物和角膜缘细胞 移植排斥；谷蛋白敏感性肠病(乳糜泻)；嗜酸性食道炎；肠移植物抗宿主疾病；克罗恩氏病； 以及溃疡性结肠炎。

在一个实施例中，所述炎症疾病是哮喘或COPD。

在一个实施例中，所述炎症疾病是葡萄膜炎、克罗恩氏病、或溃疡性结肠炎。

治疗的病症-免疫学病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是免疫学病症的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是过敏症的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是炎症气道疾病例如哮喘的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是过敏性接触性皮炎的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是免疫系统疾病的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是自身免疫性疾病的治疗，例如类风湿性关节炎；系统 性红斑狼疮(狼疮)；炎症肠病(IBD)；多发性硬化症(MS)；1型糖尿病；格林-巴利综合征；银 屑病；格雷夫斯氏病；桥本氏甲状腺炎；重症肌无力；脉管炎；免疫缺陷病；重度联合免疫缺 陷症(SCID)；常见变异型免疫缺陷病(CVID)；人免疫缺陷病毒(HIV)；获得性免疫缺陷综合 征(AIDS)；药物诱导的免疫缺陷；或移植物抗宿主综合征。

治疗的病症-病毒性感染

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病毒性感染的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是对以下各项造成的病毒性感染的治疗：

(组I：)dsDNA病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒；

(组II：)ssDNA病毒，例如细小病毒；

(组III：)dsRNA病毒，例如呼肠孤病毒；

(组IV：)(+)ssRNA病毒，例如微小核糖核酸病毒、披膜病毒；

(组V：)(-)ssRNA病毒，例如正粘病毒、弹状病毒；

(组VI：)ssRNA-RT病毒，例如逆转录病毒；或

(组VII：)dsDNA-RT病毒，例如嗜肝DNA病毒。

如以上所使用：ds：双链；ss：+链；(+)ssRNA：+链RNA；(-)ssRNA：-链RNA；ssRNA-RT： 在生命周期中的(+链)RNA与DNA中间体。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：人免疫缺陷病毒(HIV)；乙型肝炎 病毒(HBV)；丙型肝炎病毒(HCV)；人乳头瘤病毒(HPV)；巨细胞病毒(CMV)；或艾伯斯坦-巴尔 病毒(EBV)；与卡波西肉瘤相关的人疱疹病毒8(HHV)；柯萨奇病毒B3；博尔纳(Borna)病毒； 流感病毒。

治疗的病症-纤维化病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是纤维化病症(例如，病症，其特征在于过量纤 维化，例如，组织或器官中的过量纤维结缔组织，例如通过修复性或反应性过程(例如响应 于损伤(例如瘢痕、愈合)或由单一细胞系引起的过量纤维化组织(例如纤维瘤))而触发的) 的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：

(对于肺：)肺纤维化；继发于肺纤维化的囊性纤维化；特发性肺纤维化；煤炭工人 的进行性大块纤维化；

(对于肝：)肝硬化；

(对于心：)心内膜心肌纤维化；陈旧性心肌梗死；心房纤维化；

(对于纵隔：)纵隔纤维化；

(对于骨：)骨髓纤维化；

(对于腹膜后腔：)腹膜后纤维化；

(对于皮肤：)肾源性系统性纤维化；瘢痕瘤性瘢痕；系统性硬化症；硬皮病；

(对于肠：)克罗恩氏病；

(对于结缔组织：)关节纤维化；或囊炎。

治疗的病症-通过抑制突变体BRAF而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)(例如增殖性病症)的治疗， 所述病症与RAF(例如BRAF)的突变形式，例如像描述于戴维斯(Davies)等人，2002；万(Wan) 等人，2004；以及斯特拉顿(Stratton)等人，2003中的突变相关。

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)(例如增殖性病症，例如癌 症)的治疗，所述病症通过抑制RAF(例如BRAF)而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)，其特征在于过表 达突变体RAF(例如BRAF)的细胞(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表达是按 1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)。

增殖性病症：

在一个实施例中，该治疗是以下各项的治疗：恶性黑色素瘤；结直肠癌；转移性结 直肠癌；滤泡状甲状腺癌；岛状甲状腺癌；乳头状甲状腺癌；卵巢癌；低级卵巢癌；非小细胞 肺癌；毛发细胞白血病；胆管癌；儿科低级神经胶质瘤(例如毛细胞型星形细胞瘤；神经节胶 质瘤；多形性黄色星形细胞瘤)；多发性骨髓瘤；或胰腺髓样癌。在一个实施例中，所述治疗 是以下项的治疗：胰腺导管腺癌。

在一个实施例中，所述治疗是病症(例如，疾病)的治疗，所述病症与RAF(例如 BRAF、CRAF等)的突变形式相关，但是对用已知的(例如批准的)RAF(例如BRAF、CRAF等)抑制 剂进行的治疗有抗性。已知的(例如批准的)BRAF抑制剂的实例包括威罗菲尼 (vemurafenib)(PLX4032、RG7204、Zelboraf)(批准的)和达拉菲尼(dabrafenib)(GSK- 2118436)(批准的)。

在一个实施例中，所述治疗是病症(例如，疾病)的治疗，所述病症与RAF(例如 BRAF、CRAF等)的突变形式相关，但是对用已知的(例如批准的)RAF(例如BRAF、CRAF等)抑制 剂与已知的(例如批准的)MEK抑制剂的组合进行的治疗有抗性。MEK抑制剂的实例包括：曲 美替尼(trametinib)(GSK1120212)(批准的)；司美替尼(selumetinib)(AZD6244)(在临床 试验中)；PD325901(在临床试验中)；卡比替尼(cobimetinib)(GDC90973，XL518)(在临 床试验中)；以及CI1040(PD184352)(在临床试验中)。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：内在抗威罗菲尼的BRAF-突变型黑 色素瘤；获得对威罗菲尼治疗具有耐药性的BRAF-突变型黑色素瘤；内在抗达拉菲尼的 BRAF-突变型黑色素瘤；获得对达拉菲尼治疗具有耐药性的BRAF-突变型黑色素瘤；或获得 对BRAF抑制剂和MEK抑制剂(例如达拉菲尼和曲美替尼)的组合具有耐药性的BRAF-突变型 黑色素瘤。

其他病症：

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：朗格汉斯细胞组织细胞增生症 (LCH)或脂质肉芽肿病(Erdheim-Chesterdisease)。

治疗的病症-通过抑制BRAF和CRAF两者而改善的病症

具有例如RAS、RAF和EGFR的活化突变的癌症；或者RAS、RAF和EGFR(包括其任何亚 型)的过表达的癌症可以对全RAF(例如CRAF和BRAF)抑制是特别敏感的。具有导致上调的 RAF-MEK-ERK途径信号的其他异常的癌症还可以对用全RAF(例如CRAF和BRAF)活性的抑制 剂进行治疗是特别敏感的。此类异常的实例包括生长因子受体的组成型活化；一种或多种 生长因子受体的过表达；一种或多种生长因子的过表达；KSR-介导的途径活化；以及BRAF或 CRAF基因融合。

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)(例如增殖性病症，例如癌 症)的治疗，所述病症通过抑制BRAF和CRAF两者而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)(例如增殖性病症， 例如癌症)，其特征在于生长因子受体的组成型活化；一种或多种生长因子受体的过表达 (例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表达是按1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)；一 种或多种生长因子的过表达(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表达是按1.5、 2、3、5、10、20或50的倍数)；和/或BRAF和/或CRAF活化基因融合。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如疾病)(例如增殖性病症， 例如癌症)，其特征在于所有以下各项中的一种或多种：

(a)激活RAS和/或RAF的突变体；

(b)RAS和/或RAF的上调；

(c)RAF-MEK-ERK途径信号的上调；以及

(d)生长因子受体(例如ERBB2和EGFR)的上调。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：炎症疾病；感染；自身免疫病症；中 风；局部贫血；心脏病症；神经病症；纤维生成病症、增殖性病症；过度增殖性病症；非癌症过 度增殖性病症；肿瘤；白血病；赘生物；癌症；癌；代谢疾病；恶性疾病；血管再狭窄；银屑病； 动脉粥样硬化；类风湿性关节炎；骨关节炎；心力衰竭；慢性疼痛；神经性疼痛；干眼症；闭角 青光眼；或宽角性青光眼眼。

治疗的病症-与RAS突变和/或MAPK途径活化相关联的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症是与RAS (例如KRAS、NRAS、HRAS)突变和/或MAPK途径活化(例如MAPK途径的活动过度)相关联的。

增殖性病症：

在一个实施例中，所述治疗是增殖性病症(例如癌症)的治疗，所述增殖性病症是 与RAS(例如KRAS、NRAS、HRAS)突变和/或MAPK途径活化(例如MAPK途径的活动过度)相关联 的。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：非小细胞肺癌；结直肠癌；转移性 结直肠癌；肝细胞癌；胰腺腺癌；恶性黑色素瘤；血液恶性病(例如幼年型粒单核细胞白血病 (JMML)；慢性粒单核细胞白血病(CMML)；骨髓增生异常综合征(MDS)；急性成淋巴细胞性白 血病(ALL)；多发性骨髓瘤(MM)；伯基特淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤)；I型上皮性卵巢癌；原发 性腹膜癌；胆道腺癌；滤泡状甲状腺癌；未分化的乳头状甲状腺癌；软组织肉瘤(例如血管肉 瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；粘液瘤；恶性纤维性组织细胞瘤)；神经纤维瘤1型(NF1)；不可 操作丛状型神经纤维瘤(PN)；葡萄膜黑色素瘤；睫状体黑色素瘤；脉络膜黑色素瘤；虹膜黑 色素瘤；转移性眼内黑色素瘤；肾上腺皮质癌；肾癌；精原细胞瘤；膀胱癌；子宫内膜癌；宫颈 癌；成神经细胞瘤；胃腺癌；头颈部鳞状细胞癌；或前列腺癌。

其他病症：

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：移植(例如异种移植物；皮肤；肢 体；器官；骨髓)排斥；骨关节炎；类风湿性关节炎；囊性纤维化；糖尿病并发症(例如糖尿病 性视网膜病；糖尿病性肾病变)；肝肿大；心脏肥大；努南综合征；心脏-面-皮肤综合征；肥厚 型心肌病；中风(例如急性病灶缺血性中风；全脑缺血)；心力衰竭；败血症性休克；哮喘；慢 性阻塞性肺病；阿尔茨海默病；慢性疼痛(例如特发性疼痛；与慢性酒精中毒、维生素缺乏、 尿毒症、或甲状腺功能减退症相关的疼痛；与炎症相关的慢性疼痛；慢性手术后疼痛)；或神 经性疼痛(例如与炎症相关的；手术后疼痛；幻肢痛；灼烧痛；痛风；三叉神经痛；急性疱疹性 疼痛疼痛；疱疹后疼痛(post-herpeticpain)；灼痛；糖尿病性神经病；丛撕裂；神经瘤；脉 管炎；病毒感染；挤压伤；压迫性损伤；组织损伤；截肢；外周神经系统与中枢神经系统之间 的神经损伤)。

治疗的病症-通过抑制SRC而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症通过抑制 SRC而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)(例如增殖性病 症)，所述病症与SRC突变；SRC过表达(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表达是 按1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)；或SRC的上游途径活化(例如，通过升高的RTK信号传导) 相关联。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：子宫内膜癌；非小细胞肺癌；恶性 胸膜间皮瘤；恶性黑色素瘤；慢性髓性白血病(例如伊马替尼抗性)；骨转移；激素-抗性前列 腺癌；复发性前列腺癌；复发性骨肉瘤；急性成淋巴细胞性白血病；结直肠癌；转移性结直肠 癌；乳腺癌；卵巢癌；复发性或转移性头颈癌(例如具有隐匿原发性鳞状细胞癌的转移性鳞 状颈癌；具有隐匿原发性的复发性转移性鳞状颈癌；喉咽复发性鳞状细胞癌；喉复发性鳞状 细胞癌；唇和口腔复发性鳞状细胞癌；鼻咽复发性鳞状细胞癌；口咽复发性鳞状细胞癌；副 鼻窦和鼻腔复发性鳞状细胞癌；喉复发性疣状癌；口腔复发性疣状癌；喉咽鳞状细胞癌；喉 鳞状细胞癌；唇和口腔鳞状细胞癌；鼻咽的鳞状细胞癌；口咽鳞状细胞癌；副鼻窦和鼻腔鳞 状细胞癌；喉疣状癌；口腔疣状癌；舌癌)；复发性皮肤癌；皮肤的鳞状细胞癌；急性骨髓性白 血病；成胶质细胞瘤；或弥漫性内在脑桥胶质瘤。

治疗的病症-通过抑制p38而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症通过抑制 p38(例如p38α、p38γ)而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)(例如增殖性病 症)，所述病症与p38(例如p38α、p38γ)突变；p38(例如p38α、p38γ)过表达(例如，如与相应 的正常细胞相比；例如，其中过表达是按1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)；或p38(例如p38α、 p38γ)的上游途径活化相关联。

增殖性病症：

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：卵巢癌；口腔鳞状细胞癌；多发性 骨髓瘤；骨髓肿瘤；或骨髓增生异常综合征。

其他病症：

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：炎症病症，其特征在于T-细胞增殖 (例如T-细胞活化和生长)。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：类风湿性关节炎；骨关节炎；银屑 病关节炎；莱特尔氏综合征；创伤性关节炎；风疹关节炎；急性滑膜炎；痛风性关节炎；或脊 柱炎。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：银屑病；湿疹；过敏性鼻炎；过敏性 结膜炎；哮喘；成人呼吸窘迫综合征；急性肺损伤(ALI)；急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；慢性 肺部炎症；慢性阻塞性肺病；全身性恶病质；血管球性肾炎；慢性心力衰竭；动脉粥样硬化； 急性冠脉综合征；心脏局部缺血；或心肌梗塞。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：内毒素血症；中毒性休克综合征； 炎症肠病；动脉粥样硬化；肠道易激综合征；克罗恩氏病；溃疡性结肠炎；骨再吸收疾病；骨 质疏松症；糖尿病；再灌注损伤；移植物抗宿主反应；同种异体移植物排斥；脓毒病；败血症 性休克；内毒素休克；革兰氏-阴性脓毒症；血管球性肾炎；再狭窄；或血栓形成。

在一个实施例中，所述治疗是疼痛的治疗。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：慢性疼痛；神经肌肉疼痛；头痛；癌 症疼痛；与骨关节炎或类风湿性关节炎相关的急性或慢性炎症疼痛；手术后炎症疼痛；神经 性疼痛；糖尿病性神经病；三叉神经痛；肝后神经痛；炎症神经病；偏头痛；腰骶神经根病；牙 痛；神经创伤；或神经局部贫血。

治疗的病症-通过抑制FGFR1而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症通过抑制 FGFR1而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)(例如增殖性病 症)，所述病症与FGFR1突变；FGFR1过表达(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表 达是按1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)；或FGFR1的上游途径活化相关联。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：乳腺癌；鳞状肺癌；胃癌；尿路上皮 癌；多发性骨髓瘤；8p11骨髓增生性综合征；或肝细胞癌。

治疗的病症-通过抑制VEGFR-2(KDR)而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症通过抑制 VEGFR-2(KDR)而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)(例如增殖性病 症)，所述病症与VEGFR-2突变；VEGFR-2过表达(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中 过表达是按1.5、2、3、5、10、20或50的倍数)；或VEGFR-2的上游途径活化相关联。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，一种疾病)，其特征在于 提高的VEGF生产(例如，通过癌细胞或间质细胞)。

增殖性病症：

在一个实施例中，所述治疗是治疗：胰腺癌；非小细胞肺癌(NSCLC)；卵巢肿瘤；腹 膜肿瘤；输卵管肿瘤；肺癌和相关胸腔积液；复发性或转移性鳞状细胞头颈癌；局部晚期鼻 咽癌；成胶质细胞瘤(例如多形性成胶质细胞瘤；巨细胞性成胶质细胞瘤)；神经胶质肉瘤； 弥漫性内在脑桥胶质瘤；HIV-相关的卡波西肉瘤；多发性骨髓瘤；肾细胞癌；转移性胃腺癌； 急性骨髓性白血病(AML)；肝细胞癌；皮肤纤维肉瘤；髓样甲状腺癌(MCT)；乳头状甲状腺癌； 滤泡状甲状腺癌；骨髓增生异常综合征；神经纤维瘤1型；丛状神经纤维瘤；脊髓神经纤维 瘤；乳腺癌；胆管肿瘤；宫颈癌；前列腺癌；黑色素瘤；膀胱癌；尿道癌；输尿管癌；肾癌；骨盆 癌；肉瘤；脂肪肉瘤；结直肠癌；骨肉瘤；滑膜癌；成神经细胞瘤；或横纹肌肉瘤。

其他病症：

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：动脉粥样硬化；肥胖症；神经性疼 痛综合征；年龄-相关性黄斑变性；糖尿病性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；或类风湿性关节 炎。

治疗的病症-通过抑制LCK而改善的病症

在一个实施例(例如，用于在疗法的方法中的用途的实施例、在制造药物中的用途 的实施例、治疗方法的实施例)中，所述治疗是病症(例如疾病)的治疗，所述病症通过抑制 LCK而改善。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：病症(例如，疾病)，所述病症与LCK突 变；LCK过表达(例如，如与相应的正常细胞相比；例如，其中过表达是按1.5、2、3、5、10、20或 50的倍数)；或LCK的上游途径活化相关联。

在一个实施例中，所述治疗是以下项的治疗：涉及免疫组件的免疫疾病或病理病 状。

在一个实施例中，所述治疗是以下各项的治疗：类风湿性关节炎；炎症肠病(例如 溃疡性结肠炎；克罗恩氏病)；银屑病；银屑病关节炎；组织或器官移植排斥(包括，例如，预 防)；急性或慢性移植物抗宿主病；同种异体移植排斥；异种移植排斥；过敏性哮喘；多发性 硬化症；1型糖尿病；肺纤维化；或皮肤超敏反应。

治疗

如在此在治疗一种病症的上下文中所使用的术语“治疗(treatment)”总体上涉及 人或动物(例如在兽医应用)的治疗，其中获得一些希望的治疗效果，例如，抑制病症的进 展，并且包括降低进展的速率、停止进展的速率、缓解病症的症状、改善病症、以及治疗病 症。也包括作为预防措施的治疗(即，预防)。例如，用于尚未发展出所述病症、但处于发展所 述病症风险的患者，被术语“治疗”涵盖。

例如，治疗包括癌症的预防、降低癌症发病率、缓解癌症症状等。

如在此所使用，术语“治疗有效量”涉及化合物，或者包括化合物的材料、组合物或 剂型，当根据所希望的治疗方案给药时，其对于产生一些所希望的治疗效果是有效的，与合 理的益处/风险比相称。

组合疗法

术语“治疗”包括组合治疗和疗法，其中两种或更多种治疗或疗法被例如顺序地或 同时地组合。例如，此处描述的化合物也可以在组合疗法中使用，例如与其他试剂结合使 用。治疗和疗法的实例包括化学疗法(给予活性剂，包括，例如，药物、抗体(例如，如在免疫 疗法中)、前药(例如，如在光动力学疗法、GDEPT、ADEPT等中)；手术；放射疗法；光动力学疗 法；基因疗法；以及受控饮食。

本发明的一个方面涉及如在此所描述的化合物，所述化合物与一种或多种(例如， 1、2、3、4种等)如下所述的另外的治疗剂组合。

具体的组合将在于医师的判断，所述医师将使用他的普通公知常识和熟练执业医 生已知的给药方案选择剂量。

这些药剂(即，在此描述的化合物加上一种或多种其他药剂)可以同时或顺序地给 予，并且可以按各个不同剂量方案和经由不同途径给予。例如，当顺序地给予时，这些药剂 可以在相近的时间间隔(例如，经5-10分钟的时间)或在更长间隔(例如，1、2、3、4或更多小 时间隔，或如果需要，甚至更长时间间隔)被给予，精确的给药方案与一种或多种治疗剂的 特性相称。

这些药剂(即，此处描述的化合物加上一种或多种其他药剂)可以被一起配制在单 一剂型中，或可替代地，单独的试剂可以被分别配制并以试剂盒形式一起呈递，任选地含有 它们的使用说明书。

可以共同给予/与用在此描述的TBAP化合物的治疗组合的另外的药剂/疗法的实 例包括以下：抗代谢物；烷基化剂；纺锤体毒剂；拓扑异构酶抑制剂；DNA结合剂；激酶抑制 剂；治疗性抗体；PARP抑制剂；NAD代谢抑制剂；代谢抑制剂；靶向制剂；内分泌剂；等。

其他用途

在此描述的TBAP化合物也可以用作细胞培养添加剂以抑制RAF(例如，BRAF、CRAF 等)。

在此描述的TBAP化合物也可以用作体外测定的部分，例如，以确定候选宿主是否 可能受益于用所讨论的化合物的治疗。

在此描述的TBAP化合物也可以例如在测定中被用作标准品，以便鉴定其他活性化 合物、其他RAF(例如，BRAF、CRAF等)抑制剂等。

试剂盒

本发明的一个方面涉及试剂盒，所述试剂盒包括：(a)如在此所描述的TBAP化合 物，或组合物，所述组合物包括如在此所描述的TBAP化合物，例如，优选地提供于合适的容 器中和/或具有合适的包装；以及(b)使用说明书，例如关于怎样给予化合物或组合物的书 面说明。

书面说明还可以包括活性成分对其是合适治疗的适应症列表。

给药途径

TBAP化合物或包括TBAP化合物的药物组合物可以通过任何便利的给药途径给予 至受试者，无论是全身性/外围性的还是局部(即，在所希望的作用部位)的给予。

给药途径的实例包括口服(例如通过摄取)；口腔；舌下；经皮(包括例如通过贴剂、 硬膏剂等)；经粘膜(包括例如通过贴剂、硬膏剂等)；鼻内(例如通过鼻腔喷雾剂)；眼睛(例 如通过滴眼剂)；肺(例如通过吸入或吹入疗法，例如使用经由气溶胶，例如通过口或鼻)；直 肠(例如通过栓剂或灌肠剂)；阴道(例如通过阴道栓剂)；肠胃外，例如通过注射，包括皮下、 真皮内、肌内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼眶内、腹膜内、气管内、 表皮下、关节内、蛛网膜下、以及胸骨内注射；通过植入药库(depot)或储库(reservoir)，例 如，皮下或肌内植入。

受试者/患者

受试者/患者可以脊索动物、脊椎动物、哺乳动物、有胎盘的哺乳动物、有袋动物 (例如袋鼠、袋熊)、啮齿类动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、兔形目 动物(例如兔子)、禽类(例如鸟)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如 马)、猪科动物(例如猪)、羊科动物(例如绵羊)、牛族动物(例如奶牛)、灵长类动物、猿类动 物(例如猴或猿)、猴(例如绒猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。

此外，受试者/患者可以是其任何发育形式，例如胎儿。

在一个优选实施例中，受试者/患者是人。

配制品

虽然单独给予TBAP化合物是可能的，但是优选将其作为药物配制品(例如组合物、 制剂、药物)来呈递，所述药物配制品包括至少一种如在此所描述的TBAP化合物连同一种或 多种本领域技术人员熟知的其他药学上可接受的成分，所述成分包括药学上可接受的载 体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面 活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。所述配制品可以进一步包括其他 活性剂，例如，其他治疗性或预防性药剂。

因此，本发明进一步提供了如以上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方 法，这些方法包括将至少一种如在此所描述的TBAP化合物连同一种或多种本领域技术人员 熟知的其他药学上可接受的成分如载体、稀释剂、赋形剂等混合。如果被配制成离散的单位 (例如片剂等)，则每个单位含有预定量(剂量)的化合物。

如在此所使用的，术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型 等，其在合理的医学判断范围之内适合用于与所讨论的受试者(例如人)的组织接触而没有 过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。每种载 体、稀释剂、赋形剂等在与所述配制品的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”。

适合的载体、稀释剂、赋形剂等可以发现于标准的制药学文本，例如雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)，第18版，马克出版公司(MackPublishing Company)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(Pa.)，1990；以及药物赋形剂手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)，第5版，2005中。

配制品可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。此类方法包括使化合物与构成 一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，配制品如下制备：通过使化合物与载体(如 液体载体、细分固体载体等)均匀和紧密地结合，并且然后如果需要的话，使产物成型。

所述配制品可以被制成提供快速或慢速释放；即时、延迟、定时或持续释放；或者 其组合。

配制品可以适合地是处于液体、溶液(例如水性、非水性)、混悬剂(例如水性、非水 性)、乳剂(例如水包油型、油包水型)、酏剂、糖浆剂、糖饵剂、漱口剂、滴剂、片剂(包括例如 包衣片剂)、颗粒剂、粉剂、锭剂(losenge)、软锭剂、胶囊剂(包括例如硬和软胶囊剂)、扁襄 剂、丸剂、安瓿剂、大丸剂、栓剂、阴道栓剂、酊剂、凝胶剂、糊剂、软膏剂、霜剂、洗剂、油剂、泡 沫剂、喷雾剂、烟雾剂或气雾剂的形式。

配制品可以适合地被提供为贴剂、橡皮膏、绷带、敷料等，其浸溃了一种或多种化 合物和任选的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括例如穿透、渗透和吸收增强剂。配 制品还可以适合地以药库或储库的形式提供。

所述化合物可以溶解于、混悬于一种或多种其他药学上可接受的成分中或者与之 混合。所述化合物可以呈递于脂质体或其他微粒中，其被设计为使所述化合物靶向于例如 血液组分或者一种或多种器官。

适合于口服给药(例如通过摄取)的配制品包括液体、溶液(例如水性、非-水性)、 混悬剂(例如水性、非水性)、乳剂(例如水包油型、油包水型)、酏剂、糖浆剂、糖饵剂、片剂、 颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿剂、大丸剂。

适合于口腔给药的配制品包括漱口剂、锭剂、软锭剂，以及贴剂、橡皮膏、药库和储 库。锭剂通常在经过矫味的基质中包括所述化合物，所述基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄 芪胶。软锭剂通常在惰性基质中包括所述化合物，所述基质例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿 拉伯胶。漱口剂通常在适合的液体载体中包括所述化合物。

适合于舌下给药的配制品包括片剂、锭剂、软锭剂、胶囊剂和丸剂。

适合于口腔经粘膜给药的配制品包括液体、溶液(例如水性、非水性)、混悬剂(例 如水性、非水性)、乳剂(例如水包油型、油包水型)、漱口剂、锭剂、软锭剂，以及贴剂、橡皮 膏、药库和储库。

适合于非口腔经粘膜给药的配制品包括液体、溶液(例如水性、非水性)、混悬剂 (例如水性、非水性)、乳剂(例如水包油型、油包水型)、栓剂、阴道栓剂、凝胶剂、糊剂、软膏 剂、霜剂、洗剂、油剂，以及贴剂、橡皮膏、药库和储库。

适合于经皮给药的配制品包括凝胶、糊剂、软膏剂、霜剂、洗剂和油剂，以及贴剂、 橡皮膏、绷带、敷料、药库和储库。

片剂可以任选地与一种或多种附加成分一起通过常规方法例如压制或模压来制 备。压制的片剂可以通过在适合的机器中将化合物任选地与一种或多种以下各项混合的自 由流动形式如粉末或颗粒进行压制来制备：粘合剂(例如聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、 黄芪胶、羟丙基甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂 (例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅)；崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基 纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)；防腐剂(例如对-羟基苯甲 酸甲酯、对-羟基苯甲酸丙醋、山梨酸)；矫味剂、增味剂和甜味剂。模制片剂可以通过在适合 的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行模制来制备。片剂可以任选 地被包衣或刻痕并且可以被配制为提供缓慢或控制释放的所述化合物，其中例如使用处于 不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所希望的释放特性。片剂可以任选地提供有包衣例如 以影响释放，例如肠溶包衣，以提供在肠部而不是在胃部释放。

软膏剂通常由所述化合物和石蜡或水可混溶的软膏基质制备。

霜剂通常由所述化合物和水包油型霜剂基质制备。如果希望的话，膏基的水相可 以包括，例如，至少大约30％w/w的一种多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，如丙二醇、 1,3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。这些局部配制品可以希望地包 括增强化合物穿过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。此类经皮渗透增强剂的 实例包括二甲亚砜和相关类似物。

乳剂通常由所述化合物和油相制备，油相可以任选地仅包括乳化剂(或者称为利 泄剂(emulgent))，或者它可以包括至少一种乳化剂与脂肪或油或者脂肪或油二者的混合 物。优选地，亲水乳化剂与亲脂的乳化剂一起被包括，后者充当稳定剂。它还优选地包括油 和脂肪二者。具有或不具有一种或多种稳定剂的一种或多种乳化剂一起组成了所谓的乳化 蜡，并且所述蜡与所述油和/或脂肪一起组成了所谓的乳化软膏基质，所述乳化软膏基质形 成了乳膏配制品的油性分散相。

适合的利泄剂和乳化稳定剂包括吐温60、司盘80、十八十六醇、肉豆蔻醇、单硬脂 酸甘油酯以及月桂基硫酸钠。用于所述配制品的适合的油或脂肪的选择是基于实现希望的 化妆品特性，因为所述化合物在大多数可能用于药物乳剂配制品的油中的溶解度可能非常 低。因此，所述乳膏应当优选地是非油腻、非-染色且可洗涤的产品，所述产品具有适合的稠 度以避免从管子或其他容器中泄漏。可以使用直链或支链、单-或二元烷基酯，如二-异己二 酸酯、异鲸蜡醇硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异 丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或被称作CrodamolCAP的支链酯的共混物，后三者是 优选的酯。这些酯可以单独或组合使用，这取决于所需要的特性。可替代地，可以使用高熔 点脂类，例如白软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。

其中载体是液体的、适合于鼻内给药的配制品包括例如鼻喷雾剂、滴鼻剂，或者通 过雾化器由气雾剂给予，包括所述化合物的水性或油性溶液。

其中载体是固体的、适合于鼻内给药的配制品包括例如以具有粒度为例如约20至 约500微米的粗粉末呈递的那些配制品，所述粗粉以采取鼻吸方式给予，即，通过将粉剂的 容器靠近鼻而通过鼻腔迅速吸入。

适合于肺给药(例如通过吸入或吹入疗法)的配制品包括使用适合的推进剂从加 压包装中以喷雾剂呈递的那些配制品，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四 氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。

适合于眼部给药的配制品包括滴眼液，其中所述化合物被溶解或悬浮于适合的载 体中，尤其是用于所述化合物的水性溶剂。

适合于直肠给药的配制品可以作为具有适合基质的栓剂来呈递，所述基质包括例 如天然或硬化的油、蜡类、脂肪、半液体或液体多元醇，例如可可脂或水杨酸；或者作为用于 灌肠治疗的溶液或混悬剂。

适合于阴道给药的配制品可以作为阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或 喷雾配制品呈递，其除了所述化合物之外还含有例如本领域已知的适当的载体。

适合于肠胃外给药(例如通过注射)的配制品包括水性或非水性的、等渗的、无热 原的无菌液体(例如溶液、混悬剂)，其中所述化合物被溶解、混悬或以其他方式提供(例如 在脂质体或其他微粒中)。此类液体可以另外含有其他药学上可接受的成分，例如抗氧化 剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂和使配制品与预期受体的血液(或其他 相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油以及类似物。适 合用于此类配制品中的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)、或乳酸林格氏注射液(LactatedRinger'sInjection)。通常，所述化合物在液 体中的浓度为从约1ng/mL至约10μg/mL，例如从约10ng/mL至约1μg/mL。可以使配制品呈递 于单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储 存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体例如注射用水。可以由无菌粉剂、颗粒剂以及 片剂制备即用型注射溶液和混悬液。

剂量

本领域技术人员应当理解，TBAP化合物和包括TBAP化合物的组合物的适当剂量可 以因患者而异。确定最佳剂量通常将涉及治疗益处水平与任何危险或有害的副作用之间的 平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括具体TBAP化合物的活性、给药途径、给药 时间、TBAP化合物的排泄率、治疗的持续时间；组合使用的其他药物、化合物和/或材料；病 症的严重程度以及患者的种属、性别、年龄、体重、病状、一股健康状况和既往医疗史。TBAP 化合物的量和给药途径最终将在于医师、兽医或临床医师的判断，但通常所述剂量被选择 为达到在作用部位获得所希望的效果而不引起实质性有害或有毒的副作用的局部浓度。

在整个治疗过程中，可以以一种剂量连续地或间断地(例如以适当间隔的分次剂 量)实现给药。确定最有效的给药方式和给药剂量的方法为本领域技术人员所熟知的并且 将随着治疗所用的配制品、治疗目的、所治疗的一种或多种靶细胞以及所治疗的受试者而 改变。单次或多次给药可以按治疗医师、兽医或临床医师所选择的剂量水平和模式来进行。

通常，TBAP化合物的适合的剂量范围为每日约10μg至约250mg(更通常约100μg至 约25mg)/公斤患者体重。当所述化合物为盐、酯、酰胺、前药等时，所给予的量是根据母体化 合物进行计算，并且因此按比例地增加所用的实际重量。

化学合成

所有的起始材料、试剂和反应溶剂都是试剂等级并且如所购买而使用。色谱溶剂 是HPLC等级并且在未经进一步纯化而使用。使用默克(Merck)硅胶60F-254薄层板通过薄层 色谱(TLC)分析来监测反应。在默克硅胶60(0.015-0.040mm)上或在一次性IsoluteFlash Si和SiII硅胶柱中进行快速柱色谱法。在来自Supelco具有Discovery5μm、C18、50mmx 4.6mm直径柱的MicromassLCT/Water’sAlliance2795HPLC系统上在22℃温度下使用以 下溶剂系统进行LCMS分析：溶剂A：甲醇；溶剂B：在水中的0.1％甲酸，以1mL/min的流速。梯 度：从0-0.5分钟用10％A/90％B(按体积计)起始，然后从0.5分钟至6.5分钟为10％A/90％B 至90％A/10％B，并且继续在90％A/10％B直至10分钟。从10-10.5分钟，梯度恢复至10％A/ 90％，其中保持浓度直至12分钟。UV检测是在254nm处并且离子化是阳或阴离子电喷雾。分 子量扫描范围是50-1000。样品被供应为1mg/mL于DMSO或甲醇中，以部分回路装填方式注射 3μL。在DMSO-d₆中在布鲁克(Bruker)Advance500MHz光谱仪上记录NMR谱。

部分(I)：吡唑甲酸酯的N-芳基化

方法A：在搅拌下添加3-叔丁基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1当量)、所希望的硼酸(2当 量)、乙酸铜(II)(1.5当量)和干DMF，以给出蓝色溶液。添加干吡啶(2当量)，一经添加，所述 颜色变为绿色，随后添加一匙经烘箱干燥的、粉末状(0.4nm)分子筛。将混合物在室温 下在氩气气氛下搅拌直至反应完成，如通过LC-MS验证。在反应完成之后，将混合物用AcOEt 和NH₄Cl溶液稀释。将有机相分离，用NH₄Cl溶液、饱和水性NaHCO₃洗涤，干燥(含Cu捕获(Cu- catch)树脂的MgSO₄)，过滤，并蒸发，以给出油状物质，在一些情况下将其通过柱色谱法进 一步纯化。

合成1

3-叔丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯

使用方法A，用3-叔丁基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(320mg，1.631mmol)和3-甲氧基苯 基硼酸(307mg，2.020mmol)。在室温下搅拌22小时后，完成所述反应。在处理后，将生成的黄 色油溶解于DCM/己烷中并且装载到50gSNAP柱上，将其用于己烷中的2％→20％EtOAc(按 体积计)进行洗脱。获得呈无色油的标题化合物。

产量：462mg(94％,92％纯度)。¹H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.17(t,3H,³J_HH＝ 7.1,CH₃),1.30(s,9H,tert-Bu),3.79(s,3H,OCH₃),4.17(q,2H,³J_HH＝7.1,OCH₂CH₃),6.98 (m,4H,ArH),7.36(t,1H,³J_HH＝8.1,ArH)。LC-MS(2.79min):C₁₇H₂₂N₂O₃[M+H]⁺的m/z计算值: 303.1；发现值：303.2。

合成2

3-叔丁基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯

使用方法A，用3-叔丁基吡唑-5-甲酸乙酯(320mg，1.60mmol)、和3-三氟甲基苯基 硼酸(307mg，1.60mmol)。在20小时之后，将所述反应混合物用AcOEt(20mL)稀释，用2x20mL 水、NaHCO₃(20mL，浓)洗涤并最终用20mL盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发至干燥，以 给出油(417mg)。将所述化合物不经进一步纯化而用于随后的水解步骤。

合成3

3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯

使用方法A，用3-叔丁基吡唑-5-甲酸乙酯(320mg，1.60mmol)、和3-甲基苯基硼酸 (218mg，1.60mmol)。在20小时之后，将所述反应混合物用AcOEt(20mL)稀释，用2x20mL水、 NaHCO₃(20mL；浓)洗涤并最终用20mL盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发至干燥，以给出 油(466mg)。将所述化合物不经进一步纯化而用于随后的水解步骤。

合成4

3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯

使用方法A，用3-叔丁基吡唑-5-甲酸乙酯(320mg，1.60mmol)、和3-氟苯基硼酸 (224mg，1.60mmol)。在20小时之后，将所述反应混合物用AcOEt(20mL)稀释，用2x20mL水、 NaHCO₃(20mL；浓)洗涤并最终用20mL盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发至干燥，以给出 油(463mg)。将所述化合物不经进一步纯化而用于随后的水解步骤。

合成5

3-叔丁基-1-(2-甲氧基吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯

使用方法A，用3-叔丁基吡唑-5-甲酸乙酯(202mg，1.03mmol)、和2-甲氧基吡啶-4- 基硼酸(208mg，1.360mmol)。用于己烷中的2％→50％(按体积计)EtOAc进行纯化，给出呈无 色油的标题化合物。

产量：243mg(59％)。¹H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.22(t,3H,³J_HH＝7.1,CH₃), 1.29(s,9H,tert-Bu),3.90(s,3H,OCH₃),4.23(q,2H,³J_HH＝7.1,OCH₂CH₃),6.94(d,1H,³J_HH＝ 1.7,PyrH),7.07(s,1H,ArH),7.13(dd,1H,³J_HH＝5.6,1.7,PyrH),8.23(d,1H,³J_HH＝5.6, PyrH)。LC-MS(2.83min):C₁₆H₂₁N₃O₃[M+H]⁺的m/z计算值:304.1；发现值：303.1。

部分(II)：乙酯水解

方法B.将适当的1-取代的3-叔丁基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1当量)溶解于THF/ MeOH/H₂O的4:1:1混合物中，添加氢氧化锂一水合物(1.1当量)并且将所述无色混合物在室 温下搅拌16小时。将挥发物随后蒸发，并且将生成的固体再溶解于H₂O中并且将溶液的pH用 10％水性HCl调节至1。将生成的乳状混合物用EtOAc萃取两次，并且将合并的有机部分用盐 水洗涤，干燥并浓缩至干燥，以给出白色结晶固体。

方法C.将适当的1-取代的3-叔丁基吡唑-5-甲酸乙酯(1当量)在10mLEtOH和3mL NaOH溶液(2M)中回流持续30分钟。在冷却至室温之后，将所述反应混合物中和至pH4.0 (AcOH)，用20mL水稀释，并用AcOEt萃取。将有机层用2x20mL水洗涤，干燥(MgSO₄)，并且蒸 发至干燥，并且将因此获得的残余物使用BiotageIsolera系统进行纯化。

合成6

3-叔丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸

使用方法B，用3-叔丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(442mg， 1.345mmol)，产生呈白色晶体的标题化合物。

产量：300mg(81％)。¹H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.29(s,9H,tert-Bu),3.78 (s,3H,OCH₃),6.90(s,1H,ArH),6.97(m,4H,ArH),7.35(t,1H,³J_HH＝8.1,ArH),13.14(s,1H, COOH)。LC-MS(2.51min):C₁₅H₁₈N₂O₃[M+H]⁺的m/z计算值:275.1；发现值：275.0。

合成7

3-叔丁基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸

使用方法C，用粗3-叔丁基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(471mg)， 获得固体产物，将其使用BiotageIsolera1系统和环己烷:EtOAc1:1混合物作为洗脱液(等 度模式)经受进一步纯化并给出所述标题化合物。

产量：133mg(经2步骤为26.6％)。¹HNMR(DMSO),_H(ppm),J(Hz):1.31(s,9H, (CH₃)₃C),6.99(s,1H,Pyr-H),7.70(t,1H,Arom-H₅,J＝7.7Hz),7.76-7.82(m,3H,Arom- H₂₊₄₊₆),13.32(s,1H,Pyr-CO₂H)。Ac.质量：(C₁₅H₁₆F₃N₂O₂)计算值313.1157，发现值313.1155。

合成8

3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸

使用方法C，用粗3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(460mg)，在使 用BiotageIsolera1系统和环己烷:EtOAc1:1混合物作为洗脱液(等度模式)进行纯化之 后获得所述标题产物。

产量：101mg(经2步骤为24.％)。¹HNMR(DMSO),_H(ppm),J(Hz):1.29(s,9H,(CH₃) ₃C),2.35(s,3H,3-CH₃),6.89(s,1H,Pyr-H),7.18(d,1H,Arom-H₂,J＝7.2Hz),7.20-7.24(m, 2H,Arom-H₄₊₆),7.32(t,1H,Arom-H₅,J＝7.3Hz),13.09(s,1H,Pyr-CO₂H)。Ac.质量： (C₁₅H₁₈N₂O₂)计算值258.1368，发现值258.1373。

合成9

3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-甲酸

使用方法C，用粗3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(463mg)，获得所 述标题化合物。参见例如施普林格(Springer)等人，2011。

产量166mg(经2步骤为39.6％)。¹HNMR(DMSO),_H(ppm),J(Hz):1.29(s,9H,(CH₃) ₃C),6.95(s,1H,Pyr-H),7.23-7.30(m,2H,Arom-H₄₊5),7.35(d,1H,Arom-H₂,J＝9.8Hz), 7.44-7.53(m,1H,Arom-H₆),13.24(s,1H,Pyr-CO₂H)。Ac.质量：(C₁₄H₁₅FN₂O₂)计算值 262.1118，发现值262.1117。

合成10

3-叔丁基-1-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-甲酸盐酸盐

方法D：将3-叔丁基-1-(2-甲氧基吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(110mg， 0.363mmol)溶解于在H₂O中的6MHCl(4.5mL，27.00mmol)中，并且将无色溶液加热至90℃持 续48h。将所有挥发物随后蒸发，并且将生成的无色油与DCM(10mL)共蒸发，然后与Et₂O (10mL)共蒸发，这给出呈白色固体的标题化合物。

产量：93mg(98％)。1H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.28(s,9H,tert-Bu),6.32 (d,1H,J＝1.9,ArH),6.37(dd,1H,J＝7.1,1.9,ArH),6.99(s,1H,ArH),7.46(d,1H,J＝7.1, ArH)。LC-MS(2.14min):C₁₃H₁₆N₃O₃[M-Cl]⁺的m/z计算值：262.1；发现值：262.0；

部分(III)：5-氨基吡唑的形成

合成11

3-(叔丁基)-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-胺

方法E：将4,4-二甲基-3-氧代戊腈(77g，0.62mol)和3-氟苯基肼盐酸盐(100g， 0.62mol)的混合物添加至甲苯(1L)中并且加热至100℃持续24小时，在此点之后，允许将所 述反应冷却至20℃。将所述混合物过滤，用甲苯(2x250mL)洗涤并吸干。将粗HCl盐与先前 批次(使用180g的3-氟苯基肼盐酸盐和234g的3-氟苯基肼盐酸盐进行的)合并，并且在DCM (4L)与饱和水性NaHCO₃(4L)之间分配。搅拌所述混合物直至没有固体剩余。将DCM层分离 出，干燥(MgSO₄)，过滤并在真空中浓缩，以按52％产率提供呈橙色固体的标题化合物 (210g)。通过NMR纯度>95％(在摩尔基础上)，并且通过LCMS纯度94.4％(在摩尔基础上)。

部分(IV)：5-氨基吡唑氨基甲酸酯的形成

合成12

N-[3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]氨基甲酸苯酯

方法F：在0℃下，将3-(叔丁基)-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-胺(210g，0.90mol)溶 解于THF(5L)，之后添加吡啶(146mL，1.80mol)。在0-5℃下经30分钟逐滴添加于THF(300mL) 中的氯甲酸苯酯(113mL，0.90mol)。将所述反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并且然后允许 加温至室温。4小时后，HPLC显示阶段1的8％剩余。添加更多的氯甲酸苯酯(11mL，0.088mol) 并且在30分钟之后，HPLC分析指示所述反应完成。添加EtOAc(5L)并且将有机层用1MHCl (2x1.2L)、水(1.2L)、饱和水性NaHCO₃(1.2L)和饱和盐水(1.2L)洗涤。将有机相层干燥 (MgSO₄)，过滤，并在真空中浓缩。将粗油吸收在EtOAc/庚烷的1:3混合物中并在真空中浓 缩，以给出一种固体。所述固体在庚烷(2.5L)中浆化1小时，过滤，并且用庚烷(200mL)洗涤。 将材料在40℃下过夜干燥，以按90％产率给出所述标题化合物(286g)。纯度通过NMR为> 95％。

部分(V)：芳基吡唑和4-氨基苯氧基-吡啶并吡嗪酮片段的偶联，形成脲接头

合成13

1-[3-叔丁基-1-[(3-氟-苯基)-1H-吡唑-5-基]3-[2-氟-4(3-氧代-3,4-二氢吡啶 并[2,3-b]吡嗪-8-基氧基)苯基]脲(TBAP-001)

方法G：在Carousel管中，将81mg(0.31mmol)3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-吡唑-5-甲 酸在搅拌和惰性气氛下溶解于2mLDMF中。然后添加0.044mL(0.32mmol)三乙胺和0.067mL (0.032mmol)DPPA，并且在0℃下继续搅拌30分钟并在室温下持续另外的1小时。向此反应混 合物中，立刻添加4-(3-氟-4-氨基苯基)-吡啶-[2,3-b]-吡嗪-2-酮(40mg，0.15mmol)(参见 例如赞邦(Zambon)等人，2010)，并且将具有反应混合物的管在100℃下在搅拌和氩气气氛 下加热30分钟。在室温下冷却后，将所述溶液用10mLAcOEt稀释。将有机层用2x10mL盐水 洗涤，干燥(MgSO₄)，并且蒸发至干燥。将因此获得的残余物与Et₂O研磨并且过滤，以给出呈 淡棕色无定形固体的标题化合物。

产量：66mg(83.0％)。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:1.29(s,9H,t-Bu),6.41(s,1H, H_吡唑),6.64(d,1H,H_Pyr,J＝5.6Hz),7.02-7.07(m,1H,H_Arom中心),7.22-7.30(m,2H,H_Arom吡唑), 7.40-7.44(m,2H,H_Arom中心+H_Arom吡唑),7.53-7.60(m,1H,H_Arom吡唑),8.14(t,1H,H_Arom中心,J＝ 9.1Hz),8.17(s,1H,H_吡嗪酮),8.36(d,1H,H_pyr,J＝5.6Hz),8.87(s,1H,NH_脲),8.98(s,1H,NH_脲), 12.90(s,1H,NH)。LC-MS,t_R＝2.61min,m/z:531.2(M)⁺,C₂₇H₂₃F₂N₇O₃的计算值。HRMS: C₂₇H₂₃F₂N₇O₃的(M)⁺计算值为531.1830，发现值：531.1832。

方法H：向4-(3-氟-4-氨基苯基)-吡啶-[2,3-b]-吡嗪-2-酮(169.5g，0.623mol)中 加入N-[3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]氨基甲酸苯酯(220g，0.623mol)和DMSO (1.7L)。将所述反应混合物在20℃-22℃下搅拌过夜。¹HNMR指示所述反应完成。将所述反 应淬灭入水(8.6L)中并且搅拌1小时，之后过滤并用水(2x2L)洗涤。将材料在60℃下干燥 过周末。将固体在EtOAc(3.39L)中浆化1小时，过滤，并且用EtOAc(750mL)洗涤，以给出320g 的所述标题化合物。NMR指示苯酚仍然存在。将材料在EtOAc(3.2L)中再浆化1小时，过滤，并 且用EtOAc(500mL)洗涤并干燥，以给出293g的所述标题化合物(通过NMR按重量计9％ EtOAc，按重量计一种单一杂质0.8％)。将固体从THF(5.7L)和庚烷(2.85L)中再结晶，允许 所述批次冷却至室温，之后过滤掉固体。将滤饼用庚烷(2.85L)洗涤并且在45℃下干燥过 夜，以给出221g的所述标题化合物。HPLC分析显示先前在0.8％的杂质(按重量计)被降低至 0.23％(按重量计)；然而，脲杂质被浓缩至0.58％(按重量计)。¹HNMR显示5％庚烷(按重量 计)。将材料在110℃下干燥12小时，以使庚烷水平通过NMR达到<0.5％(按重量计)，以64％ 产率给出总计211g的呈白色晶体固体的标题化合物。HPLC纯度98.8％(按重量计)，一种单 一杂质0.58％(按重量计)。

合成14

1-[3-叔丁基-1-[(3-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基]3-[2-氟-4(3-氧代-3,4-二氢吡 啶并[2,3-b]吡嗪-8-基氧基)苯基]脲(TBAP-002)

使用方法G，用3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸(80mg，0.31mmol)和4- (3-氟-4-氨基苯基)-吡啶-[2,3-b]-吡嗪-2-酮(40mg，0.15mmol)，获得呈灰白色固体的所 述标题化合物。

产量：69mg(87.4％)。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:1.28(s,9H,t-Bu),2.40(s,3H,3- CH₃),6.39(s,1H,H_吡唑),6.64(d,1H,H_Pyr,J＝5.6Hz),7.02-7.06(m,1H,H_Arom中心),7.22-7.36 (m,4H,3H_Arom吡唑+1H_Arom中心),7.43(t,1H,H_Arom吡唑,J＝7.7Hz),8.16(t,1H,H_Arom中心,J＝9.1Hz), 8.17(s,1H,H_吡嗪酮),8.36(d,1H,H_pyr,J＝5.6Hz),8.81(s,1H,NH_脲),8.98(s,1H,NH_脲),12.90 (s,1H,NH)。LC-MS,t_R＝2.65min,m/z:527.2(M)⁺,C₂₈H₂₆FN₇O₃的计算值。HRMS:C₂₈H₂₆FN₇O₃的(M +H)⁺计算值为527.2081，发现值：527.2088。

合成15

1-[3-叔丁基-1-[(3-三氟甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基]3-[2-氟-4(3-氧代-3,4-二 氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-8-基氧基)苯基]脲(TBAP-003)

使用方法G，用3-叔丁基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸(97mg，0.31mmol) 和4-(3-氟-4-氨基苯基)-吡啶-[2,3-b]-吡嗪-2-酮(40mg，0.15mmol)，获得呈灰白色固体 的所述标题化合物。

产量：70mg(80.4％)。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:1.30(s,9H,t-Bu),6.42(s,1H, H_吡唑),6.64(d,1H,H_Pyr,J＝5.6Hz),7.02-7.06(m,1H,H_Arom中心),7.27-7.36(m,1H,H_Arom中心), 7.74-7.80(m,2H,H_Arom吡唑),7.86-7.90(m,2H,H_Arom吡唑),8.05(t,1H,H_Arom中心,J＝9.1Hz),8.17 (s,1H,H_吡嗪酮),8.36(d,1H,H_pyr,J＝5.6Hz),8.87(s,1H,NH_脲),8.93(s,1H,NH_脲),12.90(s,1H, NH)。LC-MS,t_R＝2.71min,m/z:581.2(M)⁺,C₂₈H₂₃F₄N₇O₃的计算值。HRMS:C₂₈H₂₃F₄N₇O₃的(M+H)⁺计算值为581.1798，发现值：581.1796。

合成16

1-(3-叔丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(2-氟-4-(3-氧代-3,4-二氢 吡啶并[3,2-b]吡嗪-8-基氧基)苯基)脲(TBAP-004)

使用方法G，用3-叔丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酸(60mg，0.22mmol)和 8-(4-氨基-3-氟苯氧基)-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3(4H)-酮(31.6mg，0.12mmol)，获得呈淡黄 色固体的所述标题化合物。

产量：50mg(84％)。¹H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.29(s,9H,tert-Bu),3.83 (s,3H,OCH₃),6.41(s,1H,PyzH),6.66(d,³J_HH＝5.7,1H,PyrH),7.01-7.12(m,4H,ArH),7.31 (m,1H,ArH),7.46(t,³J_HH＝8.1,1H,ArH),8.18(m,2H,ArH),8.38(d,³J_HH＝5.7,1H,PyrH), 8.85(brs,1H,NH),9.03(brs,1H,NH),12.92(brs,1H,NH)；_-¹⁹F-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm):- 124.8。LC-MS(2.59min):C₂₈H₂₇FN₇O₄[M+H]⁺的m/z计算值：544.1；发现值：544.1。HRMS (3.19min):C₂₈H₂₇FN₇O₄[M+H]⁺的m/z计算值：544.21031；发现值：544.21029。

合成17

1-(3-叔丁基-1-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-(2-氟-4-(3- 氧代-3,4-二氢吡啶并[3,2-b]吡嗪-8-基氧基)苯基)脲(TBAP-005)

使用方法G，用3-叔丁基-1-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-甲酸盐酸 盐(70.8mg，0.238mmol)和8-(4-氨基-3-氟苯氧基)-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3(4H)-酮 (32.4mg，0.119mmol)，获得固体，将其通过硅胶柱色谱、用5％→30％(按体积计)于DCM中的 MeOH洗脱来纯化，以给出呈白色固体的所述标题化合物。

产量：15mg(24％)。¹H-NMR(DMSO-d₆),δ(ppm),J(Hz):1.28(s,9H,tert-Bu),6.43 (s,1H,PyzH),6.50(d,³J_HH＝2.2,1H,ArH),6.58(dd,³J_HH＝7.2,2.2,1H,ArH),6.66(d,³J_HH＝ 5.6,1H,PyrH),7.06(m,1H,ArH),7.32(m,1H,ArH),7.50(d,³J_HH＝7.2,1H,ArH),8.13(m,1H, ArH),8.18(m,1H,ArH),8.37(d,³J_HH＝5.6,1H,PyrH),9.05(brs,1H,NH),9.13(s,1H,NH), 11.66(brs,1H,NH),12.90(brs,1H,NH)。LC-MS(2.36min):C₂₆H₂₄FN₈O₄的m/z计算值[M+H ]⁺:531.1；发现值：531.2。HRMS(2.97min):C₂₆H₂₄FN₈O₄[M+H]⁺的m/z计算值：531.18991；发现 值：531.18952。

生物学方法和数据

DELFIA激酶测定

在根据以下方案进行的激酶测定中评估化合物。

^V600EBRAF制备：

通过用杆状病毒(含有具有N-末端组氨酸标签的全长人BRAF)感染在SF-900II培 养基(英杰公司(Invitrogen)，佩斯里(Paisley)，苏格兰)中培养的SF9昆虫细胞来产生 ^V600EBRAF，并且通过镍-琼脂糖亲和色谱进行纯化。

GST-MEK制备：

用在N-末端的GST标签和C-末端组氨酸标签在大肠杆菌JM109细菌中表达全长兔 MEK1蛋白，并且通过镍-琼脂糖亲和色谱纯化。

^V600EBRAF和GST-MEK的纯化：

程序：

1.在再悬浮缓冲液(1mL/10mL的SF9培养物或JM109培养物，分别用于BRAF或MEK) 中裂解细胞，声处理1-2分钟并且以14,000rpm(在2mL管中)旋降10分钟。

2.取1.5mL的镍-琼脂糖‘珠粒’/10mL的裂解物并且添加至柱(伯乐公司(Bio- rad))。

3.用再悬浮缓冲液洗涤柱3次。

4.添加裂解物至柱。

5.用10mL洗涤缓冲液洗涤3次。

6.添加10mL的洗脱缓冲液至这些珠粒并且收集于2mL管中。

7.检查洗脱的蛋白质浓度并且在4℃下在透析缓冲液中透析过夜。

缓冲液：

透析缓冲液(混合并且储存在冷藏室中)：

DELFIA激酶缓冲液(DKB)：

MOPS＝3-[N-吗啉代]丙磺酸(西格玛(Sigma)M3183)。

EGTA＝乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(西格玛(Sigma)E3889)。

DKB1(具有BRAF和MEK蛋白的DKB)：

合并4950μL的DKB和50μL的2.5mg/mLGST-MEK储备液，如上所描述获得的(以给出 1mg的MEK/40μL)。然后添加22.5μL的如上所描述获得的BRAF储备液，以给出约0.2μL的 BRAF/40μL。

DKB2(具有MEK蛋白的DKB)：

合并4950μL的DKB和50μL的2.5mg/mLGST-MEK储备液(以给出1mg的MEK/40μL)。使 用500μL的这种溶液用作吹出(BO)和空载体(EV)对照。

ATP：

将于蒸馏水中的100mMATP储备液稀释至500μM，以给出测定中的100μM终浓度。

抑制剂(测试化合物)：

将100mM储备液在药物板中用DMSO稀释至10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、 0.001、0.0003和0.0001mM，得到测定中的浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、 0.003和0.001μM。

第一抗体：

将磷酸-MEK1/2CST#9121S用DELFIA测定缓冲液(AB)1:1000稀释。在使用前，在室 温下在AB中预孵育抗体30分钟。

第二抗体：

将抗-兔-Eur标记的第二珀金埃尔默(PerkinElmer)#AD0105用DELFIA测定缓冲 液(AB)1:1000稀释。在使用前，在室温下在AB中预孵育抗体30分钟。(将第一抗体和第二抗 体一起孵育。)

吐温：

于水中的0.1％吐温20。

测定缓冲液：

DELFIA测定缓冲液珀金埃尔默(PerkinElmer)#4002-0010。

增强溶液：

DELFIA增强溶液珀金埃尔默(PerkinElmer)#4001-0010。

测定板：

96孔谷胱甘肽-包被的黑色板普达(Perbio)#15340。

程序：

1.用于TBS中的5％牛奶预封闭各孔持续1小时。

2.用200μLTBS洗涤各孔3次。

3.对于所有抑制剂(测试化合物)，涂板出40μL的DKB1，DMSO对照，并且任选地其他 对照化合物。

4.对于BO和EV孔，涂板出40μL的DKB2。

5.根据希望的板安排，以0.5μL/孔添加抑制剂(测试化合物)。

6.添加0.5μLDMSO至运载体对照孔。

7.添加2μL的BRAF至BO和EV孔。

8.在室温下与测试化合物预孵育10分钟，伴随着振摇。

9.添加10μL的500μMATP在DKB中的储备液，以给出100μM测定浓度。

10.用TopSeal密封各板，并在室温下伴随着振摇孵育45分钟。

11.用200μL0.1％吐温20/水洗涤板3次，以终止反应。

12.添加50μL/孔的抗体混合物并且在室温下伴随着振摇孵育1小时。

13.用200μL0.1％吐温20/水洗涤板3次。

14.添加100μLDELFIA增强溶液/孔，用箔覆盖，并在室温下伴随着振摇孵育30分 钟。

15.使用铕方案在维克多(Victor)酶标仪(珀金埃尔默，图尔库，芬兰)上读数。

从所有值中减去空白(空载体)的值。DMSO对照设定为100％活性并且测定点(响 应)计算为DMSO对照的百分比。将数据使用GraphpadPrism软件进行标绘并且使用可变斜 率S型剂量-响应方程计算非线性回归线：

Y＝底部+[顶部-底部]/[1+10^((LogEC50-X)*希尔斜率)]

其中X为浓度的对数并且Y是响应。通过这一程序产生的IC₅₀是产生在饱和与零-效 应平台之间的百分比对照荧光中间值的药物浓度。通常进行三次独立测定，并且报道IC₅₀的 均值。

数据总结于下表中。

基于细胞的磷酸化ERK测定(突变体BRAFWM266.4细胞)

使用根据以下方案进行的基于细胞的测定来评估化合物。

第0天：

在96-孔板中涂板出16,000个突变体BRAFWM266.4细胞/孔于99μL培养基中。

第1天：

1.添加1μL测试化合物至细胞中(总1μL溶液)。

2.将细胞与测试化合物在37℃下孵育6小时。

3.从所有孔中吸去溶液。

4.用100μL4％甲醛/0.25％曲通X-100PBS/孔固定细胞。

5.在4℃下孵育所述板1小时。

6.吸去固定溶液并且添加300μLTBS/孔。

7.放置所述板在4℃下过夜。

第2天：

1.用200μLPBS/孔洗涤所述板2次。

2.用100μL于TBS中的5％奶粉进行封闭。

3.在37℃下孵育所述板20分钟。

4.用0.1％吐温/H₂O洗涤所述板2次。

5.向每孔添加50μL的稀释于5％奶粉/TBS中的3μg/mL第一抗体pERK(西格玛 M8159)。

6.在37℃下孵育所述板2小时。

7.用0.1％吐温/H₂O洗涤所述板2次。

8.向每孔添加50μL的0.45μg/mL第二铕-标记的抗小鼠抗体(珀金埃尔默公司)。

9.在37℃下孵育所述板1小时。

10.用0.1％吐温/H₂O洗涤所述板2次。

11.向每孔添加100μL增强溶液(珀金埃尔默公司)。

12.在室温下放置板约10分钟，然后轻微振摇所述板。

13.在维克多2(Victor2)酶标仪(珀金埃尔默，图尔库，芬兰)中读取铕时间分辨荧 光值。

14.用0.1％吐温/H₂O洗涤所述板2次。

15.通过添加200μL的溶液/孔，用二喹啉甲酸测定(BCA，西格玛公司)测量蛋白质 浓度。

16.在37℃下孵育所述板30分钟。

17.在酶标仪中读取在570nm处的吸光度水平。

注意，用计数值除以吸光度从而使铕计数值针对蛋白质水平归一化。

从所有值中减去空白(无细胞)的数值。DMSO对照设定为100％活性并且测定点(响 应)计算为DMSO对照的百分比。将数据使用GraphpadPrism软件进行标绘并且使用可变斜 率S型剂量-响应方程计算非线性回归线：

Y＝底部+[顶部-底部]/[1+10^((LogEC50-X)*希尔斜率)]

其中X为浓度的对数并且Y是应答。通过这一程序产生的IC₅₀是产生在饱和与零-效 应平台之间的百分比对照荧光中间值的药物浓度。通常进行三次独立测定，并且报道IC₅₀的 均值。

数据总结于下表中。

SRB细胞增殖测定(SRBGI₅₀)

在37℃下，在10％CO₂水-饱和大气中，将细胞系常规培养于补充有10％胎牛血清 的DMEM或RPMI1640中。通过在汇合之前进行传代-培养(3-5天间隔)，将培养物维持在指数 生长期。收获具有5mL市售胰蛋白酶EDTA的80cm²组织培养瓶来制备单细胞悬浮液。5分钟 后，将脱离的细胞与5mL完全补充的培养基混合并离心沉淀(1000rpm持续7分钟)。吸去上清 液后，将细胞沉淀物再悬浮于10mL新鲜培养基中，并且通过19-号针头抽吸全部体积上/下5 次使细胞完全解聚。使用血细胞计数器测定细胞的浓度(1/10稀释)。通过将细胞悬浮液稀 释至10,000-40,000/mL来制备对于所进行测试的次数而言至少2-倍过量的适合体积，通常 为100-200mL，并且使用可编程8-通道蠕动泵将100μL/孔分配至96孔板，得到1000-4000个 细胞/孔，第12列留为空白。将这些板放回孵育器24小时，以使细胞重新附着。

以10mM于DMSO中制备受试化合物。将等分试样(24μL)稀释在1.2mL培养基中，得到 200μM，并且通过转移80μL至160μL中进行10次3倍系列稀释。使用8-通道移液枪向孔中添加 各次稀释的等分试样(100μL)，从而达到最终的进一步2倍稀释，并得到100μM至0.005μM范 围的剂量。第11列仅接收空白培养基。每种化合物以一式四份进行测定，每次重复是四个小 孔的平均值。

进一步生长5天后，倒空板，并且在4℃下使细胞在10％三氯乙酸中固定30分钟。在 流动的自来水中充分漂洗后，将板干燥，并通过添加50μL的0.1％磺酰罗丹明-B在1％乙酸 中的溶液，在室温下染色10分钟。倒出染料，在1％乙酸流下充分漂洗板(从而除去末结合的 染料)并干燥。通过添加100μLTris缓冲液(pH8)，随后在板振荡器上振摇10分钟(约 500rpm)，使所结合的染料吸收进溶液中。使用酶标仪测定各孔在540nm的吸光度(与存在的 细胞数成比例)。

在将第12列的空白值平均后，将其从所有值中减去，并且将结果表示为未经处理 值(第11列)的百分比。将如此推导的10个数值(一式四份)针对药物浓度的对数进行标绘， 并且通过非线性回归的四参数逻辑方程进行分析，如果检查建议的话则设置约束。通过这 一程序产生的GI₅₀是产生在饱和与零-效应平台之间的百分比对照A₅₄₀中间值的药物浓度。

一系列细胞系的结果总结如下。

异种移植研究

对于标准细胞系，以悬浮液(0.2mL)将细胞皮下接种到雌性无胸腺或重度联合免 疫缺陷小鼠的侧腹。在肿瘤体积的分层分配之后，将每组7-8只小鼠的各组指定处理。使用 TBAP-01的处理在细胞给予后11-14天之间开始。对于强饲法，给予200μL的悬浮液(在10mL/ kg下的DMSO:水，1:19，v/v)。对照动物接受类似剂量的运载体(DMSO:水，1:19，v/v)。继续使 用TBAP-01处理，每日一次，持续24个剂量。

对于患者衍生的异种移植物(PDX)，将新鲜组织在手术后立即收集到补充有10％ FBS的RPMI中。将组织转移到无菌皮氏培养皿中。去除肿瘤的坏死部分并且将一5x5x5mm 片皮下植入到Cb17NODSCID小鼠的侧腹中。当肿瘤达到内务部许可大小限制，将其切除， 并且将活体组织切成5x5x5mm立方体并使用相同的程序移植到另外的Cb17NODSCID小 鼠中。基因组和组织学分析证实在每个点的肿瘤衍生自起始材料。移植后，允许肿瘤RM-2 (系2)(BRAF突变体，固有威罗菲尼抗性的患者衍生的异种移植物)、肿瘤RM-17(系3)(BRAF 突变体患者衍生的对达拉菲尼+曲美替尼组合有抗性的异种移植物)、和RM33S(来自伊匹单 抗-难治性的患者的BRAF野生型Ras野生型)在通过以下各项处理起始之前生长至约50- 60mm³，所述处理为每日以20mg/kg/天进行TBAP-01或运载体的口胃强饲法分别持续24天或 17天。从手术后采集的新鲜组织中建立患者衍生的细胞LP2-CL2(系1)(BRAF突变体，衍生自 在临床上在3个月的治疗之后对威罗菲尼有获得性抗性的患者)。细胞生长在用10％FBS取 代的RPMI中。

这些结果总结在下表中。

生物标志物研究

以悬浮液(0.2mL)将细胞皮下接种到雌性无胸腺小鼠的侧腹。在细胞给予后14-21 天，将每组3-6只小鼠的各组指定用单一剂量的测试化合物(用于报道于表13中的免疫印迹 研究)或4个日剂量(用于报道于表13中的免疫组织化学研究)处理。对于强饲法，给予200μL 的40-50mg/kgTBAP-01于DMSO:水中的悬浮液。对照动物接受类似剂量的运载体(DMSO:水， 1:19，v/v)。给予后2-8小时收获肿瘤，并且使用组织均质机(Precellys24)将其溶解于1％ NP40裂解缓冲液中(100μL的缓冲液/15mg的组织)。使用660nm蛋白测定(皮尔斯(Pierce)) 测量总蛋白质含量，并且将40μg的总蛋白质加载到SDS-page中用于进一步免疫印迹。将 ERK2(圣克鲁兹生物技术(SantaCruzTechnologies)、磷酸化-MEK(细胞信号传导公司 (CellSignaling))、以及磷酸化-ERK(西格玛)抗体用于免疫印迹；使用荧光第二抗体(英 杰公司(Invitrogen))和拜力(Li-cor))在奥德赛(Odyssey)系统(拜力(Li-cor))上揭示信 号。可替代地，在治疗(24个日剂量)结束时在最终给药之后1小时收获肿瘤并且用如上所描 述的类似方式处理。

免疫组织化学(IHC)：将肿瘤如在别处描述的进行福尔马林固定和制备(参见例如 多曼(Dhomen)等人，2009)用于用苏木精和伊红染色、兔pSRC(英杰公司(Invitrogen) 44660G)和pERK(细胞信号传导公司(CellSignaling)20G11)染色。在各个实验中包括阳性 和阴性对照。以盲法方式进行图案和染色强度的打分。

数据总结于下表中，所述表显示磷酸化-MEK(ppMEK)和磷酸化-ERK(ppERK)的百分 比降低，如与TBAP-01的运载体处理的对照相比的。将pMEK和pERK针对在处理的样品连同在 对照样品中的总ERK归一化。

药物代谢动力学研究

至少6周龄的雌性BALB/cAnNCrl小鼠被用于所述PK分析。将小鼠静脉内(2mg/kg， 于DMSO中：吐温20:水10:1:89v/v)给药或通过强饲法口服给药。针对静脉内途径，在5分钟 与18或24小时之间在7或8个时间点处取得样品；针对口服途径，在15分钟与18或24小时之 间在6或8个时间点处取得样品。每途径每时间点使用三只小鼠。将它们置于氟烷或异氟烷 麻醉下并且通过末梢心脏穿刺取得用于血浆制剂的血液至肝素化注射器。将血浆样品急速 冷冻于液氮中并且然后在分析之前储存在-70℃下。根据进行国家内务部动物守则(科学程 序)法案1986以及由研究所动物伦理委员会和英国协调委员会关于实验性赘生物形成中动 物福利的癌症研究特别委员会提出的指南之内进行所有涉及动物的程序。

数据总结于下表中。

hERG抑制

根据承包商的方案在英国柴郡Cyprotex发现公司(CyprotexDiscovery)进行研 究。这些研究在IonWorks^TMHT仪器(分子设备公司(MolecularDevicesCorporation))上 进行，所述仪器在专门化384-孔板(PatchPlate^TM)中同时在48个单细胞中自动地进行电生 理学测量。所用的细胞是用hERG(获自英国Cytomyx的细胞系)稳定转染的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞。在胞外溶液(具有钙和镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水，pH7-7.2)中制备单细 胞悬浮液，并且等分试样自动添加至PatchPlate^TM的每个孔中。然后通过在所述板下方施加 真空以形成电气密封件而将细胞定位在每个孔底部的小孔上。通过所有孔共用的单一隔室 施加真空，将所述隔室用胞内溶液(用HEPES缓冲至pH7.2)填充。经由胞内隔室中的共用接 地-电极和放置到每个较高孔中的单独电极测量每个密封件的抗性。

然后通过在PatchPlate^TM的下面循环穿孔剂、两性霉素来实现电进入至细胞，并且 然后测量前化合物hERG电流。将电极定位在细胞外隔室并且-80mV的保持电位施加持续15 秒。然后将这些hERG通道通过施加去极化步骤至+40mV持续5秒而激活，并且然后夹在-50mV 持续4秒以引发hERG尾电流，之后返回到-80mV持续0.3秒。然后将测试化合物从包含一系列 浓度的化合物TBAP-01的96-孔微量滴定板自动地添加至PatchPlate^TM的较高的孔中。包括 一种已确立的hERG抑制剂奎尼定，作为实验对照。将TBAP-01溶解于DMSO中，并且以从100μM 至32nM于0.25％DMSO中范围内的最终浓度进行测定。包括含有0.25％DMSO的缓冲液，作为 阴性对照。使用与前化合物扫描中相同的电压步骤方案，在记录电流之前，将测试化合物留 下与这些细胞接触持续300秒。在4个重复孔中测试每个浓度。

将后化合物电流表示为前化合物电流的百分比，并且针对每个化合物的浓度进行 标绘。其中观察到浓度依赖性抑制，将数据拟合为以下等式：

y＝(y_最大-y_最小)/(1+(x/x₅₀)^s)+y_最小。

其中：

y＝(后化合物电流/前化合物电流)x100；

x＝浓度；

x₅₀＝抑制电流达50％所需的浓度(IC₅₀)；以及

s＝图的斜率。

数据总结于下表中。

抗其他靶标的活性

根据承包商的方案在佩斯利生命技术公司(LifeTechnologiesinPaisley)进 行研究。在100μM的ATP浓度存在下，将TBAP-01溶解于DMSO中，并且以从10μM至0.5nM于1％ DMSO中范围内的最终浓度进行测定。使用采用基于荧光的、基于磷酸化和非磷酸化的肽对 蛋白水解裂解的差异灵敏度的酶偶联酶形式的生物化学测定来确定测试化合 物的IC50值。

根据承包商的方案在国际邓迪激酶分析中心(TheInternationalCentrefor KinaseProfilinginDundee)进行另外的研究。将TBAP-01溶解于DMSO中，并且以1μM于 2％DMSO中的最终浓度针对131激酶进行测定。使用放射性的(³³P-ATP)滤膜结合测定来进行 这些测定。

数据总结于下表中。

注意，例如，熟知的是：TAK1是癌症例如淋巴瘤和结直肠癌和胰腺癌中的靶标； TrkA是肺癌和乳腺癌中的靶标；DDR2是癌症例如鳞状细胞肺癌中的靶标；VEGFR和Tie-2是 抗血管生成的靶标；ABL是白血病中的靶标；并且YES1是癌症例如黑色素瘤和乳腺癌中的靶 标。

抗病毒活性

将化合物针对HepG2细胞的脑心肌炎病毒(ECMV)VR-129B感染；维洛 (Vero)细胞的单纯性疱疹病毒HSV-1、SC16感染；和MDCK细胞中的甲型流感病毒、A/Panama/ 2007/99(H3N2)；的抗病毒活性根据承包商的方案在KWSBiotest(布里斯托尔(Bristol)， UK)进行评估。

使允许病毒复制的细胞在具有补充剂的生长培养基中生长到足够数量。一旦细胞 融合，将它们接种到96孔平-底板中。对于EC₅₀(有效浓度，50％)确定，去除培养基，并且在病 毒感染之前10分钟，将化合物以于0.4％DMSO中的10x终浓度添加。感染之后1小时，将覆盖 培养基添加至各孔中，以给出1x浓度的化合物用于本研究的持续时间。设置运载体和阳性 对照孔以控制对细胞活力的任何影响。对于CC₅₀(细胞毒性浓度，50％)确定，遵循相同的方 法，除了仅添加培养基代替病毒接种物。

然后使用MTT测定来评估单独的孔，MTT测定是用于哺乳动物细胞存活的定量比色 测定。将细胞与1mg/mLMTT溶液孵育3小时。然后通过量化在适当波长下的吸光度来确定颜 色强度。结果提供每种化合物的抗病毒功效的指示为EC₅₀、连同CC₅₀，以显示这些化合物在 病毒感染不存在下对细胞的任何细胞毒效应。还目视检查病毒感染的孔的任何CPE或合胞 体形成。

有效浓度(EC₅₀)：使用用于哺乳动物细胞存活的MTT比色测定来评估化合物降低病 毒诱导的细胞死亡的能力。使用ELISA酶标仪来定量自测定的结果，并且确定对于有待用每 种病毒评估的这些化合物中的每者的EC₅₀。结果以图表形式连同每组的平均标准误差(SEM) 一起显示。计算每种化合物的功效的统计显著性。

细胞毒性浓度(CC₅₀)：使用用于哺乳动物细胞存活的MTT比色测定评估化合物的细 胞毒性效应。使用ELISA酶标仪来定量自测定的结果，并且确定对于有待评估的这些化合物 中的每者的CC₅₀。结果以图表形式连同每组的平均标准误差(SEM)一起显示。计算每种化合 物的功效的统计显著性。

LPS刺激的TNF-α从人外周血单核细胞(PBMC)的释放

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，一种17kDa分泌的细胞因子，在炎症疾病和免疫病症中 起着重要的作用。TNF-α主要通过活化巨噬细胞(参见例如沙霍夫(Shakhov)等人，1990)和 单核细胞(参见例如姚(Yao)等人，1997)响应于若干炎症和免疫刺激物而分泌。例如，在细 菌感染期间，脂多糖(LPS)，即革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组分，诱导TNF-α的释放(参见 例如马蒂科(Martich)等人，1991)。

炎症细胞因子例如TNF-α的过度产生已经与以下各项关联：炎症疾病例如克罗恩 氏病(CD)和炎症性肠病(参见例如卡姆(Kam)等人，2000；纳卡穆拉(Nakamura)等人，2006)、 类风湿性关节炎(参见例如凯非(Keffer)等人，1991；麦卡恩(McCann)等人，2010)、败血症 性休克(参见例如林克(Link)等人，2008；沙皮拉(Shapira)等人.，1996)、哮喘(参见例如贝 瑞(Berry)等人，2007)、慢性支气管炎(CB)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺损伤(ALI)、以 及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(参见例如穆克霍帕蒂亚(Mukhopadhyay)等人，2006)。TNF-α 水平的降低已经与这些病状中的改善相关联。

将化合物TBAP-01在LPS刺激的TNFα自人外周血单核细胞(PBMC)的释放中的活性 在牛津高里市阿金塔(Argenta)/查尔斯河根据承包商的方案进行确定。使用标准密度梯度 离心技术将PBMC分离自健康人志愿者血液。将PBMC悬浮于培养基中并且分配到96-孔板中 并且在37℃下在加湿培养箱中孵育3小时。孵育后，更换培养基并且将测试化合物、参考化 合物(BIRB796)、或适当的运载体添加至细胞中，并且将所述板在37℃下孵育1小时。孵育 后，然后将LPS(大肠杆菌0111:84，10ng/mL)、或一种适当的运载体对照添加至细胞中，并且 将所述板返回到培养箱中持续过夜孵育。孵育后，将所述板以300xg在室温下离心4分钟。 去除细胞游离上清液并储存(冷冻)直至使用可商购的EUSA试剂盒(R&D系统公司(R&D Systems))测定TNF-α水平。

将测试化合物溶解于DMSO中，并且将等分试样储存冷冻。单独等份试样用于每个 实验。对于每个实验，将测试化合物稀释于DMSO中(至1000倍最终测定浓度)，然后将其稀释 到细胞培养基中，以给出所需浓度同时维持恒定的DMSO浓度(在测定中最终浓度为0.1％ DMSO)。

进行具有三个独立实验(n＝3)的8-点剂量-响应曲线。将测试化合物在每个实验 中的影响表达为LPS-刺激的应答的百分比抑制。将针对每种测试化合物在每个实验中的百 分比抑制数据进行合并，以确定每种测试化合物的单一IC₅₀值。

使用所述测定发现化合物TBAP-01展现出有效的抑制，其中IC₅₀为3.4nM并且95％ 置信区间为2.0-5.7nM。

比较数据-1

将TBAP-01和结构相关的已知化合物(AA-04于施普林格(Springer)等人，2011中； 和AA-018、AA-019、AA-062、AA-084于施普林格等人，2009中)的数据总结如下。

比较数据-2

与施普林格(Springer)等人，2011中的化合物AA-04相比，TBAP-01是：

(a)对BRAF激酶测定10-倍更强的；

(b)对pERK细胞测定8-倍更强的；以及

(b)对细胞增殖抑制测定5-倍更强的。

比较数据-3

与施普林格(Springer)等人，2009中的化合物AA-018相比，TBAP-01是：

(a)以最大有效剂量对突变体BRAF黑色素瘤异种移植物A375M为7-倍更有效的；以 及

(b)2-倍更高的口服生物利用度。

比较数据-4

与施普林格(Springer)等人，2009中的化合物AA-019相比，TBAP-01是：

(a)以剂量2-倍更高(即40-50mg/kg)为体内耐受的，尽管具有比按相同剂量的AA- 019更高的C_最大和AUC；

(b)在对BRAF突变的未用药(naivedrug)或批准药物抗性细胞系和突变体RAS细 胞系的细胞增殖抑制中高达16-倍更强的；

(c)2-倍更可溶的(即，具有2-倍更高的热力学溶解度)；

(d)以最大有效剂量对突变体BRAF黑色素瘤异种移植物A375M和突变体BRAF黑色 素瘤异种移植物WM266.4为2-倍更有效的；

(e)以最大有效剂量对突变体RAS结直肠异种移植物SW620为1.2-倍更有效的；

(f)以最大有效剂量对威罗菲尼有抗性的患者衍生的突变体BRAF黑色素瘤异种移 植物RM-2(系2)和突变体BRAF黑色素瘤异种移植物A375R为1.2-1.5-倍更有效的；以及

(g)以最大有效剂量对达拉菲尼+曲美替尼有抗性的患者衍生的突变体BRAF黑色 素瘤异种移植物RM-17(系3)为2.4-倍更有效的。

(h)以最大有效剂量在抑制胰腺PDACR172H同种异体移植物的pERK生物标志物中 为>6.5-倍更有效的。

(i)以最大有效剂量在抑制胰腺PDACR172H同种异体移植物的pSRC生物标志物中 为2.5-倍更有效的。

比较数据-5

与施普林格(Springer)等人，2009中的化合物AA-062相比，TBAP-01以最大有效剂 量对突变体BRAF黑色素瘤异种移植物A375M为9-倍更有效的。这是令人惊讶的且出乎意料 的，因为与TBAP-01相比，AA-062具有5-倍更高的C_最大和12-倍更高的AUC。

比较数据-6

与施普林格(Springer)等人，2009中的化合物AA-084相比，TBAP-01是：

(a)对BRAF激酶测定11-倍更强的；

(b)对pERK细胞测定8-倍更强的；以及

(b)对细胞增殖抑制测定5-倍更强的。

上述已经描述了本发明的原理、优选实施例和运行模式。然而，本发明不应被解释 为限于所讨论的具体实施例。相反，上述实施例应当被视为说明性的而不是限制性的。应理 解的是，在不脱离本发明范围的情况下，本领域技术人员可以在那些实施例中做出变化。

参考文献

在此引用多个出版物以便更充分地说明和披露本发明以及本发明所属领域的现 状。以下提供这些参考文献的完全引用。这些参考文献各自通过引用以其全文在此结合入 本披露中，其程度如同每个单独的参考文献特定地并且单独地指明为通过引用而结合。

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