一种基于α烯醇化酶的麻痹性贝类毒素细胞检测法

摘要

本发明提供一种基于α烯醇化酶的麻痹性贝类毒素细胞检测法，包括如下步骤：S1样品的处理；S2暴露细胞及蛋白样品提取；S3检测：使用α烯醇化酶ELISA试剂盒对所述蛋白样品中α烯醇化酶的含量进行检测，建立标准曲线，通过OD值计算α烯醇化酶的含量并进而得出麻痹性贝类毒素含量。本发明属于食品安全检测技术领域，本发明提供的细胞检测法具有样品处理简单、检测限低、重复性好、避免交叉反应等优点。

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种基于α烯醇化酶的麻痹性贝类 毒素细胞检测法。

背景技术

目前已经发现的贝类毒素有几十种，常见的贝类毒素主要包括腹泻性贝类毒素、 麻痹性贝类毒素(paralyticshellfishpoisoning，PSP)、遗忘性贝类毒素及神经性贝类 毒素。PSP的成分复杂，目前已明确的具体毒素成分超过28种，其中以石房蛤毒素(STX)的含 量最多，且毒性较强，因此，研究人员普遍以STX作为PSP的代表进行研究。

联合国卫生组织依据小鼠生物法(MBA)规定了PSP的限量标准为80μgSTXeq/ 100g，即400MU。食用含PSP的水产品后，即使毒素含量未超标，也可能出现呕吐、头痛、麻痹 等症状，容易造成食品安全问题。欧洲食品安全局于2009年建议将PSP的限量标准调整为 7.5μgSTXeq/100g，远低于依据小鼠生物法规定的限量标准。

PSP的检测方法目前主要有小鼠生物法、高效液相色谱法以及ELISA方法。小鼠生 物法作为半定性分析方法，是目前被大多数国家应用最多的一种方法，但存在灵敏度和准 确性较差，容易导致动物伦理问题等。

高效液相色谱法及相关联用技术是目前应用最广泛的麻痹性贝类毒素非生物检 测方法，该方法的检测准确性好，但需要配备专业的仪器和工作人员，样品的处理复杂，检 测成本高，检测周期较长，分析目标毒素需要相对应毒素标准品。中国专利申请 201510772443.7公开了一种测定水产品中麻痹性贝类毒素的方法，可以同时实现8种麻痹 性贝类毒素成分的检测，但操作较复杂。

ELISA方法是目前较为流行和成熟的抗原抗体结合实验方法，具有操作方便的优 点，但是其检测结果易受交叉反应的影响而出现假阴性或假阳性结果，对于复杂基质或多 组分PSP的定量检测存在困难，且价格较昂贵。

因此，提供一种样品处理简单、检测限低的麻痹性贝类毒素检测方法具有重要意 义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于α烯醇化酶的麻痹性贝类毒 素细胞检测法，样品处理简单，检测限低，灵敏度高，重复性好，避免了交叉反应。

本发明提供一种基于α烯醇化酶的麻痹性贝类毒素细胞检测法，包括如下步骤：

S1样品的处理：称取贝肉样品，加酸溶液煮沸，冷却后，离心取上清液，控制上清液 的pH＜4.0，得到样品检测液；

S2暴露细胞及蛋白样品提取：将标准品或所述样品检测液使用无血清培养基稀释 后暴露小鼠神经母细胞瘤N2a细胞，暴露20～28h后，采用胰酶消化或细胞刮板收集细胞，洗 涤后，离心收集细胞，加裂解液提取蛋白样品；所述标准品为STX标准品。

S3检测：使用α烯醇化酶ELISA试剂盒对所述蛋白样品中α烯醇化酶的含量进行检 测，建立标准曲线，通过OD值计算α烯醇化酶的含量并进而得出麻痹性贝类毒素含量。

本发明利用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS/MS的蛋白质组学技术，通过不同剂量STX 暴露N2a细胞引起的蛋白表达变化考察，筛选出STX暴露N2a细胞的差异蛋白，利用Western blot对差异蛋白进行进一步验证，从差异蛋白中成功筛选出呈现剂量效应关系的差异蛋 白——α烯醇化酶。利用试剂盒对α烯醇化酶进行定量检测，实现了STX细胞检测法的构建。

现有的麻痹性贝类毒素ELISA检测试剂盒，是利用麻痹性贝类毒素成分的抗原或 半抗原特性，对麻痹性贝类毒素进行检测。因此，现有的ELISA检测是对麻痹性贝类毒素成 分的结构表位进行测定，由于麻痹性贝类毒素成分的复杂性和结构类似性，容易发生交叉 反应，从而对检测结果造成影响。而本发明以细胞中提取的蛋白样品为检测对象，避免了交 叉反应的问题。

优选地，所述步骤S1中，酸溶液为0.1mol/LHCl溶液，酸溶液与所述贝肉样品的用 量比为5～15mL∶5～15g。

优选地，所述步骤S2中，稀释倍数为20～40倍。

优选地，所述贝肉样品经消化腺去除和均质处理。

优选地，所述步骤S1中，暴露时间为24h。

优选地，所述α烯醇化酶ELISA试剂盒购自上海心语生物科技有限公司。商业化的α 烯醇化酶ELISA试剂盒价格明显低于商业化的STX(PSP)ELISA试剂盒。根据α烯醇化酶ELISA 试剂盒的说明书，建立标准曲线并对提取的蛋白样品使用试剂盒中的样品稀释液稀释5倍 后进行检测。如果α烯醇化酶的含量超出该试剂盒的检测范围，需对提取的蛋白样品事先进 行稀释。

优选地，所述无血清培养基为DMEM基础培养基。

优选地，所述裂解液为PhosphoSate，购自美国ThermoScientific公司。

此外，本发明还提供了α烯醇化酶检测试剂盒在麻痹性贝类毒素的检测中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS/ MS的蛋白质组学技术，在不同剂量STX暴露N2a细胞引起蛋白表达变化过程中，筛选出STX暴 露N2a细胞的差异蛋白，利用Westernblot对差异蛋白进行进一步验证，并从差异蛋白中筛 选出呈剂量效应关系的差异蛋白——α烯醇化酶。在发现细胞中α烯醇化酶的含量与STX暴 露量呈剂量效应关系的基础上，利用试剂盒对α烯醇化酶进行定量检测，建立基于α烯醇化 酶的麻痹性贝类毒素细胞检测法，具有样品处理简单、检测限低(低至1nmol/L以下，相当于 0.299μg/100g以下)、重复性好、避免交叉反应等优点。此外，本发明还提供了α烯醇化酶检 测试剂盒在麻痹性贝类毒素的检测中的用途，拓宽了α烯醇化酶检测试剂盒的应用范围，与 ELISA检测法相比，成本降低。

附图说明

图1未暴露的N2a细胞总蛋白与STX暴露的N2a细胞总蛋白2D-DIGE代表图；其中，1- A指Cy3标记的未暴露的N2a细胞总蛋白荧光图；1-B指Cy5标记的STX暴露的N2a细胞总蛋白 荧光图；1-C指Cy2标记的内标混合蛋白荧光图；1-D指Cy2、Cy3及Cy5三种荧光合并图谱。

图2未暴露的N2a细胞总蛋白与STX暴露的N2a细胞总蛋白差异表达蛋白分布图。

图3α烯醇化酶在未暴露N2a细胞中和不同剂量STX暴露N2a细胞中的蛋白相对表达 量。

图4α烯醇化酶ELISA试剂盒的标准曲线。

图5STX诱导N2a细胞中α烯醇化酶表达的标准曲线。

图6细胞检测法与ELISA法检测结果的相关性结果图。

图7细胞检测法的特异性考察结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中所用到的试剂或材料为常规市售产品，或可通过本领域公知的方法获 得。例如，小鼠神经母细胞瘤N2a细胞购自中国科学院上海细胞库；STX标准品购自加拿大 NationalResearchCouncil；DIGE荧光染料试剂盒和2-D蛋白定量试剂盒等双向电泳相关 材料购自美国GEHealthcare；PhosphoSate和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；α烯醇化酶(αENOL)ELISA试剂盒购自上海心语生物科技有限公司；STX (PSP)ELISA试剂盒购自美国Abraxis公司。

实施例一样品的前处理

贝类样品采集后，清洗，将去除消化腺的贝肉均质。称均质后的贝肉10g，加入 10ml0.1mol/LHCl溶液，煮沸搅拌5min，冷却后，3500g转速离心10min。取上清后，用5mol/L 的HCl调节pH＜4.0，得到样品检测液。

实施例二细胞培养

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞以添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉 素的DMED完全培养基为培养基，在37℃及5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。待细胞生长至融 合度达到80％后，进行细胞传代或着STX染毒，传代比例为1∶3。用于进行实验的细胞处于对 数生长期。

实施例三暴露细胞及蛋白样品提取

6孔板中培养N2a细胞24h后，将STX标准品(终浓度分别为0、1nmol/L、2nmol/L、 4nmol/L、6nmol/L、8nmol/L、10nmol/L)或所述样品检测液60μL使用DMEM无血清培养基稀释 至总体积为2mL，然后暴露N2a细胞，暴露24h后，终止暴露，采用胰酶消化收集各孔的细胞， PBS洗涤后，离心收集细胞，加200μL裂解液PhosphoSate，冰上裂解30min后，4℃条件下， 14000g离心40min，取上清液，得到蛋白样品。保存于-20℃冰箱待用。

实施例四差异表达蛋白的考察和筛选

为保证2D-DIGE结果的可重复性和可靠性，每组使用3批次N2a细胞。使用2-D蛋白 定量试剂盒对提取的蛋白样品进行定量，根据蛋白定量与标记测试结果，按照CyDyeDIGE FluorLabelingKit说明书要求，分别以Cy3、Cy5标记样品，Cy2作为内标标记所有样品混 合物。蛋白等体积与2×LysisBuffer混合，按如下条件自动进行等电聚焦：Stp30V12h， Stp100V1h，Stp500V1h，Stp1000V1h，Stp5000V4h，Grd8000V4h，Stp8000V4h，Stp500V 10h，电压达到100000vhs即可。聚焦结束后，取出胶条，进行第二向垂直SDS-PAGE电泳。

电泳后的凝胶经TyphoonTrio荧光扫描仪进行扫描，结果如图1所示。使用 DeCyderTM2-DDifferentialAnalysisSoftwarev6.5分析软件进行差异蛋白分析，结果 如图2所示。EttanSpotPocker全自动挖胶仪对选定蛋白点(差异倍数大于1.1且p＜0.05) 进行切胶并进行质谱鉴定。

与未暴露N2a细胞总蛋白相比，STX暴露N2a细胞总蛋白中共筛选出13个差异表达 的蛋白点，经质谱鉴定后，这13个差异点为9个蛋白。按蛋白名称(proteinname)、MASCOT分 值(MASCOTscore)、差异表达倍数(ratio)及p值(p-value)列出了差异表达蛋白，如表1所 示。14-3-3蛋白及α烯醇化酶(Alpha-enolase，αENOL)在STX暴露N2a细胞蛋白中表达上调； 而RPSA蛋白和Cofilin-2蛋白等在STX暴露N2a细胞蛋白中表达下调。

表1STX暴露N2a细胞后的差异表达蛋白

实施例五差异表达蛋白的验证

在蛋白质组学结果基础上，本发明分别提取了一个空白对照组和两个剂量组的细 胞总蛋白，每组设置三个生物学重复，经BCA蛋白定量试剂盒定量后，使用Westernblot的 方法对以上结果进行验证。

暴露24h后，空白对照组和各个暴露组的α烯醇化酶(αENOL)Westernblot验证结 果如图3所示，结果表示为平均值±标准差，与空白对照组相比，^#表示p＜0.05。用One-way ANOVA方法对2个剂量组与空白对照组分别进行比较，结果显示空白对照组和1nmol/L组差 异无统计学意义(p＝0.5281，p＞0.05)、空白对照组和10nmol/L组差异有统计学意义(p＝ 0.0353，p＜0.05)。

与空白对照组相比，随着STX剂量的增加，αENOL在N2a细胞中表达上调，且差异具 有统计学意义(p＜0.05)，此结果与2D-DIGE的结果相符。

实施例六差异表达蛋白的ELISA验证

分别使用14-3-3蛋白beta/alpha(YWHAB)ELISA试剂盒、α烯醇化酶(αENOL)ELISA 试剂盒、核糖体蛋白SA(RPSA)ELISA试剂盒和丝切蛋白2(CFL2)ELISA试剂盒，按照说明书对 不同浓度STX暴露N2a细胞导致的相应蛋白表达差异进行检测。α烯醇化酶ELISA试剂盒的标 准曲线如图4所示。结果发现，α烯醇化酶的表达与STX浓度在1～10nmol/L范围内呈线性相 关，标准曲线如图5所示。

实施例七基于α烯醇化酶的麻痹性贝类毒素细胞检测

按实施例一的方法制得样品检测液，按实施例三的方法提取蛋白样品，使用α烯醇 化酶ELISA试剂盒对蛋白样品中α烯醇化酶的含量进行检测，建立α烯醇化酶ELISA试剂盒标 准曲线，通过OD值计算α烯醇化酶的含量并进而得出STX含量。

实施例八细胞检测法与ELISA法的检测结果相关性分析

分别采用本发明提供的基于α烯醇化酶的细胞检测法和ELISA法(STX(PSP)ELISA 试剂盒)对样品进行检测，检测结果如表2所示，将这两种方法的结果进行相关性分析，如图 6所示，两种检测方法的检测结果相关性良好，R²＝0.8106。

表2细胞检测法与ELISA法检测结果

实施例九细胞检测法的特异性和重复性

选择腹泻性贝类毒素的主要成分OA和雪卡毒素的主要成分CTX，分别以不同浓度 作用于N2a细胞，提取细胞总蛋白进行α烯醇化酶的酶联免疫分析，各实验组为3个复孔，酶 标仪检测吸光度值，计算出α烯醇化酶含量，以考察细胞检测法的特异性，结果如图7所示。 从图7可知，在1～10nmol/L范围内，经STX染毒细胞中的蛋白含量与空白对照组的差异均具 有统计学意义(p＜0.05)；经OA和CTX染毒细胞中的蛋白含量与空白对照组的差异均没有统 计学意义(p＞0.05)，可见本发明提供的细胞检测法具有较好的特异性。

选择6份贝肉样品，按实施例七的方法进行检测，重复3次，以考察细胞检测法的重 复性。结果如表3所示，变异系数在4.86％～10.76％范围内，平均变异系数为8.05％，可见 本发明提供的细胞检测法具有较好的重复性。

表3细胞检测法的重复性

样品编号 平均浓度(pg/mL) 标准差(pg/mL) 变异系数/％ 1 189.49 17.29 9.13 2 226.15 17.59 7.78 3 234.01 25.18 10.76 4 283.07 13.74 4.86 5 239.37 18.10 7.56 6 221.05 18.19 8.23

综上所述，本发明利用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS/MS的蛋白质组学技术，通过不 同剂量STX暴露N2a细胞引起的蛋白表达变化考察，筛选出与STX暴露浓度呈剂量效应关系 的差异蛋白——α烯醇化酶，实现了STX细胞检测法的构建。本发明提供的细胞检测法与 ELISA法的检测结果相关性良好，具有较好的特异性和重复性，避免了交叉反应的问题，且 检测限低，能更有效地保障贝类产品的食用安全。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。