一种定量检测试纸条及其检测用标准曲线制定方法、检测方法和应用

摘要

本发明涉及一种定量检测试纸条及其检测用标准曲线制定方法、检测方法和应用，所述试纸条包括底衬(3)以及设在底衬(3)上并顺次搭接粘贴的样品垫(1)、标记垫(2)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(7)，所述硝酸纤维素膜(4)上设有至少一条检测线和一条质控线(5)，上样检测时，所述的检测线和质控线(5)上的包被物同时结合标记垫(2)上的同一标记物，使得所述质控线信号值与检测线信号值成反比，扩大试纸条检测线性范围和检测浓度范围，实现精确定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物免疫检测分析领域，尤其涉及一种定量检测试纸条及其检 测用标准曲线制定方法、检测方法和应用。

背景技术

目前，市面上的胶体金、量子点、乳胶或荧光胶乳标记定量检测试纸条， 可配合定量检测仪进行定量检测并读取结果。这种定量检测试纸条通常设有加 样区、标记垫、检测线、质控线、吸水纸等部分，并在标记垫、检测线、质控 线上固定或包被有特定抗原或抗体。通常，标记垫标记有2种物质，可分别与 待测样本和试纸条的质控区发生抗原抗体结合反应。当样本添加到试纸条加样 区时，样本在试纸条上开始层析，并先后与标记垫上的标记物和检测线T上包 被物结合，从而将结合有特定标记物的待测物截留在检测线上；而标记区的另 一种可与质控线C包被物发生反应的标记物随着层析作用的进行，也被质控线 上包被物捕获，固定在质控线上。

为检测相应试纸条上送检样本的浓度，现有技术中的定量检测仪将T/C信 号值(检测线信号值与质控线信号值之比)与样本浓度值用纵坐标和横坐标关 联起来，形成信号值与样本浓度值曲线关系图，以此根据所测得信号值计算样 本浓度值。一般情况下，T/C信号值随着样本浓度的升高而升高，并在升高到 一定程度后趋于不变。上样试纸条送检时，仪器首先检测出该试纸条的T/C信 号值，再根据内部预设好的标准曲线，检测分析出与T/C信号值对应的样本浓 度值，输出检测结果，完成检测。通常情况下，检测线上标记物的量与被测样 本浓度成一定比例，质控线上标记物的有无代表样本层析顺利与否，与被测样 本浓度无关，C线信号值保持不变。由此可见，在C线信号值不变的情况下， 样本浓度值随着T线信号值的升高而升高。而实验证明，随着送检样本浓度的 不断升高，T线信号值的增长幅度趋于变小，因此，T/C信号值也变化不明显， 仪器不能据此明确分析出信号值所对应的样本浓度值，定量检测范围受限。

发明内容

为克服现有技术缺陷，本发明提供了一种定量检测试纸条及其检测用标准 曲线制定方法、检测方法和应用，目的是提高试纸条的可检测浓度范围，以及 检测线性范围，该试纸条配合仪器检测，可确保输出结果的准确性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种定量检测试纸条，其包括底衬3以及设在底 衬3上并顺次搭接粘贴的样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜4和吸水纸7，所 述硝酸纤维素膜4上设有至少一条检测线和一条质控线5，上样检测时，所述的 检测线和质控线5上的包被物同时结合标记垫2上的同一标记物。

本发明通过在样本上样层析时使所述检测线与质控线同时结合标记垫上的 同一标记物质，即采用在检测线和质控线上的包被物既可以是抗原，也可以是 抗体，并与标记垫上的同一种抗体或抗原结合，从而使检测线结合标记物的量 与质控线结合标记物的量成反比；根据检测线和质控线上结合物产生信号的比 值与标本浓度值之间的关系，设好检测用标准曲线，将关于该标准曲线的程序 内置在相关定量检测仪内，当在仪器上插入所述试纸条时，仪器可根据内部预 设好的标准曲线，进行标本浓度分析计算，实现样本浓度精确定量。

本发明设置至少1条检测线，例如可以是1条、2条、3条、4条，甚至更 多条，所述检测线的数量可根据不同待测样本而定。通过使检测线与质控线上 可结合标记物的量成反比，从而扩大检测用标准曲线上信号值的变化范围，有 利于提高试纸条的可检测线性范围，进一步提高试纸条的可检测浓度范围。

作为优选技术方案，本发明所述硝酸纤维素膜4上设有1条检测线或2条 检测线61、62。

所述硝酸纤维素膜上的检测线和质控线在试纸条上的排列顺序从靠近加样 区起依次为第一检测线61、第二检测线62和质控线5。

所述试纸条的第一检测线61与第二检测线62之间的距离为3-8mm，例如 可以是3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、 7.5mm、8mm。

优选地，所述试纸条的第二检测线62与质控线5之间的距离为3-8mm，例 如可以是3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、 7mm、7.5mm、8mm。

所述的标记垫2上涂覆有与待测样本对应，并可与样本发生抗原抗体反应 的标记抗体或抗原。

本发明所述的待测样本，优选但不局限于HCG、LH、乙肝、流感病毒、 HIV等检测。

优选地，所述标记垫2上的标记抗体为胶体金、量子点、乳胶或荧光胶乳 标记抗体。

优选地，所述标记垫2上的标记抗体为胶体金标记鼠抗β-HCG单克隆抗体 或荧光胶乳标记鼠抗β-HCG单克隆抗体。

优选地，所述标记垫上的标记抗体或抗原浓度为5-80％，例如可以是5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％或80％，优选为10-60％，进一步优选为30-50％。

所述检测线上均包被有与待测样本发生抗原抗体反应的相应蛋白。

优选地，所述检测线上均包被有鼠抗α-HCG单克隆抗体。

优选地，所述检测线上的抗体或抗原浓度为0.18-1.8mg/mL，例如所述抗体 或抗原浓度可以为0.18mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、 0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、 1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、 1.7mg/mL或1.8mg/ml，优选为0.2-1.8mg/mL。

优选地，所述检测线上的抗体或抗原包被参数为0.15-0.25μL/cm，例如可 以是0.15μL/cm、0.16μL/cm、0.17μL/cm、0.18μL/cm、0.19μL/cm、0.2μL/cm、 0.25μL/cm，优选为0.15-0.2μL/cm。

所述的质控线5上包被有与标记垫2上的标记抗体或抗原发生抗原抗体结 合反应的相应抗原或抗体。

优选地，所述质控线5上包被的物质可以为抗鼠IgG抗体、抗兔IgG抗体 或抗鸡IgG抗体。

优选地，所述质控线5上的抗体或抗原浓度为1-5mg/mL，例如可以是 1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、 4.5mg/mL或5mg/mL。

优选地，所述质控线(5)上的抗体或抗原包被参数为0.15-0.2μL/cm，例如 可以是0.15μL/cm、0.16μL/cm、0.17μL/cm、0.18μL/cm、0.19μL/cm或 0.2μL/cm。

第二方面，本发明提供了如本发明第一方面所述的定量检测试纸条检测用 标准曲线制定方法，包括如下步骤：

(1)准备至少7份相邻浓度间相差0.5-20倍的待测样本；

(2)应用如本发明第一项所述的试纸条，对待测样本进行加样检测，各层 析反应10-30min；

(3)检测并记录完成步骤(2)的各上样试纸条检测线和质控线上标记物 信号值；将检测线的信号值记录为Tn，n为试纸条上检测线的编号，将质控线 的信号值记录为C；

(4)计算各上样试纸条的Tn之和与C的比值；

(5)以Tn之和与C的比值为纵坐标，以信号值对应的样本相应浓度值为 横坐标，绘制所述Tn之和与C的比值与所述样本浓度值的关系曲线图，即得检 测用标准曲线。

本发明中，检测线的信号值记录为Tn，当有多条检测线时，n为每条检测 线所对应的编号，所述的待测样本根据需要而定，不限于7个待测样本。

第三方面，本发明还提供了一种检测生物大分子和/或小分子的方法，包括 如下步骤：

(1)将待测样品添加到如本发明第一方面所述试纸条的加样区，免疫层析 反应10-30min；

(2)将完成步骤(1)的试纸条插入预设有如本发明第二方面所述标准曲 线的相应定量检测仪中，等待检测仪分析计算；

(3)输出检测结果。

第四方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的试纸条在检测生 物大分子和/或小分子中的应用。

优选地，所述的试纸条用于蛋白检测。

优选地，所述试纸条应用于HCG定量检测。

对于本领域技术人员来说，即使不明了本发明的检测原理，同样能够实 施、再现本发明，即本发明的检测原理是否清楚明了，都不影响本发明的实施 和再现。本发明的一种定量检测试纸条，其检测原理在于：

该试纸条包被有至少1条检测线和1条质控线，其中，样本层析时，检测 线和质控线上包被的抗体或抗原同时结合标记垫上的同一标记抗原/抗体，使得 所述质控线与检测线结合标记物的量成反比，据此所测得检测线和质控线信号 值也成反比。应用上述试纸条检测用标准曲线制定方法所制得标准曲线，根据 检测线T信号值之和与质控线C信号值的比值，即(T1+T2+……+Tn)/C对试 纸条上样本浓度进行检测，扩大了试纸条检测浓度范围及可检测线性范围，有 利于样本浓度的精确检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过设置至少1条检测线，扩大了试纸条可检测样本浓度范围；通 过设置质控线与检测线同时结合同一种标记物，使检测线与质控线所测得的标 记物信号值成反比，以此扩大试纸条的可检测浓度范围及可检测线性范围，实 现了精确的定量检测；与现有技术相比，本发明试纸条的检测浓度范围扩大了 至少22倍，配合仪器使用，有利于仪器的精确判读及样本浓度的精确检测。

附图说明

图1a是本发明实施例1的定量检测试纸条示意图；

图1b是本发明实施例3的定量检测试纸条示意图；

图2是本发明实施例3、4定量检测HCG试纸条信号值与现有试纸条和对 比例试纸条检测信号值与其各自对应样本浓度关系的曲线对比图；

其中：1-样品垫，2-标记垫，3-底衬，4-硝酸纤维素膜，5-质控线，61-第 一检测线，62-第二检测线，63-第三检测线，7-吸水纸。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过 具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范 围内。

实施例1诊断甲型流感病毒的胶体金定量层析试纸条

图1a为本实施例的用于检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条。包括样 品垫1、与所述样品垫1一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的标记垫2、与 所述标记垫2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜4、以及与所述纤维素膜4的另一 端紧密相连的吸水纸7，所述样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水 纸4均设置于底衬3上，所述硝酸纤维素膜4包括检测区和质控区，检测区设 有3条检测线，分别是第一检测线61、第二检测线62、第三检测线63，均包被 有甲型流感病毒抗体，质控区设有1条质控线5，所述质控线包被有羊抗兔 IgG，所述胶体金颗粒标记物为胶体金标记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗 体。上样时，如样本中含有甲型流感病毒抗原，则在样本层析过程中，该抗原 首先与胶体金标记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗体结合，然后再与检测线上 的甲型流感病毒抗体结合形成标记复合物被固定在检测线上；接着，胶体金标 记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗体随着层析的继续进行，流经质控线，并被 质控线上的羊抗兔IgG捕获，形成胶体金标记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗 体-羊抗兔IgG复合物。

本实施例的试纸条中，胶体金标记兔抗甲型流感病毒抗体的单克隆抗体浓 度为50％，第一检测线61、第二检测线62和第三检测线63上包被的兔抗甲型 流感病毒抗体的浓度均为1.2mg/mL，包被参数为0.2μL/cm；质控线5上包被的 羊抗兔IgG的浓度为5mg/mL，包被参数为0.2μL/cm。

本实施例中，第一检测线61、第二检测线62和第三检测线63之间的间隔 为3mm，第三检测线63与质控区5间隔为3mm。所述标记垫上涂覆有胶体金 标记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗体。

实施例2诊断乙肝表面抗原(HbsAg)的荧光胶乳定量层析试纸条

本实施例的试纸条是用于诊断HBsAg的荧光胶乳定量层析试纸条，该试纸 条为底衬3上顺次相互搭接地粘贴样品垫1、标记垫2、硝酸纤维膜4以及吸水 纸7，硝酸纤维膜4上设有检测区6和质控区5，检测区6设有4条检测线，分 别是第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线，均包被鼠抗乙肝表 面抗原单克隆抗体，质控区设有1条质控线5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG， 所述荧光胶乳微粒标记物为荧光胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体。 上样时，如样本中含有乙肝表面抗原，则在样本层析过程中，该抗原首先与荧 光胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体结合，然后再与检测线上的鼠抗 乙肝表面抗原单克隆抗体结合形成标记复合物被固定在检测线上；接着，荧光 胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体随着层析的继续进行，流经质控 线，并被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，形成荧光胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗 原单克隆抗体-羊抗鼠IgG复合物。

本实施例的试纸条中，荧光胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体浓 度为10％，第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线上包被的鼠抗 乙肝表面抗原的浓度均为0.5mg/mL，包被参数为0.15μL/cm；质控线5上包被 的羊抗鼠IgG的浓度为1mg/mL，包被参数为0.15μL/cm。

本实施例中，第一检测线、第二检测线、第三检测线和第四检测线之间的 间隔均为7mm，第四检测线与质控区5间隔为7mm。所述标记垫上涂覆有荧光 胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体。

实施例3诊断HCG的胶体金定量检测试纸条

所用的试剂仪器设备来源：

(1)鼠抗α-HCG单克隆抗体：ARISTA；

(2)鼠抗β-HCG单克隆抗体：ARISTA；

(3)羊抗鼠IgG：ARISTA；

(4)定量检测仪：万孚公司。

如图1b所示，本实施例的定性和定量检测试纸条包括底衬3以及粘贴在底 衬3上的待测样品流动方向上顺序排列的样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜4 和吸水纸7，样品垫1一端搭接粘贴标记垫2，硝酸纤维素膜4的两端与标记垫 2和吸水纸7搭接粘贴，所述硝酸纤维素膜4上设有第一检测线61、第二检测 线62和质控线5；其中，标记垫2上设有胶体金标记鼠抗β-HCG单克隆抗体， 检测线61、62上均包被有鼠抗α-HCG单克隆抗体，质控线上包被有羊抗鼠 IgG抗体。上样时，如样本中含有HCG抗原，则在样本层析过程中，HCG抗原 首先与胶体金标记鼠抗β-HCG单克隆抗体结合，然后再与检测线上的鼠抗α -HCG单克隆抗体结合形成标记复合物被固定在检测线上；接着，胶体金标记 鼠抗β-HCG单克隆抗体随着层析的继续进行，流经质控线，并被质控线上的 羊抗鼠IgG捕获，形成胶体金标记鼠抗β-HCG单克隆抗体-羊抗鼠IgG复合 物。

所述的用于诊断HCG的胶体金定量检测试纸条具体制备方法如下：

1、硝酸纤维素膜的制备

配置包被缓冲液0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，置4℃备用，稀释鼠抗α-HCG 单克隆抗体，稀释后鼠抗α-HCG单克隆抗体浓度为0.8mg/mL；用包被缓冲液 稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体，稀释后羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为2mg/mL。 控制检测线和质控线两线间隔为5mm，调试喷膜机，按喷液量为0.18μL/cm进 行喷膜包被，包被好后，室温晾干二十分钟后转移至50℃烘箱干燥过夜。

2、标记垫的制备

按常规的标记方法将鼠抗β-HCG单克隆抗体标记到胶体金上形成金标结合 物，均匀地涂覆在标记垫上，胶体金标记的鼠抗β-HCG单克隆抗体的浓度为 30％，涂覆量为0.18μL/cm。37℃干燥房干燥过夜，封袋，置室温密封保存备 用。

3、样品垫的制备

配置样品垫处理液0.5％卵清蛋白，0.01％Tween-20，0.01MpH7.0PBS， 0.02％叠氮化钠(防腐剂)，置4℃备用，涂布玻璃纤维，涂布参数为1cm²/mL， 37℃干燥房干燥过夜，封袋，置室温密封保存备用。

4、试纸条的制备

将硝酸纤维素膜、吸水纸、标记垫、样品垫依次搭接粘贴在PVC板上，组 成大板。用切条机将大板切成单条，宽度为4mm。

实施例4

本实施例试纸条在实施例3的HCG胶体金定量检测试纸条的基础上减少了 一条检测线，其他设置均与实施例3的HCG胶体金定量检测试纸条一致。

对比例

本对比例的试纸条是在现有胶体金试纸条的基础上增加了一条与原有检测 线相同的检测线，标记垫上设有胶体金标记的鼠抗β-HCG单克隆抗体和胶体金 标记的鼠IgG抗体，质控线上包被有抗鼠IgG抗体，检测线上包被有鼠抗 α-HCG抗体。质控线与检测线结合不同标记物。相应包被参数和浓度与实施例 3的试纸条一致。

实施例5HCG检测试纸条用标准曲线的制定方法

1、实施例3的HCG检测试纸条用标准曲线的制定方法

准备好HCG浓度分别为0mIu/mL、9.765625mIu/mL、19.53125mIu/mL、 39.0625mIu/mL、78.125mIu/mL、156.25mIu/mL、312.5mIu/mL的待测血液样 本；

(1)应用实施例3的试纸条，对待测血液样本逐一进行加样检测，各层析 反应15min；

(2)检测并记录下完成步骤(2)的各上样试纸条检测线和质控线上标记 物信号值；将检测线的信号值记录为T1、T2，1、2为试纸条上检测线的编 号，将质控线的信号值记录为C；

(3)计算出(T1+T2)/C值；

(4)以(T1+T2)/C值为纵坐标，以信号值对应的样本相应浓度值为横坐 标，绘制(T1+T2)/C值与样本浓度值关系曲线图，即得检测标准曲线。

2、运用同样方法制定实施例4及对比例的HCG检测试纸条和现有试纸条 检测用标准曲线。

实施例6定量检测不同浓度的HCG

准备HCG浓度分别为0mIu/mL、9.765625mIu/mL、19.53125mIu/mL、 39.0625mIu/mL、78.125mIu/mL、156.25mIu/mL、312.5mIu/mL、625mIu/mL、 1250mIu/mL、2500mIu/mL、5000mIu/mL和7000mIu/mL的血液样本，将上述 不同浓度的样本分别滴加至现有HCG胶体金检测试纸条(即设置1条检测线和 1条质控线，且检测线和质控线的包被抗体不同)与实施例3、4和对比例所制 备的HCG检测试纸条中，待其充分反应后，采用万孚公司自主研发的相应定量 检测仪进行检测线与质控线的胶体金信号检测及其比值T/C计算，实验数据及 比较结果如表1和图2所示。

表1

从表1可以看出：

(1)现有试纸条信号值T61/C5(原)的数据显示的是目前市售试纸条的检 测线与质控线胶体金信号值比值。该试纸条上只有一条检测线和一条质控线， 质控线上包被的是抗鼠IgG，检测线包被的是鼠抗α-HCG单克隆抗体，标记垫 固定有胶体金标记鼠IgG与胶体金标记β-HCG。通过检测，可以明显看出，随 着样本浓度的不断增加，刚开始该信号值也随之升高，但是，当样本浓度高于 312.5mIu/ml，信号值变化不够明显，相比起在成倍增长的样本浓度，该变化甚 至可忽略不计。由图2可见，使用现有试纸条检测浓度大于312.5mIu/mL的样 本，检测结果基本趋于一致，仪器无法据此做出正确判断，该试纸条线性范围 差，不利于仪器的精确判读。

(2)(T61+T62)/C5(原)的数据显示的是应用对比例的试纸条所测得的信号 值，该试纸条在现有胶体金检测试纸条的基础上增加了一条与原有试纸条一样 的检测线。通过检测，可以明显看出，随着样本浓度的不断增加，该信号值不 断升高，一直到样本浓度为1250mIu/mL，该信号值开始变化微弱，甚至趋于不 变。可见，增加1条与原试纸条相同的检测线有利于扩大试纸条的浓度检测范 围，但对于1250mIu/mL以上浓度的样本，其测得的信号值变化仍然相当微 弱，该信号值不能随着样本浓度的升高而持续明显上升，试纸条的检测线性范 围不佳，不利于仪器判读，检测范围仍非常有限。

(3)T61/C5(改)的数据显示的是应用实施例4的试纸条所测得的信号值， 该试纸条是应用本发明技术的HCG检测试纸条，具有一条检测线和一条质控 线，检测线与质控线同时检测标记垫上的同一种标记物。结合表1和图2可以 看出，该试纸条检测范围在现有试纸条和对比例试纸条的基础上进一步扩大， 同时，信号值与浓度关系曲线的线性较现有试纸条T61/C5(原)有所改进，线 性范围更优，有利于仪器的判读，检测样本浓度范围扩大。

(4)(T61+T62)/C5(改)信号值是采用实施例3的试纸条进行检测得出的 信号值。该试纸条是应用本发明技术的HCG检测试纸条，具有两条检测线和一 条质控线，其质控线上包被的是羊抗鼠IgG多克隆抗体，检测线包被的是鼠抗 α-HCG单克隆抗体，标记垫上固定有胶体金标记鼠抗β-HCG单克隆抗体，结合 表1和图2可以看出，随着检测样本浓度的不断升高，该信号值不断增大，不 同样本浓度值对应的信号值较现有技术中的信号值间隔较大，检测线性范围良 好，检测范围也明显提高，有利于仪器判读并输出精确的检测结果。

从图2中现有试纸条、对比例与应用本发明技术的实施例3、4的试纸条检 测进行比较可以看出，应用本发明实施例3、4的试纸条对上述不同浓度样本检 测所得信号值随样本浓度的增加而明显增加，检测线性范围良好，试纸条检测 范围明显扩大，有利于样本浓度的精确检测。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实 施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品 各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保 护范围和公开范围之内。