公开/公告号CN105758972A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-07-13
原文格式PDF
申请/专利权人 江苏正大清江制药有限公司;
申请/专利号CN201610338095.7
申请日2016-05-20
分类号G01N30/02;G01N30/06;
代理机构
代理人
地址 223001 江苏省淮安市韩泰北路9号
入库时间 2023-06-19 00:05:15
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-09-05
授权
授权
2016-08-10
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20160520
实质审查的生效
2016-07-13
公开
公开
技术领域
本发明涉及高效液相色谱技术领域,具体涉及一种高效液相色谱法测定帕利哌酮 缓释片中有关物质的方法。
背景技术
帕利哌酮属于治疗精神分裂症急性期的药物,帕利哌酮缓释片生产储存过程中可 能存在多种杂质,对于帕利哌酮缓释片中存在的杂质需进行质量控制,因此,实现帕利哌酮 及其有关物质的分离与检测,对其质量控制方面具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是建立一种测定帕利哌酮缓释片中有关物质的方法,可以更好的控 制帕利哌酮缓释片的质量,更好的对帕利哌酮缓释片中可能存在的杂质进行检测。
本发明的技术方案是:高效液相色谱测定帕利哌酮缓释片中有关物质的方法,它 包括如下步骤:
系统测试液的制备:称取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质 E对照品适量,置量瓶中,另称取帕利哌酮对照品适量,加甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中 约含杂质A3.75μg、杂质B3.75μg、杂质C3.75μg杂质D3.75μg、杂质E3.75μg、帕利哌酮 25μg的混合溶液,作为系统测试液;
对照品溶液制备:精密称取帕利哌酮对照品适量,精密称定,用甲醇溶解并用稀释液稀 释制成每1mL约含25μg的溶液即得;
供试品溶液制备:精密称取本品适量置容量瓶中加甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中 约含帕利哌酮2.5mg的溶液,作为供试品溶液;
空白溶液的制备:甲醇;
测定:高效液相色谱仪的固定相为十八烷基键合硅胶,流动相A为0.1mol/l甲酸铵缓冲 液,流动相B为乙腈,流动相C为甲醇:正丙醇=1:1,柱温为30℃~36℃,检测波长为270nm~ 280nm。
吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10μl注入液相色谱仪,记录色谱图。
计算对照品溶液浓度的值与相应峰面积值的线性回归方程,相关系数而应不小于 0.99,对照品溶液峰形对称,理论塔板数以帕利哌酮计达到2000以上;
高效液相色谱法测定帕利哌酮缓释片中有关物质的方法,所述流动相A为0.1mol/l甲 酸铵缓冲液,流动相B为乙腈,流动相C为甲醇:正丙醇=1:1,其运行的比例变化为过程见表1 梯度表;每片帕利哌酮缓释片中,单个杂质量不得超过30μg,杂质总量不得超过60μg。
本发明的有益效果是:本发明应用高效液相色谱测帕利哌酮缓释片中有关物质, 分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高,通过检测帕利哌酮缓释片中有关物质,控制每片 帕利哌酮缓释片中单个杂质量不得超过30μg,杂质总量不得超过60μg,更好的对帕利哌酮 缓释片中可能存在的杂质进行检测,可以更好控制帕利哌酮缓释片的质量。
附图说明:图1为实施例1方法摸索色谱图;
图2为实施例2方法摸索色谱图;
图3为实施例3方法摸索色谱图;
图4为实施例4流动相的确定色谱图;
图5为实验例7系统适用性实验色谱图;
图6为帕利哌酮杂质A峰面积与浓度曲线关系图;
图7为帕利哌酮杂质C峰面积与浓度曲线关系图;
图8为帕利哌酮杂质B峰面积与浓度曲线关系图;
图9为帕利哌酮杂质E峰面积与浓度曲线关系图;
图10为帕利哌酮峰面积与浓度曲线关系图;
图11为帕利哌酮杂质D峰面积与浓度曲线关系图;
图12为流动相比例变化测试结果对比图;
图13为柱温变化结果对比图;
图14为流速变化测试结果对比图;
图15为pH变化结果对比;
图16为检测波长变化结果对比;
图17为色谱柱变化结果对比;
图18为杂质A分子结构式;
图19为杂质B结构式;
图20为杂质C结构式;;
图21为杂质D结构式;
图22为杂质E结构式;
图23为帕利哌酮结构式。
以下通过实施例形式再对本发明的内容作进一步详细说明,但不应就此理解为本 发明上述主题范围内仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术前提下,根据本领域普 通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改,均包括在本发明的范围内。
实施例1流动相的确定。
系统测试液的制备:称取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、 杂质E对照品适量,置量瓶中,另称取帕利哌酮对照品适量,加甲醇溶液溶解并稀释制成每 1ml中约含杂质A3.75μg、杂质B3.75μg、杂质C3.75μg杂质D3.75μg、杂质E3.75μg、帕利 哌酮25μg的混合溶液,作为系统测试液。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:5gm/l乙酸铵缓冲液pH=6.0,
流动相B:甲醇,梯度表见表2。
结果见图1。
结论:杂质E和主峰不能分离。
实施例2流动相的确定。
系统测试液的制备,同实施例1
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-四氢呋喃=1:1
运行梯度见表3。
结果见图2。
结论:四氢呋喃稳定剂对检测有干扰。
实施例3流动相的确定。
系统测试液的制备,同实施例1。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-四氢呋喃=1:1
运行梯度见表3
实施例3结果见图3
结论:杂质B和杂质C不能完全分离。
实施例4流动相的确定。
系统测试液的制备,同实施例1
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3
实施例4结果见图4
结论:杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和帕利哌酮均可达到完全分离。
实施例5色谱柱的确定。
系统测试液的制备,同实施例1
色谱柱:C18,150×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3
结论:杂质B和杂质C不能完全分离。
实施例6检测波长的确定。
系统测试液的制备,同实施例1
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3
结论:在200~400nm波长范围内PDA扫描,杂质A波长为275nm、杂质B波长为277nm、杂 质C波长为278nm、杂质D波长为278nm、杂质E波长为281nm、帕利哌酮波长为277nm,折中 考虑,故采用波长275nm。
实验例7系统适用性实验。
系统测试液的制备,分别取帕利哌酮杂质A、帕利哌酮杂质B、帕利哌酮杂质C、帕利 哌酮杂质D、帕利哌酮杂质E、帕利哌酮杂质F、帕利哌酮杂质G、帕利哌酮杂质H、帕利哌酮杂 质I、帕利哌酮杂质J、帕利哌酮杂质K、帕利哌酮杂质N、帕利哌酮对照品适量,分别用甲醇稀 释制成每1ml分别约含杂质A3.75μg、杂质B3.75μg、杂质C3.75μg、杂质D3.75μg、杂质E 3.75μg、杂质F3.75μg、杂质G3.75μg、杂质H3.75μg、杂质I3.75μg、杂质J3.75μg、杂质K 3.75μg、杂质N3.75μg、帕利哌酮25μg、
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3,结果图5。
实验例8线性和范围。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3。
对已知杂质,在定量限浓度至不低于150%指标浓度的范围内取6个浓度点进行研 究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图,用最小二乘法进行 线性回归,至少报告相关系数R2来证实良好线性关系,要求线性回归系数R2的数值应不小 于0.990。
结果见表4、5、6、7、8、9,图6、7、8、9、10、11。
结论:杂质A在0.38~5.25μg/ml范围内y=15409.57x+359.93R=0.9990,杂质 B在0.38~5.25μg/ml范围内,y=7694.02x+1361.36R=0.9997,杂质C在0.38~5.25μg/ ml范围内y=13147.81x+885.52R=0.9989,杂质D在0.38~5.25μg/ml范围内y= 10728.92x+14.88R=0.9998,杂质E在0.38~5.25μg/ml范围内y=7875.68x+426.34 R=0.9999,帕利哌酮在0.38~28.92μg/ml范围内y=12692.84x-1252.09R=0.9998,各 峰峰面积与浓度呈良好线性关系。
实验例9检测限与定量限。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3。
已知潜在杂质,检测限和定量限是根据通过信噪比法来确定的,把已知浓度的杂 质储备液稀释到低浓度的试样,测出的信号与空白处的信号进行比较,算出能被可靠的检 测出的最低浓度或百分比。当S/N≈3时为检测限,当S/N≈10时为定量限。
结论:杂质A检测限为0.0334μg/ml,杂质B检测限为0.0562μg/ml,杂质C检测限为 0.0814μg/ml,杂质D检测限为0.0680μg/ml,杂质E检测限为0.0840μg/ml,帕利哌酮检测 限为0.2088μg/ml。杂质A定量限为0.1012μg/ml,杂质B定量限为0.1703μg/ml,杂质C定量限 为0.2468μg/ml,杂质D定量限0.2062μg/ml,杂质E定量限为0.2545μg/ml,帕利哌酮定量 限为0.6328μg/ml。
实验例10精密度试验。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3
精密称取帕利哌酮对照品适量,精密称定,用甲醇溶解并用稀释液稀释制成每1mL约含 25μg的溶液,连续进对照品溶液6针;记录色谱图。平均峰面积的RSD为1.74%。
结论:该方法的进样精密度良好。
实验例11准确度。
准确度是通过在供试品中加入指标的80%、100%、120%三个不同浓度各杂质测得的 回收率所得。已知杂质的准确度是加入已知量的杂质,再测定加样样品中已知杂质的测定 结果和理论值之间的比值(回收率),以百分率%表达,要求回收率在70.0%-130.0%之间,以 证实方法具有良好的准确度。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3。
结果见表10、11、12、13、14、15。
结论:杂质A回收率在84.98%~96.53%、杂质B回收率在70.88%~99.76%、杂质C回收 率在70.18%~96.73%、杂质D回收率在93.35%~118.41%、杂质E回收率在89.57%~106.89%、未 知杂质以帕利哌酮计回收率在93.79%~110.62%,上述结果表明该方法准确度良好。
实验例12重复性试验。
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm
波长:275nm
流速:1.25ml/min
进样量:10μl
柱温:35℃
流动相A:0.1mol/l甲酸铵缓冲液
流动相B:乙腈
流动相C:甲醇-正丙醇=1:1
运行梯度见表3。
重复性是通过配制6个样品溶液并进行测试,每个溶液进样1针来验证的。
结果见表16。
结论:6次测定结果的含量在检测限以上的各杂质峰数一致,杂质之和的绝对偏 差不得超过质量标准的50%,上表结果表明该方法的重复性良好。
实验例13液相色谱条件耐用性,流动相比例变化对分离度的影响。
结果见表19、图12。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见流动相比例在条件 允许范围内变化对杂质分离没有影响。
实验例14液相色谱条件耐用性,柱温变化对分离度的影响。
将柱温变化为:柱温变化1:30℃、柱温变化:2:36℃、原始柱温:35℃。
结果见表20、图13。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见柱温在30℃~.36 ℃范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。
实验例15液相色谱条件耐用性,流速变化对分离度的影响。
将流速变化为:流速变化1:1.20ml/min、流速变化1:1.30ml/min、原始流速: 1.25ml/min。
结果见表21、图14。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见流速在0.9ml/min ~1.1ml/min范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。
实验例16液相色谱条件耐用性,pH值变化对分离度的影响。
将流动相pH值变化为:pH值1:4.4、pH值3.8、原pH值:4.0。
结果见表22、图15。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见pH在4.4~3.8范围 内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。
实验例17液相色谱条件耐用性,检测波长变化对分离度的影响。
将检测波长变化为:检测波长1:270nm、检测波长2:280nm、原始波长:275nm。
结果见表23、图16。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见波长在270nm~ 280nm范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。
实验例18液相色谱条件耐用性,色谱柱变化对分离度的影响。
将检测波长变化为:色谱柱1:Aglient、色谱柱2:月旭、原色谱柱:254nm。
结果见表24、图17。
结论:按上述色谱条件下测定,均能达到所需的分离效果,可见不同品牌批号色谱 柱对杂质分离没有影响。
实验例19
杂质A:3-(2-乙基)-2-甲基-9-羟基-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮,结 构式图18;
杂质B:3-(2-氯乙基)-2-甲基-9-羟基-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮, 结构式图19;
杂质C:6-氟-3-(4-哌啶基)-1,2-苯并异恶唑,结构式图20;
杂质D:帕利哌酮顺式N-氧化物,结构式图21;
杂质E:3-(2-(4-(6-氟-苯并[d]异恶唑-3-基)-1-哌啶基)乙基)-7,8-二氢-2-甲基- 6H-吡啶并[2,1-a]嘧啶-4,9-二酮,结构式见图22;
帕利哌酮:结构式见图23。
机译: 测定卢比前列酮试验样品中有关物质的分析方法
机译: 一种定量测定组织切片中分子校准标记集落的方法
机译: HDL Abun图片中胆固醇的测定方法,测定试剂和测定试剂盒