一种与猪肉质性状和胴体性状关联的遗传标记

摘要

本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种与猪肉质和胴体性状关联的遗传标记，该标记从猪BMP?3b基因中筛选得到，其序列如SEQ ID NO：1和图4所示，在该序列425位碱基处发生一个A/G碱基突变，导致AlwNⅠ?RFLP多态性。筛选方法为：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，SNP检测，标记与肉质性状间相关性分析。公开了猪BMP?3b基因CDS区的SNP分型检测技术，发现该A/G突变位点与大理石花纹、色值、肌内脂肪含量等肉质性状显著相关；与平均背膘厚、眼肌高以及板油等胴体性状显著相关。本发明为猪标记辅助选择提供了新的标记资源。

说明书

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪肉质和胴体性状关联的遗传标记。所述的遗传标记分离自BMP-3b基因的CDS区片段，本发明还包括所述的遗传标记在猪辅助选择关联分析中的应用。

背景技术

传统的育种主要依赖于表现型选择，而环境条件、基因间互作以及基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率，使得传统的育种的效率不高，育种工作进展缓慢。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型、并能稳定遗传的物质标志，包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。目前以DNA多态性为基础的分子标记在分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection，MAS)育种中受到人们的普遍重视。分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以通过分子标记对基因型做直接选择，从而进行分子育种。分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔，与常规育种相结合，可大大加快育种进程。

随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记技术。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析是最早应用于动植物遗传学研究的分子标记技术。将PCR技术用于RFLP分析，即PCR-RFLP。该技术可以用有限的DNA为模板，利用引物特异性扩增基因组的某一区域，然后用限制性内切酶消化PCR产物，电泳检测多态性。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指同一物种不同个体基因组DNA上的某个位点存在单个碱基的变化，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等现象。SNP是基因组中最普遍、频率最高的遗传标记，某些位于基因表达序列内的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，对于复杂表型性状与基因变异之间的关联分析具有重要意义。SNP易于实现自动化分析，被认为是继RFLP、微卫星标记之后的第三代分子标记，在遗传育种学研究中的应用前景十分广阔。

Bone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)也称GDF10，属于TGFβ超家族成员，最早由大鼠股骨中分离克隆得到，主要表达于各种骨组织、软骨组织、骨组织、气管、肺、脑等部位(1996)。BMP-3b基因主要与软骨或骨的生成发育以及胚胎发育相关(1999,2003,2005)。Adoligbe C等发现牛的BMP-3b基因外显子存在三个SNP位点，形成了同义或错义突变，分析发现这些SNP位点与牛的体尺测量性状之间显著相关(2011)。另外还有研究表明BMP-3b基因在脂肪组织中也有较高的表达水平，并且该基因以非共价复合物形式在脂肪细胞中分泌(1995,2011)，在前体脂肪细胞中的表达水平高于成熟的脂肪细胞，能够抑制脂肪细胞分化(2011)。这些研究结果说明BMP-3b基因在脂肪分化发育中起到一定的作用，并且也势必会影响机体脂肪组织的发育进而影响肉质性状和胴体性状。我们克隆了大白猪和梅山猪BMP-3b基因CDS序列，发现该基因在两个猪种之间存在一个SNP位点。大白猪和梅山猪是典型的国外猪种和典型的中国地方猪种，这两个猪种在肌内脂肪含量和大理石花纹等具体肉质性状和背膘厚等胴体性状上差别很大，推测BMP-3b的SNP位点有可能与这两个猪种之间的肉质性状和胴体性状差异相关。

发明内容

本发明的目的是筛选一种与猪肉质性状和胴体性状关联的遗传标记，通过克隆猪BMP-3b基因的CDS序列，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与猪肉质性状和胴体性状的关系，为猪肉质性状和胴体性状的标记辅助选择提供有用的标记。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明获得了大白猪和梅山猪BMP-3b基因包括第一内含子和第二外显子在内片段，片段长度为546bp的，其核苷酸序列分别如序列表SEQID NO:1(大白猪，见图2)和SEQ IDNO:2(梅山猪，见图3)所述，通过对上述2个猪种的上述序列进行blast比对提供了位于该扩增片段内部的1处核苷酸多态性(SNP)位点，该SNP位点如图4所示。其突变位点具体在翻译起始位点ATG后的546bp处(即在SEQID NO:1，SEQID NO:2和图4所示序列的第425位碱基处发生一个等位基因的突变)，我们将以下涉及到该突变位点都命名为G546A。

选择中国地方猪种梅山猪和外来的大白猪为试验材料，从猪血液中提取基因组DNA，根据猪BMP-3b基因组序列设计引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物F：5’-TCACTGAAAATAGCAAAGGT-3’(序列同SEQ ID NO：3)，

反向引物R：5’-ACTGGGCAGACAGGAGAAGC-3’(序列同SEQ ID NO：4)；

利用该引物对进行PCR扩增、PCR产物的纯化、克隆测序和序列比对分析。

筛选得到一种与猪肉质性状性状和胴体性状关联的遗传标记，该遗传标记的的核苷酸序列如下所示：

TCACTGAAAATAGCAAAGGTGCCCTCATCAGTTCAATGTGAGGATTACATGAGATAAGGAAAGCCTAGTTGGCCTGGAAGTGCTCCCTCAGTGGGACTTCCTCCTCCACTCCCTGGATGGGAAACCCTATGGCTATGGGGCCTCCCCAGGAAACTGCCTAACAGTCTATGGTCTGTCCTTCCCTCGTAGAAGTGGTCAACCAGAAGGCTGTGTATTTCTTCAACCTGACTTCCATGCAGGACTCAGAAATGATCCTCACAGCCACATTCCATTTTTACTCGGAGCCACGGTTGCCCCGGGCACGTGAGATACCATGCAAGCAGCGGGCCAAGAATGCATCATGCCGCCTGCTGCCCCTGGGTCCACCTGCACGTCAGCACTTGCTCTTCCGCAGCCTCTCCCAGAACACAGCTACACAGGGGCTRCTCCGTGGAGCCATGACCTTGCCGCCCCCACCTCGGGGCCTGTGGCAGGTCAAGGACATCTCCCCCATCGTCAAGGCCGCCCGCCGAGATGGTGAGCTTCTCCTGTCTGCCCAGT

上述序列中的R是A或G，该突变导致AlwN Ⅰ-RFLP多态性

本发明提供了一种筛选猪肉质性状和胴体性状关联的遗传标记的方法，包括以下步骤：

从猪血液中提取基因组DNA，根据猪BMP-3b基因组序列设计引物对，该引物对的序列为：正向引物F：5’-TCACTGAAAATAGCAAAGGT-3’(如SEQ ID NO：3)，反向引物R：5’-ACTGGGCAGACAGGAGAAGC-3’(如SEQ ID NO：4)；用该引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，将所得的PCR扩增片段用AlwNⅠ酶酶切分型，得到导致AlwNⅠ-RFLP多态性的核苷酸序列(大白猪序列：SEQ ID NO：1和梅山猪序列：SEQ ID NO；2)，在所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示碱基位的第425位存在一个A/G的碱基突变，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的突变位点作为遗传标记对猪肉质性状和胴体性状进行关联分析。

本发明还提供了检测上述序列G546A变异的AlwN Ⅰ-RFLP基因型分型方法。

本发明进一步提供了利用AlwN Ⅰ-RFLP方法确定不同基因型个体与猪肉质性状和胴体性状之间的相关关系的关联分析的应用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是外来血缘品种猪大白猪的BMP-3b核苷酸序列，即作为本发明遗传标记的核苷酸序列(以大白猪为例)。其中在该序列的425位碱基处发生一个等位基因突变位点，即由“A”突变为“G”。

序列表SEQ ID NO:2是中国地方血缘猪种梅山猪的BMP-3b核苷酸序列；也是作为本发明另一个遗传标记的核苷酸序列。其中在该序列的425位碱基处发生一个等位基因突变位点，即由“G”突变为“A”。

序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4是扩增BMP-3b基因的引物对的序列，该引物对的序列也是检测本发明遗传标记的引物。

图1：本发明的技术流程图。

图2：是外来血缘品种猪大白猪的BMP-3b基因的核苷酸序列；在所示序列中的425位碱基处的A/G突变位点就是导致导致AlwN Ⅰ-RFLP多态性的特异性位点。

图3：是中国地方血缘猪种梅山猪的BMP-3b基因的核苷酸序列；在所示序列中的425位碱基处G/A突变位点就是导致导致AlwN Ⅰ-RFLP多态性的特异性位点。

图4：是本发明筛选得到猪肉质和胴体性状关联的遗传标记，序列长度为540bp，该序列425位碱基处的“R”是A或G，导致AlwN Ⅰ-RFLP多态性的特异性。

图5：本发明对BMP-3b基因AlwN Ⅰ-RFLP的检测结果。琼脂糖浓度为2.5﹪。附图标记说明：图中泳道：M为DL2000Maker；泳道1和泳道2为GG型，424bp和116bp；泳道3和泳道4为AA基因型，540bp；泳道5和泳道6为AG基因型，540bp，424bp，116bp。

具体实施方式

实施例1：猪BMP-3b基因DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

试验选择外国血缘猪种“大白猪”和中国地方血缘猪种“梅山猪”(生物材料来自华中农业大学精品猪场，为常用品种)两种类型猪种为材料，根据猪BMP-3b基因基因组序列(登陆号Gene ID:100519926)设计如下引物对，具体序列如下：

正向引物F：5’-TCACTGAAAATAGCAAAGGT-3’，

反向引物R：5’-ACTGGGCAGACAGGAGAAGC-3’；

用上述引物对在“大白猪”和“梅山猪”基因组DNA中进行PCR扩增。

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件见表2所示。

表2 PCR反应条件

将所得的上述两种基因型猪种的PCR产物进行纯化和克隆后，进行序列测定，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析，发现在该序列中第425位碱基处存在一个A/G突变(互换)，该突变引起AlwN Ⅰ酶酶切位点多态性。

取5μl PCR产物加入0.5μl限制性内切酶AlwN Ⅰ(5U/μl)、1μl 10×buffer和3.5μlddH₂O，37℃酶切20min，酶切产物经2.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。当此突变处碱基都为G时存在酶切位点，酶切结果检测到两条带计为GG型(424bp+116bp)，当此突变处碱基都为A时不识别该位点，酶切结果检测到一条带计为AA型(540bp)，当A和G都存在时，酶切结果为3条带计为AG型(540bp+424bp+116bp)。结果如图3所示。

实施例2：本发明的传标记在猪肉质性状及胴体性状的关联分析及应用

为了确定猪BMP-3b基因CDS区域内的SNP与猪表型差异是否相关，选择华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室组建的399头大白猪×梅山猪F₂代资源群体(Liu>

肉质性状分析模型：Y_ij＝μ+G_i+S_j+Y_l+b_ijkl+e_ijkl

胴体性状分析模型：Y_ij＝μ+G_i+S_j+Y_l+βcov_ijkl+e_ijkl

在上述模型公式中：Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表GG、AG和AA基因型，显性效应用1代表GG和AA基因型，用-1代表AG基因型)；S_j、Y_l为固定效应，分别为性别、年效应；b_ijkl为屠宰日龄的回归系数，βcov_ijkl为屠宰体重回归系数，的e_ijkl为残差效应。

关联分析结果见表3和表4所示。其中表3为不同基因型与猪肉质性状间的统计分析结果。表4为不同基因型与猪胴体性状间的统计分析结果。如下：

表3 猪BMP-3b基因G546A位点的多态性与肉质性状的关联分析

表3的说明：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)；基因效应^*表示p<0.05；负值表示A等位基因降低表型值。

表4 猪BMP-3b基因G546A位点的多态性与胴体性状的关联分析

表4的说明：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)；基因效应^*表示p<0.05；负值表示A等位基因降低表型值。

在所检测的2000年、2003年和2004年猪的个体中，2000年112头大白猪×梅山猪F2代个体AA基因型有17头，占15.17％；AG基因型有49头，占43.75％；GG基因型有46头，40％。2003年138头大白猪×梅山猪F2代个体AA基因型有9头，占7.31；AG基因型有62头，GG基因型有67头，占48.43。2004年149头大白猪×梅山猪F2代个体AA基因型有15头，占10.06％；AG基因型有61头，占40.93％；GG基因型有73头，占48.99％。

由表3可以看出，对肉质性状来说，BMP-3b基因G546A位点与背最长肌色值、股二头肌色值、背最长肌大理石评分具有极显著的关联性(P<0.01)，与肌内脂肪具有显著关联性(P<0.05)。其中A等位基因对提高肌肉肉色具有显著的加性效应；而G等位基因对于提高肌内脂肪含量和肌肉大理石花纹评分具有显著的加性效应。

由表4可以看出，对胴体性状来说，BMP-3b基因G546A位点与平均背膘厚、眼肌高及板油重等具有显著的关联性(P<0.05)。其中A等位基因对提高眼肌高具有显著的加性效应；AG基因型个体的平均背膘厚及板油重均显著高于AA型和GG型，所以推测该基因对平均背膘厚及板油重具有显著的显性效应。

对9个中外品种的猪进行基因型分型，这些猪品种的基因型频率分布如表5所示。

表5 9个中外品种猪基因型频率分布

表5的说明：表5中的品种除大白猪是外国猪种外，其余品种为中国地方猪种。

主要参考文献

1.Takao M,Hino J,Takeshita N,Konno Y,Nishizawa T,Matsuo H,KangawaK.Identification of rat bone morphogenetic protein-3b(BMP-3b),a new member ofBMP-3.Biochemical&Biophysical Research Communications 1996,219(2):656-662.

2.Hino J,Matsuo H,Kangawa K.Bone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)geneexpression is correlated with differentiation in rat calvarialosteoblasts.Biochemical&Biophysical Research Communications 1999,256(2):419-424.

3.Hino J,Nishimatsu S-i,Nagai T,Matsuo H,Kangawa K,NohnoT.Coordination of BMP-3b and cerberus is required for head formation ofXenopus embryos.Developmental Biology 2003,260(1):138-157.

4.Chandar N,Swindle J,Szajkovics A,Kolman K.Relationship of bonemorphogenetic protein expression during osteoblast differentiation to wildtype p53.Journal of Orthopaedic Research 2005,23(6):1345-1353.

5.Hino J,Miyazawa T,Miyazato M,Kangawa K.Bone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)is expressed in adipocytes and inhibits adipogenesis as a uniquecomplex.International Journal of Obesity 2011,36(5):725-73。