筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统及其构建方法

摘要

本发明提供了一种筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统，所述荧光报告系统的表达框架的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了所述荧光报告系统的构建方法。本发明能够有效筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统及其构建方法。

背景技术

环状RNA(CircularRNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的一类具有特殊功能的RNA分子，具有闭合环状结构，是客观大circRNA由前体RNA通过剪切、然后反向剪接形成。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。

目前对于环状RNA的具体功能尚未有明确，只有几种假定的说法：(1)环状RNA可以作为“sponge”(海绵)吸miRNA，抑制其功能；(2)环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；(3)环状RNA能与蛋白质结合，抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；也有研究者报道环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成，对于病毒及人工合成的环状RNA翻译蛋白质的报道较多；对于人类等高等生物中环状RNA翻译蛋白质的发现较少，原因可能是由于之前对环状RNA的研究认识本来就不多，另外缺少有效的规模化筛选环状RNA翻译蛋白的工具及方法。

近来研究开始关注于circRNA可能在疾病病理方面起到的作用。例如，环状ANRIL(cANRIL)是长链非编码RNAANRIL的环状拼接形式，其在人类细胞中的表达与该位点上几个可能影响ANRIL拼接的SNP有关，能调节INK4/ARF的水平并增加动脉粥样硬化的风险。这项研究充分证明circRNA与疾病的发生存在关联，并能很好地作为疾病新型生物标记。

此外，更多的证据显示，环状RNA在miRNA水平的微调上起着非常重要的作用，通过竞争结合miRNA来调控基因的表达。而与疾病关联miRNA的相互作用则说明环状RNA能够参与疾病调节。

基因是具有遗传效应的核苷酸序列，研究特定分子的功能中通过克隆表达基因对研究者来说具有重要意义。为了使克隆的基因在宿主细胞中大量表达，就要依据不同的实验目的选择不同的表达系统，构建不同的表达框架。

附图说明

图1是本发明的筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统表达框架。

图2是利用本发明的荧光报告系统筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的结果。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统。

本发明的另一个目的在于提供上述荧光报告系统的构建方法。

本发明还提供了上述荧光报告系统的构建方法。

为了实现以上目的，本发明提供了一种用于筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统，所述荧光报告系统的表达框架的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

本发明还提供了一种筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)通过全基因化学合成，获得如SEQIDNO：1所示的目标核苷酸序列；

(2)通过NheI和XhoI，将步骤(1)获得的所述目标核苷酸序列连接到表达载体pcDNA3.1(+)中。

作为一种优选的实施方式，所述步骤(2)中，采用PCR扩增的方法在设计引物的时候引入NheI和XhoI酶切位点序列。

更优选地，所述引物的序列为：

primer-F0：5’–GCGCTAGCGAGTTCTAAAATTAAACTA-3’

primer-R0：5’–CGCTCGAGCTCTAAAATTATTCGTTCATGGCTT-3’。

作为一种更优选的实施方式，所述PCR扩增的反应体系如下：PCR为30μl总体系，具体是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各1.5μl，化学合成的基因框架SEQIDNO:1模板1μl，用灭菌去离子水补足30μl体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，62℃30s退火，72℃延伸2min，共30个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后4℃保存。

作为一种更优选的实施方式，将所述PCR扩增的产物回收纯化，然后对其用NheI、XhoI酶切后，同时pcDNA3.1(+)载体也用同样的内切酶切割，然后将酶切后的PCR产物构建到酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中。

本发明提供的方法通过采用一种能使线性RNA发生环化及环化后目标序列的阅读框序列和绿色荧光蛋白(GFP蛋白)融合的策略构建出了能有效筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统，有效地解决了生物体内环状RNA翻译蛋白质的筛选问题，为发现新的由环状RNA翻译的功能性蛋白的研究提供了一种高效、准确的报告系统工具和方法。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于此。如未特别指出，本发明实施例中所用试剂、仪器均可通过现有技术获得。

一、筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统表达框架的设计

如图1和SEQIDNO：1所示，本发明设计筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统表达框架包括上游框架序列、环状RNA插入酶切位点、下游框架序列。该框架的碱基序列如SEQIDNO：1所示。其中，该框架的碱基序列中，第1～515bp为上游框架序列(碱基长度共515bp)，第516～539bp为环状RNA插入酶切位点序列(灰色标注)，依次是kpnI、BamHI、EcoRI3个常用酶切位点，用于插入测试环状RNA的位点；第540～1260bp为下游游框架序列(碱基长度共721bp)，整个框架由1260个核苷酸组成。其中第253～515bp(263bp)为绿色荧光蛋白GFP编码C端核苷酸序列(双线标注)；其中第540～990bp(451bp)为绿色荧光蛋白GFP编码N端核苷酸序列(单线标注)。

二、环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统表达框架的构建

根据上述环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统表达框架，通过全基因化学合成，获得目标核苷酸序列，然后通过NheI和XhoI将框架序列连接到表达载体pcDNA3.1(+)中。

具体的实施方案如下：

将目标框架核苷酸序列SEQIDNO：1合成(上海捷瑞生物公司)之后，采用PCR扩增的方法在设计引物的时候引入NheI和XhoI酶切位点序列，设计的引物的序列为：

primer-F0：5’–GCGCTAGCGAGTTCTAAAATTAAACTA-3’(SEQIDNO：2)

primer-R0：5’–CGCTCGAGCTCTAAAATTATTCGTTCATGGCTT-3’(SEQIDNO：3)

PCR扩增的反应体系如下：PCR为30μl总体系，具体是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各1.5μl，化学合成的基因框架SEQIDNO.1模板1μl，用灭菌去离子水补足30μl体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，62℃30s退火，72℃延伸2min，共30个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后4℃保存。

PCR产物通过使用胶回收试剂盒回收纯化，然后PCR产物用NheI、XhoI酶切后，同时pcDNA3.1(+)载体也用同样的内切酶切割，然后将此框架构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建好的载体命名PcDNA-cirGFP-Report。

三、筛选鉴定环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统的使用

以环状RNAhsa_circ_0041407为案例描述如下：

1.在circBase数据库(http://circrna.org/cgi-bin/listsearch.cgi)找到环状RNAhsa_circ_0041407的序列(参见SEQIDNO：4)，总序列长度为1059bp；

2.将目标序列在ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)在线软件中预测环状RNA翻译蛋白质的阅读框序列，灰色标注；划线标注“ATG”及“TAA”分别为翻译起始密码子和终止密码子(如图2和SEQIDNO：4所示)；

3.将终止密码子前面的序列(图2序列中前面灰色划线标注)转移到序列的末端，生成的序列如SEQIDNO：5和图3所示；

4.将转变后的序列SEQIDNO：5通过全基因化学合成的方法获得目标核苷酸片段；

5.通过BamHI和EcoRI酶切位点将环状RNA转变后的序列SEQIDNO：5连接到环状RNA翻译蛋白质的荧光报告载体PcDNA-cirGFP-Report中。

步骤5的具体实施方案如下：

将目标框架核苷酸序列SEQIDNO：5合成(上海捷瑞生物公司)之后，采用PCR扩增的方法在设计引物的时候引入BamHI和EcoRI酶切位点序列，设计的引物的序列为：

primer-F1：5’-CCGGATCCTAAATTTGCAATTTTATATTT-3’(SEQIDNO：6)

primer-R1：5’-GCGAATTCAAAAAATGGGATGCAAAAAAAAAAAAAAGGCGG-3’(SEQIDNO：7)

PCR扩增的反应体系如下：PCR为30μl总体系：具体是2×PCRMIX15μl，10mM上下游引物各1.5μl，化学合成的基因片段SEQIDNO:51μl，用灭菌去离子水补足30μl体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，56℃30s退火，72℃延伸1min，共30个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后4℃保存。

PCR产物通过使用胶回收试剂盒回收纯化，然后PCR产物用BamHI和EcoRI酶切后，同时报告载体PcDNA-cirGFP-Report也用同样的内切酶切割，然后将此SEQIDNO：5序列构建到本发明的环状RNA翻译蛋白质的荧光报告载体PcDNA-cirGFP-Report中，构建好的载体命名为PcDNA-cirGFP-Report-1059。

6.细胞转染

将上述PcDNA-cirGFP-Report-1059载体用lipo2000转染试剂转染到HEK293细胞中(以PcDNA-cirGFP-Report空载体为对照)，载体转染浓度1μg/ml，然后培养48小时后采用荧光显微镜拍照，观察绿色荧光GFP蛋白的表达情况。荧光拍照结果参见图4。荧光照片结果显示PcDNA-cirGFP-Report-1059载体转染细胞组有明显的绿色荧光出现，PcDNA-cirGFP-Report空载体对照组没有绿色荧光出现，说明本发明的环状RNA翻译蛋白质的荧光报告系统PcDNA-cirGFP-Report载体在连入环状RNA后能够有效对环状RNA翻译蛋白质作出有效的可视化筛选检测。