DNA条形码制备方法及草莓疫霉红心病菌DNA条形码

摘要

本申请公开了一种DNA条形码制备方法及草莓疫霉红心病菌DNA条形码。本申请的制备方法，包括用高通量测序技术对靶标菌株基因组DNA进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析，采用系统进化树分析基因组DNA中各基因片段进化关系，获得靶标菌株与同属菌株的相似度大于或等于95％、小于100％，片段不大于1000bp的单拷贝基因片段，对单拷贝基因片段进行遗传距离分析，能真实反映亲缘关系的即靶标菌株DNA条形码。本申请的制备方法，利用高通量测序技术对基因组DNA进行全面分析，并用系统进化树和遗传距离分析，获得DNA条形码；为DNA条形码制备提供了一种简单、有效途径；获得的DNA条形码能最有效表征靶标菌株。

说明书

技术领域

本申请涉及DNA检测领域，特别是涉及一种DNA条形码的制备方法及草 莓疫霉红心病菌的DNA条形码。

背景技术

疫霉属包含100余个种，是最主要的植物病原真菌。草莓疫霉红心病菌 Phytophthorafragariaevar.fragariae(以下简写为P.fragariae)，是引起草莓属植物 红心病的病原菌，其寄主包括草莓属和部分悬钩子属植物，例如罗甘莓和黑莓 等，引起的症状有植株矮小、叶片和叶柄萎缩、根茎红心甚至整株植株死亡。 游动孢子是它们侵染植物主要的传播途径。不能通过空气传播，但孢子可以在 土壤和植物材料上存活很久，通过排水、灌溉进行扩散和传播。一旦感染，可 以在数年内蔓延至整个果园，严重影响了水果生长。在欧盟、美国和中国等都 被列为检疫性有害生物。

草莓疫霉红心病菌是疫霉属中的重要植物病原菌，对农作物危害巨大。目 前对两者的检测方法主要还是传统的形态学检测。因此，亟需一种简单、快速、 有效地区分草莓疫霉红心病菌的检测或鉴定手段。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异、易扩 增且相对较短的DNA片段。目前，纵观动物、植物、微生物等的DNA条形码 的制备思路和方法，绝大多数都是以常见的ITS片段、线粒体色素氧化酶基因 Ⅰ、核糖体大亚基、核糖体小亚基、RNA酶亚基Ⅱ、翻译延长因子、线粒体小 亚基操纵子、β-维管束蛋白、肌动蛋白、几丁质合成酶基因、钙调蛋白、热激 蛋白90等DNA片段作为候选片段，其对物种区分鉴定都有一定的有限性，例 如种内、种间差异不明显，没有明显的条码间隔，近似种区分不开，检疫性物 种与非检疫性物种无法区分等。基因组DNA是一个庞大的数据库，从理论上来 说，其应该具有大量的可以代表物种，且符合要求的DNA条形码；但是，目前 暂没有相关的研究和报道。对于草莓疫霉红心病菌来说，目前也还没有其DNA 条形码的相关研究和报道。因此，为了进一步统一和规范草莓疫霉红心病菌的 检测和鉴定，亟需对草莓疫霉红心病菌的DNA条形码进行研究和开发。

发明内容

本申请的目的是提供一种DNA条形码的制备方法，以及所制备的草莓疫霉 红心病菌的DNA条形码。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种DNA条形码的制备方法，包括采用高通量测序 技术对靶标菌株的基因组DNA进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析， 然后采用系统进化树分析基因组DNA中各个基因片段的进化关系，获得靶标菌 株与同属其它菌株的相似度大于或等于95％、而小于100％，并且片段不大于 1000bp的单拷贝基因片段，对所述单拷贝基因片段进行遗传距离分析，其中能 够真实反映亲缘关系的单拷贝基因片段即所述靶标菌株的DNA条形码。

需要说明的是，本申请的关键在于，有效的利用高通量测序技术，对基因 组DNA进行全面的分析，并采用系统进化树分析，最后利用遗传距离分析获得 DNA条形码。采用本申请的制备方法获得的DNA条形码，能够有效的表征靶 标菌株，为靶标菌株的DNA条形码制备提供了一种最有效的解决方案。本申请 中，能够真实反映亲缘关系的单拷贝基因片段是指，采用该单拷贝基因片段进 行进化关系分析时，其与同属其它种之间的遗传距离更近，属于同一分支，而 与其它属的菌株之间的遗传距离更远，属于不同分支，则判定该单拷贝基因片 段能够真实反映亲缘关系。

优选的，生物信息学分析包括基因组拼接和基因注释。

需要说明的是，本申请进行基因组拼接和基因注释是为了方便后续的对各 基因片段进行系统进化树分析和遗传距离分析；因此，与系统进化树分析和遗 传距离分析相关的信息都需要进行注释。可以理解，为了更有效的利用全基因 组测序的信息，也可以对其进行更为全面的生物信息学分析，在此不做具体限 定。

优选的，系统进化树分析采用Mega5.0软件进行。

优选的，遗传距离分析包括，以其它种属的菌株作为外群，采用靶标菌株 以及靶标菌株同属其它菌株的单拷贝基因片段进行系统进化关系分析，具体的， 按照最大似然法构建系统进化树，其中符合亲缘关系的单拷贝基因片段即靶标 菌株的DNA条形码。

本申请的另一面公开了一种草莓疫霉红心病菌的DNA条形码，DNA条形 码为SeqIDNo.1至SeqIDNo.28所示序列的至少一条。

需要说明的是，草莓疫霉红心病菌的基因组DNA虽然是已经公开了的，但 是，并不是所有的基因片段都适用于DNA条形码；本申请创造性的提出采用遗 传距离分析，进而从庞大的基因组数据中挑选出最能代表草莓疫霉红心病菌， 并且符合DNA条形码使用需求的基因片段，即SeqIDNo.1所示序列。

本申请的另一面公开了本申请的DNA条形码在草莓疫霉红心病菌的检测或 鉴定中的应用。

可以理解，本申请的DNA条形码可以直接使用，用于草莓疫霉红心病菌的 检测或鉴定。

本申请的另一面公开了一种用于草莓疫霉红心病菌检测或鉴定的试剂盒， 试剂盒中包括，含有本申请的DNA条形码的计算机可读载体，以及用于草莓疫 霉红心病菌基因组DNA扩增的试剂。

本申请的另一面公开了一种用于草莓疫霉红心病菌检测或鉴定的装置，装 置中记载有本申请的DNA条形码，装置通过将待测样品的DNA序列与DNA 条形码进行比较分析，判断待测样品是否为草莓疫霉红心病菌。

可以理解，本申请的DNA条形码可以直接用于草莓疫霉红心病菌的检测或 鉴定，其作为试剂盒使用时，DNA条形码是记载于一种计算机可读载体上的， 通过读取其中的DNA条形码信息，再利用现有的基因分析、比对软件，就可以 判断测序获得的样品是否与本申请的DNA条形码相同，或者其同源性为多少， 从而判断样品中是否含有草莓疫霉红心病菌。当然，也可以直接将本申请的DNA 条形码直接输入一个专门用于草莓疫霉红心病菌检测或鉴定的装置，这样可以 更加针对性的用于草莓疫霉红心病菌的检测或鉴定。

本申请的有益效果在于：

本申请的DNA条形码制备方法，利用高通量测序技术对基因组DNA进行 全面的分析，并利用系统进化树和遗传距离分析，获得DNA条形码；为DNA 条形码的制备提供了一种简单、有效的途径；所获得的DNA条形码能够最有效 的表征靶标菌株。本申请的制备方法，从全基因组水平进行筛选，克服了从常 用片段中筛选候选片段的局限性，从遗传进化的角度寻找更有效区分和鉴定物 种的DNA条形码。

附图说明

图1是本申请实施例中P.fragariae片段化测序和mate-pair测序数据质量， 其中3K为全基因组测序时构建的3K长度的mate-pair文库的测序质量结果，5K 为全基因组测序时构建的5K长度的mate-pair文库的测序质量结果，Run1、Run2 和Run3分别为构建的三个400bp的fragment文库的片段化测序文库的测序质量 结果；

图2是本申请实施例中四个疫霉属物种基因家族聚类结果文氏图；

图3是本申请实施例中orthologous基因家族相似度分布图；

图4是本申请实施例中疫霉属及其近缘种系统进化关系，图中A为疫霉属 各种，B为卵菌纲各种，C为Cornichon基因。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料

使用的P.fragariae菌种编号为309.62，来自荷兰真菌多样性研究中心CBS。 由C.J.Hickman分离自苏格兰水果上，寄主为草莓。

二、方法

1、基因组DNA制备

基因组DNA的提取采用QIAGEN植物和真菌基因组制备试剂盒，操作方 法如下：

(1)从平板培养基上刮取菌丝，尽量避免刮到培养基，液氮研磨；

(2)液氮研磨完成后，将磨碎的粉末转移至1.5mL离心管中，加入400μL BufferAP1与4μLRNaseA，涡旋，混匀后，65℃水浴10min，期间颠倒2～3 次；

(3)取出离心管，直接加入130μLBufferAP2，振荡混匀，并在冰上培养 5min；

(4)冰上培养后，离心，取上清，将上清液移至QIAshredderminispincolomn 中，20000g即14000rpm，离心2min；

(5)弃上柱部分，向过滤后的液体中加入1.5倍体积的BufferAP3/E，混 匀滤出液；

(6)取步骤(5)的混合液650μL放入DNeasyminispincolumn离心1min， 离心速度≥6000g即≥8000rpm，并弃滤出液，对步骤(5)剩余的混合液重复 此步，使DNA全部吸附于DNeasyminispincolumn上；

(7)将DNeasyminispincolumn吸附柱放入一个新的2mL收集管中，加 入500μL的BufferAW，≥6000g即≥8000rpm，离心1min，弃滤出液；

(8)再加入500μLBufferAW，再20000g即14000rpm，离心2min；注 意：取DNeasyminispincolumn时，不能使其接触下步的滤液；将spincolumn 转移到新的1.5mL或者2mL离心管中，并加入100μL/50μLBufferAE洗脱， 室温下静置5min，再≥6000g条件下离心1min；重复此步操作。

(9)使用NanoDrop2000和Qubit2.0检测制备DNA的质量和浓度。Qubit 2.0定量浓度为79.5ng/μL，NanoDrop2000定量为82.4ng/μL，A260/A280为1.89， A260/A230为2.2。

2、建库、模板制备及测序

采用双端测序和双末端测序的方法对基因组进行denovo测序。双端测序即 片段化测序，是对基因组片段化后的片段进行建库，对随机片段进行测序，在 IonTorrentpersonalgenomemachine(PGM,LifeTechnologies)上进行测序，使用 318测序芯片，400bp读长测序试剂盒。双末端测序即mate-pair测序，是将全 基因组打断成3K和5K大小的片段，分别构建3K和5K的文库，在Illumina HiSeq2500上进行测序，只测末端，将片段化测序拼接的小片段的末端拼接起 来。

(1)PGM小片段建库和测序

片段化测序文库的制备使用IonXpress^TMFragmentLibraryKit(Life Technologies)，选择100ng的建库方法。连接建库接头，使用E-GeliBasePower System(LifeTechnologies)和E-GelSizeSelect2％预制胶试剂盒(Life Technologies)进行目的片段的回收，回收长度约为480bp。纯化后使用Agilent 2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies)和HighSensitivityDNAkit(Agilent Technologies)测定片段回收长度和浓度，进行油包水PCR扩增，在OneTouch2 (LifeTechnologies)仪器上完成克隆，使用试剂盒为400bp。对PCR产物进行阳 性磁珠的富集，形成模板。上机测序，使用3张318v2测序芯片(Life Technologies)、400bp读长IonSequencingKitv2.0(LifeTechnologies)测序试剂 盒。具体包括如下步骤：

①酶切

根据获得的DNA浓度，按照1μg的量计算酶切添加体系。 1000ng/Conc.＝VolumegDNA，加水补齐至35μL，加入5μL10×buffer，10μL Enzyme，总共50μL的酶切体系，Pipet混匀，在37℃干浴上消化。选择13min 作为400bp的打断时间。结束后加入5μLstopbuffer，vortex。第一次纯化加入 1.8倍体积，即90μLAMPurebeadsbuffer，pipet混匀5次，室温放置5min， 至于磁力架(InvitrogenDYNAL)上，3min，磁珠会吸附在侧壁上，弃去上清。 每管加入500μL70％乙醇洗，放置5min。再重复用70％乙醇洗一次，待酒精蒸 发干后，flash甩下珠子。加入25μL低盐LowTE或水，Pipet混匀，放入磁力 架，放置3min，转动1-2次后，吸出上清至1个新的EP管中，核酸即溶解于 此上清中。

②加接头

在200μL的PCR管中配置连接接头的体系，分别有5个不同颜色的试剂， 配置总体积达到100μL，在PCR仪中完成加接头程序。连接接头的体系为：DNA 25μL，10×LigaseBuffer10μL，Adapters10μL，dNTPMix2μL，Nuclease-free Water41μL，DNALigase4μL，NickRepairPolymerase8μL。加接头程序为： 25℃恒温15min，72℃保温5min，然后4℃待机。

同样采用磁珠法纯化加接头的产物，去除未连接的接头。具体的，加入1.4 倍体积，即140μL的AMPurebeadsbuffer，室温静置5min，放入磁力架3min， 弃上清。加入70％乙醇洗一次，磁力架上静置3min，弃上清，待乙醇挥发干， flash甩下。加入20μLLowTE，pipet混匀，放磁力架3min，吸出上清至200μL PCR管中。

③胶回收

E-gel采用2％SizeSelect(R25010)预制胶。对50bpDNAladderMarker进 行40倍稀释。在M处点入10μLmarker，尽量隔1个孔的位置点样品，每个样 品点2个孔，其余不用的孔用25μL水补齐。400bp的片段大约需要19min进 入用于回收的孔边缘；具体的，看到350bp的条带到孔边缘，继续电泳1min， 400bp的片段即在孔边缘，此时下方回收样品孔中加入10μL水准备接收目的片 段，再继续45s，停止后吸出孔中液体至200μLPCR管中，再加入10μL冲洗 吸出。盖上G-gel盖子，检查400-450bp的条带是否正确。

④目的片段PCR扩增

取出30μLDNA，加水补齐至50μL，将扩增体系与DNA在1.5mLEP管中 混合，此时共计260μL，vortex，flash，扩增5个cycles。本例的扩增体系为： PlatinumPCRSuperMixHighFidelity200μL，LibraryAmplificationPrimerMix10 μL，Unamplifiedlibrary50μL。

同样的，采用磁珠法纯化PCR扩增产物。具体的，加入1.5倍体积，即390 μL的beadsbuffer，静置5min，放入磁力架3min，弃上清，加入500μL70％ 乙醇洗涤2次，待晾干后，flash，加入20μLLowTE，放入磁力架3min，吸出 上清至一个新1.5mLEP管中。

⑤检测

Qubit2.0检测：配置Qubit检测体系，在专用管中加入199μLbuffer和1μL Dye，弃1μL，用1μL文库样品补齐，vortex，常温避光放置2min，检测。

Aglient2100检测：检测需1ng左右的量，对DNA进行稀释。取出专用胶， 室温平衡30min。取出1张芯片，在G黑圈孔中加入9μL胶，拔出针管压制器 充满气体，对准G黑圈孔加压1min使其凝固。其余3个G孔内加入9μL胶。 剩余孔内加入5μLmarker，加入1μLAglient2100进行定量试剂盒配套的ladder， 样品孔加入1μL样品，剩余不用的孔内加入1μLmarker补齐。在专用离心机上 离心1min，期间用1mL水专用空芯片上清洗机器，立即上机检测。选择“Assay” 键，“Start”。2100检测的范围是100～500ng，如果样品浓度太高，需要稀释。

对比两种检测方法获得的数据情况。Aglient2100可以看到样品片段化和目 的片段位置及浓度，根据检测的结果确定上机OneTouch的稀释倍数，使终浓度 接近26ng/mL。根据Qubit检测结果对稀释倍数进行计算。稀释倍数＝检测浓度 (ng/μL)/读长(kb)×1.515。本例测得的浓度为0.378ng/μL，稀释倍数约为 49倍。

⑥模板制备

打开电源开关，打开离心机盖，RecoveryTubes(IonPGMTMTemplateOT2 Supplies400)放置于IonOneTouch2离心收集器的转子中，随后将Recovery Routers(IonPGMTMTemplateOT2Supplies400)放置于相应位置，手动盖上 离心机盖；

将IonOneTouch^TM2AmplificationPlate(IonPGMTMTemplateOT2Supplies 400)放置于加热模块中，盖上IonOneTouch^TMLid，导管固定于上端的卡口和 正面右上角的支架上，将AmplificationPlate的注射针垂直插入IonOneTouch^TMDLInjectorHub，直至接触到底部的RecoveryRouter，然后松开注射针。

将IonOneTouch^TMOil瓶(IonPGMTMTemplateOT2Solutions400)上下 颠倒10次，倒入任意一个新的IonOneTouch^TMTube中，约1/2满，相应位置 拧紧；IonPGMOT2RecoverySolution(IonPGMTMTemplateOT2Solutions400) 倒入另一个新的IonOneTouch^TMTube中，约1/3满，相应位置拧紧；

按照如下表格顺序室温配置体系，将上述体系涡旋震荡5s，离心；

将IonPGM^TMTemplateOT2400IonSphere^TMParticles最大速漩涡混匀 1min，上下吸打5次后，吸取100μL，加入液相体系中，室温放置备用；将Ion PGMOneTouch^TMPlusReactionFilter(IonPGMTMTemplateOT2Reactions400) 置于15mL离心管上，将配制好的液相体系漩涡混匀5s，短暂离心2s；用1000 μL移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔注入reactionfilter， 注意移液头与样品孔紧密接触插紧；

用1000μL移液器从此孔缓慢加入1000μLIonOneTouch^TMReactionOil， 更换一个新的1000μLUniversalFitFilterTip移液头，再缓慢加入500μLIon OneTouch^TMReactionOil；将加样孔置于左侧，顺时针倒转reactionfilter，避免 管内导管接触反应液相；将reactionfilter插入IonOneTouch^TM相应位置，边缘凸 起位置朝向自己；在系统显示屏上选择Run，选择IonPGMTMTemplateOT2400 kit，然后选择Expert，最后点击Next开始运行；

运行结束后，打开离心收集器盖，用清洁纸巾将盖子上的液体擦拭干净， 拿掉RecoveryRouter，小心缓慢将RecoveryTubes取出放于板架上，模板ISP 位于RecoveryTubes底部外侧。

⑦IonOneTouchTMES的操作及阳性模板富集

沿远离沉淀一侧，自液面开始小心将两管RecoveryTubes中的上清液吸掉， 各剩余约50μL；取一个新的1.5mL的Non-StickTube，将RecoveryTubes中剩 余50μL液体吹打10次后吸入其中；在两管RecoveryTubes中各加入100uLWash Solution(IonOneTouch^TM400SolutionsKitv2)，吹打混匀后，吸入1.5mL Non-StickTube中；在1.5mLNon-StickTubes中再加入1000uL200μLWash Solution，最大转速漩涡振荡10s混匀，15500g离心3min；沿远离沉淀一侧， 自液面开始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩涡振荡10s混匀；

配制好新鲜的1MNaOH；取一个1.5mL普通离心管，按如下表格配制 Melt-OffSolution；

吸取130μLMyOne^TMBeadsWashSolution到一个新的1.5mL的Non-Stick Tube中；将MyOne^TMStreptavidinC1Beads最大转速漩涡震荡30s， 取13.0μL到上述1.5mL的Non-StickTube，漩涡振荡混匀30s，短暂离心2s；

将离心管置于DynaMag^TM-2magnet上2min或至溶液澄清，小心吸掉上清， 避免碰触沉淀；将离心管从DynaMag^TM-2magnet上取下，吸取130μLMyOne ^TMBeadsWashSolution到离心管中，漩涡振荡悬浮MyOne^TMStreptavidinC1Beads；

取一个8-wellstrip(IonPGMTMTemplateOT2Supplies400)，方头永远放 在面朝自己的左面，从左到右依次编号为1到8，按如下表格在8-wellstrip中加 入相应试剂。

将8-wellstrip放入IonOneTouch^TMES前方白色模块中的凹槽中，方头在 左，紧靠在凹槽右侧；取一个新的Tip(IonPGMTMTemplateOT2Supplies400) 放入TipLoader中，从支架上取下TipArm插入TipLoader中，用力向下按紧1 s，松开，取下TipArm放回支架上，新的Tip已装在TipArm下方；在TipArm 下方的洞中放一个开口的0.2mL的PCR管，里面加入NeutralizationSolution10 μL(IonPGMTMTemplateOT2Solutions400)；打开IonOneTouch^TMES电源， 按Start/Stop键，运行过程中显示屏上一直显示“run”，IonOneTouch^TMES自 动开始阳性模板富集；

富集过程结束是，IonOneTouch^TMES会有蜂鸣提示，并且显示屏显示 “End”，整个过程约40min；结束后关闭电源；

取出0.2mLPCR管扣上盖子，15500g离心3min；沿远离沉淀一侧，从液 面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；加入200μLIonOneTouch^TMWash Solution，上下吹打混匀10次，15500g离心3min，沿远离沉淀一侧，从液面开 始小心吸掉上清，剩余10μL在管底；加入100μLIonOneTouch^TMWash Solution，上下吹打混匀10次，若不立即进行后续的测序，可置于4℃保存2～3 天。

⑧上机测序

氯片清洗：将W1氯片清洗瓶用每次50mL18MΩ去离子水漂洗3次，备 用；W1清洗瓶用每次50mL18MΩ去离子水漂洗3次后，加满250mL18MΩ 去离子水，备用；将1L的容器用每次100mL18MΩ去离子水漂洗3次，装满 1L18MΩ去离子水，放入一片PGMCleaningTablet(IonPGM^TMSequencing Solutions400Kitv2)，静置10min；10min后，加入1mL1MNaOH,混匀；用 0.22μm滤器过滤250mL以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中；打开PGM电源， 氩气输出气压调至30psi；PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座 上有一块旧芯片；按屏幕提示，勾选Chloritecleaning，点击Next；通过后按提 示将W1氯片清洗瓶拧上W1位；将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各 自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液；去掉前端四种dNTPs尖底管，不要 取下吸管，在吸管下放置废液缸；按next，进入清洗程序；第一轮清洗结束后， 用18MΩ去离子水涮洗W1位的吸管，将含250mL18MΩ去离子水的W1清洗 瓶拧上W1位，按next进入第二轮清洗程序；第二轮清洗结束，整个PGM清洗 结束，可进入初始化步骤。

18MΩ去离子水清洗：W1清洗瓶用每次50mL18MΩ去离子水漂洗3次后， 加满250mL18MΩ去离子水，备用；打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi； PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；按屏幕 提示，勾选18-MOhmwatercleaning，点击NEXT；通过后按提示将W1清洗瓶 拧上W1位；将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管， 清空废液瓶的废液；去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放 置废液缸；按next，进入清洗程序，18MΩ去离子水清洗只进行一轮，结束后可 以开始PGM初始化。

⑨PGM初始化

将试剂盒中dNTPs(IonPGM^TMSequencingReagents400Kitv2)取出，在 冰上融化备用；将W2试剂瓶(IonPGM^TMSequencingSupplies400Kitv2)用 每次200ml18MΩ去离子水漂洗3次，在上部接线处用记号笔标记，加入18M Ω去离子水至标记处；将整瓶IonPGM^TMSequencing400v2W2Solution倒入加 了18MΩ去离子水的W2试剂瓶中；加100mMNaOH140μL到W2试剂瓶中， 盖上瓶盖，上下倒置数次混匀后备用；W1、W3(IonPGM^TMSequencingSupplies 400Kitv2)试剂瓶用18MΩ去离子水漂洗，每次50mL，漂洗3次；在W1试 剂瓶中加入350μL100mMNaOH溶液，盖上瓶盖备用；在W3试剂瓶中1XW3 Solution至50mL刻度处，盖上瓶盖备用；在主菜单界面中选择Initialize，保持 芯片座上有一块旧芯片，按Next检测是否有漏气；按Next，根据屏幕提示，穿 戴新的乳胶手套，将新的长吸管(IonPGM^TMSequencingSupplies400Kitv2)换 到W2位置的盖上，拧上制备好的W2试剂瓶；按Next，同样将制备好的W1 和W3试剂瓶拧上各自的位置，确认密封无误；按Next,开始第一阶段的初始化 过程，大约需要30min；

将冰上融化的四种dNTPs漩涡振荡混匀，短暂离心后放置于冰上；在四个 50mL的尖底离心管标记上dGTP,dCTP,dATP和dTTP；用带滤芯的移液头在 每管中加入相应的dNTP20μL，冰上放置备用；第一阶段的初始化成功后，拔 去前面dNTP溶液管位置上的旧的吸管，移走废液缸；穿戴新的乳胶手套，在4 个dNTP溶液管位置插上新的吸管；对应符号，拧上相应的dNTP溶液管，确保 密封；按Next,进行最后的初始化，在所有初始化程序成功后，按Next结束初 始化，可进入最后的测序反应。

⑩测序上样准备及测序

浏览器地址栏输入2mnnq1，进入TorrentBrower，点击进入Planning页； 根据测序类型点击相应类型的PLANNEWRUN选项,进入设定页面,第一部分 是Application,可以在此修改需要的测序类型；点击NEXT，进入KIT设定，选 择正确的librarykit,Templatingkit,sequencingkit(400bpDNA文库，选择IonPlus Fragmentkit,IonPGMTemplatingOT2400kit)Flows：400读长选择850；如果 使用Barcode,在BarcodeSet里选择相应的Barcode数据库；最后选择相应的Chip Type；直接点击Plan，输入RUNName和SampleName,最后点击Plan完成程序 设定。

⑩芯片的上样准备及测序

转移一半的模板ISP至200μLPCR管中；如果转移过来的样本ISP模板体 积大于50μL，则15,500g离心后，移去多余的上清，剩余50μL；小于等于50 μL则直接到下一步；漩涡振荡ControlIonSphere1min,短暂离心2s，然后加5μL 到样本模板ISP的PCR管中；再加AnnealingBuffer150μL，漩涡振荡混匀，15,500 g离心2min；避开离心外侧，自上而下小心移去上清，剩3μL的溶液于管底； 加入3μL的SequencingPrimer到含3μL模板ISP的PCR管中，用移液器吸打 充分混匀；热循环仪上，95℃2min，37℃2min处理，室温放置备用；在PGM 主菜单按Run，确保旧的芯片在芯片座上，按Next选择测序试剂盒类型，继续 按Next检测通路是否密封；

检测通过后，脱掉乳胶手套将手指在接地金属板上碰触一下，取下旧芯片， 将新的314芯片从包装袋中取出，放置于芯片座上；合上芯片上模块，操作屏 上按Next，按提示扫描芯片包装袋的条形码，确认后按Chipcheck进行芯片检 测；检测通过后，将待测芯片置于Ioncentrifugeadapter上，重新替代入旧芯片， 合上芯片上模块；在引物杂交反应结束后的含样本ISP模板的PCR管中加入1ul 的SequencingPolymerase，混匀室温静置5min；45度手持芯片，用移液器垂直 于芯片上样孔，尽量吸掉芯片中的液体；将待测芯片倒置于Ioncentrifugeadapter 上，平衡的旧芯片同样倒置于另一个adapter上，芯片的突出部分都向内，离心 5s，314芯片离心请一定使用旧314芯片配平；在将倒置的待测芯片重新正置于 adapter上前，用无尘纸仔细擦拭干adapter，待测芯片已准备完毕，可以上样； 用移液器吸取所有的室温放置5min制备好的ISP溶液，大约7μL；待测芯片水 平放置于Ioncentrifugeadapter上，将带有处理完毕的ISP溶液的移液头垂直插 入上样孔，松开移液器量程调节锁，缓慢调小量程，保持每秒1μL的速度，直 至1μL量程处，拔掉移液头；将待测上样后芯片置于VWR离心机上，保证有 平衡旧芯片，芯片的突出部都向内，离心30s；将芯片连底座一起取下，45度 手持，移液器量程调制5μL，垂直插入上样孔，反复缓慢吸打混匀芯片中液体3 次，避免产生气泡，放回VWR离心机，芯片突出部都向外，离心30s；重复混 匀1次，芯片突出部向内，离心30s；45度手持芯片，用移液器垂直于芯片上 样孔，尽量吸掉芯片中的液体，放回VWR离心机上，芯片突出部向外，离心 10s，再用移液器把残余液体从芯片中吸掉；不要带手套且在PGM的接地金属 板上碰触两下，将替代芯片取下，将上好样的芯片放置到芯片座上，合上上 模块；

操作屏上，按Next，进入PendingRUN选择界面，按Browse，选择设定好 的相应Plan文件；按Next，带Plan程序载入成功后，确认所有设置数据；按 Next后按OK，进入芯片检测，可以离开，检测通过后会自动进入测序程序。

(2)HiSeq2500大片段建库和测序

使用HydroShear将DNA剪切成大片段，使用脉冲场电泳回收3K和5K 长度的目的片段，经过末端修复、生物素标记和环化等，再把环化后的DNA分 子打断成400～600bp的片段，通过带有链亲和素和霉素的磁珠把带有生物素标 记的片段捕获，再经末端修饰加上特定接头后建成mate-pair文库，上机测序。

3、生物信息学分析

(1)数据处理与拼接

片段化测序数据下机后，使用perl脚本去除测序接头，读长小于50bp的序 列删除，低质量的序列删除。Mate-pair数据下机后，使用sff_extract(version0.2.13) 软件扫描数据，将序列前向和后向reads分开，高质量的reads采用Newbler (version2.9)拼接组装。

(2)基因组注释

蛋白编码基因使用AUGUSTUS(version3.0.2)软件注释，重复序列使用 RepeatMaker(versionopen-3.2.7)分析，tRNAs使用tRNAScan(version1.23)预测， rRNAs使用RNammer(version1.2)预测。

(3)基因注释

SWISS-PROT数据库：基因比对使用SWISS-PROT(下载自European BioinformaticsInstitutebyAug8th,2012)，阈值设定Evalues<＝1e-10。

COG数据库：基因功能行注释排列采用ClustersofOrthologousGroupsof proteinsdatabase(COG)中序列进行相似度比较，阈值设定Evalues<＝1e-10，写 Perl脚本文件对基因功能进行分类。

KEGG数据库：使用BLASTX将基因与KyotoEncyclopediaofGenesand Genomesdatabase(KEGG,release58)进行比较，阈值设定Evalues<＝1e-10。写 Perl脚本完成KEGG信息比对，建立unigene与KEGG代谢途径的结合。

Interpro蛋白功能分类和基因功能分类GeneOntology：InterPro结构域采用 InterProScan(release4.8)注释，功能分类使用GeneOntology(GO)进行扫描和查 询，WEGO软件用于GO功能分类和绘制GO树。

(4)基因组组装和注释完整程度的评价

对于每个物种，比如P.fragariae对于P.sojae、P.ramorum和P.infestans中 都有Besthit,类似P.sojae对于P.fragariae、P.ramorum、P.infestans有Besthit。 这里主要得到P.sojae、P.ramorum和P.infestans与其他物种的besthit，在这些 besthit里是不是P.fragariae都存在，如下面格式

以P.sojae的A1A2基因作为例子，如

1表示有besthit，0表示没有。这A2在P.fragariae中没有，就认为在P. fragariae中缺失，一般可能是P.fragariae没有注释出来，因为P.fragariae和P. infestans都有。

4、系统进化树构建方法

使用Mega5.0软件构建各基因片段的系统进化树。

5、数据统计、分析和相应统计图表的生成采用Excel软件完成

三、结果

1、测序组装结果

采用片段化和mate-pair测序相结合的策略对基因组进行测序。片段化测序 分别完成3个runs，即上述提到的片段化测序的Run1、Run2、Run3，两个物种 相关数据质量见表1中Run1、Run2和Run3数据。Mate-pair测序分别构建3K 和5K两个长片段文库，数据质量如表1中3K和5K数据。测序数据的质量评 分见图1所示，mate-pairs数据质量均在Q30以上，fragment数据质量略低，但 也满足了Q20的标准，这与使用的测序平台有关系。本例图1中的5个图所得 的数据质量均在Q30值的基线之上，即为得到的测序质量很好。P.fragariae两 种测序方式共获得18269515shotgunreads和18902113paired-endreads，P.rubi 共获得16950609shotgunreads和15769507paired-endreads。对获得的reads去 除接头和低质量的片段，对剩余的数据进行拼接。两物种在Contig和Scaffold 水平的拼接质量如表2所示。

拼接使用了Iontorrent和Hiseq2500两个测序平台，为了使数据拼接的质量 更好，同时尝试了Mira和Newbler两个最常用的基因组拼接软件，表2显示了 两个软件分别对P.fragariae在Contig水平和Scaffold水平的差异。在Contig水 平，根据N50值来判断，Mira软件好于Newbler软件。在Scaffold水平，Newbler 软件好于Contig水平。因此，基因组拼接结果以Newbler软件Scaffold水平的 数据为准。Contig水平拼接基因组大小为74.69Mb，平均读长为628bp，N50 为9.236K。Scaffold水平拼接基因组大小为73.69Mb，平均读长为26.176K， N50为92.072K。测序深度为103fold。基因组GC含量为53.25％，重复序列长 度为218.269K，占到基因组的0.3％。P.fragariae基因组序列已提交至GenBank 数据库，登录号为JHVZ01000000。对于P.rubi，Contig水平拼接基因组大小为 47.68Mb，平均读长为921bp，N50为1.485K。Scaffold水平拼接基因组大小 为42.70Mb，平均读长为14.349K，N50为26.769K。

表1P.fragariae测序数据结果

表1中，Library为构建的文库名称，No.ofReads为获得的读长数，SingleLength为测序时单个读长 的长度，Pair-End指是否末端化拼接，TotalLength指获得的总读长长度，HighQuality指获得的质量高的 数据，即Q30等级以上的数据。

表2组装结果

7.2.2P.fragariae基因注释

使用NCBInr数据库、Swissprot等数据库，以疫霉属已测序的P.sojae、P. ramorum、P.infestans、P.cinnamomi、P.capsici和P.parasitica基因注释结果为 模板，对P.fragariae基因进行注释，共获得18692个基因，相关数据结果如表 3所示。将其与已测的疫霉其他6个基因组和其他近缘种Pythiumultimum、 Hyaloperonosporaarabidopsidis和白锈菌Albugolaibachii的基因数目进行了比 较，如表4所示。从基因数来看，P.fragariae与P.sojae接近。疫霉属其他几个 种基因数目之间的差距较大，最少为P.ramorum仅15605个，最多为P. cinnamomi共计26130个，推测这可能与重复序列、某些基因家族的扩散或缺失 导致。其中，重复序列是最主要的影响因素。Py.ultimum的重复序列为7％，而 P.infestans的重复序列高达74％。当然，基因注释的结果也跟选择的参考基因组 有关，早期完成的基因组注释结果有可能存在误差，预测基因数比实际值要高 (Judelson,2012)。在对P.cinnamomi的分析认为，基因数目的多少与其侵染植物 种类多、寄主范围广泛有关。

表3P.fragariae基因组概览

表4疫霉属及近缘种基因数目比较

7.2.3orthology筛选与DNA条形码

从分类学角度，DNA条形码实际上就是一段能够很好的区分种内和种间关 系，特异性识别物种的一段基因。而从遗传学角度分析，实际上就是寻找一段 保守的直系同源基因。因物种形成而被区分开形成的直系同源基因，可以作为 物种亲缘关系判定和物种鉴定的依据。因此，在基因组水平对DNA条形码的筛 选，就是在orthology集中筛选保守性良好，符合DNA条形码物种鉴定和识别 标准的目标片段。

以疫霉属注释的三个基因组P.infestans、P.ramorum和P.sojae作为参考基 因组，对注释得到的基因进行基因家族聚类，一共聚类成为13380个基因家族， 其中有7733个在四个物种中都有分布，这其中5918个家族在四个物种中是单 拷贝的，见图2所示。在这些基因家族中，根据orthologous相似度对其进行整 理和排列，见图3所示。这些orthologous基因家族的相似度主要集中在55％～ 85％之间，对于DNA条形码的筛选，选择相似度最高的95％中的142个基因家 族作为候选DNA条形码第一轮筛选的基因集。

接下来，对究竟哪个基因更符合DNA条形码的原则。首先，根据Sanger 测序的特点以及DNA条形码的可操作性经验，片段长度应尽可能的短。在这里， 我们选择小于1000bp的单拷贝基因作为目标进行第二轮的筛选。得到的基因有 Auto-anti-p27、RNase-H2-Ydr279、DDRGK、SQS-PSY等49个。

第三轮的筛选从遗传距离的分析入手。根据基因组拼接和注释的结果，以 全部单拷贝基因集对几个物种进行系统进化关系分析，以Hyaloperonospora arabidopsidis为外群，得出P.fragariae与疫霉属其他6个物种P.sojae、P. ramorum、P.infestans、P.cinnamomi、P.capsici、P.parasitica构建系统进化ML 树，如图4A图所示。经以上7株疫霉与卵菌纲其他种，包含腐霉Pythiumultimum (PYU)、Py.irregular(EPrPV)、Py.iwayamai(EPrPI)、Hyaloperonospora arabidopsidis和白锈菌Albugolaibachii构建了基因组水平的系统进化关系，ML 树如图4B所示。可知，P.fragariae与P.sojae聚为一个进化支，二者的亲缘关 系最接近，P.parasitica和P.infestans二者的亲缘关系较为接近。

根据得出的亲缘关系，以单个基因来分析系统进化关系，如果能够真实的 反应亲缘关系的基因，我们认为可以作为候选DNA条形码基因集。通过构建单 个基因的几个物种之间的系统进化树直观的看出，不同基因对物种亲缘关系的 分类结果不完全一致。其中，较好的基因有7个，包括Cornichon、DDRGK、 DUF866、Rer1、Ribosomal-s24e、RRP7和TFIID-31KDa。其中，Cornichon基 因对四个疫霉种的进化关系见图4C。七个基因中有约28段序列适合用于草莓疫 霉红心病菌DNA条形码，28段序列分别为SeqIDNo.1至SeqIDNo.28所示序 列，如表5所示。

表5草莓疫霉红心病菌DNA条形码

本例所制备的SeqIDNo.1至SeqIDNo.28所示的28段序列都可以作为草 莓疫霉红心病菌的DNA条形码。可以理解，作为DNA条形码只要能够将靶标 菌株与其它近似菌株区分开即可，因此，在本例的28段序列的基础上，可以随 意截取其中的若干个碱基，用于草莓疫霉红心病菌的检测或鉴定，在此不做具 体限定。

以上是从基因组水平，对同源基因的筛选角度筛选和寻找同源基因的思路。 我们选择的多是单拷贝基因，这是基于单拷贝基因的特异性。但单拷贝基因作 为DNA条形码的可行性可能会受其扩增困难、扩增效率不高等的影响。此外， 已经被测序和注释的疫霉种仍是少数，通过基因组之间的同源基因筛选，只能 得到一些基因集，这些候选片段能否区分更多的疫霉种，还有待于验证，但可 以作为一种DNA条形码筛选的思路加以借鉴和利用。

以上关于疫霉种的分类结果与Blairetal.,(2008)对疫霉属分化枝的分类结 果一致。根据Blair等人的结论，P.fragariae和P.sojae属于Clade7，该分化枝 还包括其他11个种P.alni、P.cambivora、P.europaea、P.rubi、P.uliginosa、P. cajani、P.cinnamomi、P.melonis、P.niederhauseri、P.pistaciae和P.vignae。形 态学特征上，clade7孢子囊没有乳突，都是发生于根部的植物致病菌。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认 定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本申请的保护范围。