一株降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌及其应用

摘要

本发明涉及一种降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌及其应用，保藏编号为：CGMCC No.11805，分类命名为：腐皮镰孢Fusarium solani，保藏日期：2015年12月03日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其发酵液与黄曲霉毒素B1反应5分钟后对黄曲霉毒素B1的降解率为75.34％，反应24小时对黄曲霉毒素B1降解率可达到94.4％。该菌株有很好的降解黄曲霉毒素B1的能力，具有应用到食品及饲料行业去除黄曲霉毒素的前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株降解黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，黄曲霉毒素B1)的镰孢属菌及其应用。

背景技术

全世界每年约有25％的谷物受真菌及真菌毒素污染而不能食用。真菌毒素种类繁多，其中以黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)毒性最强，是迄今发现污染农产品最毒的一类生物毒素，也是强致癌物。实验动物学研究表明，黄曲霉毒素对人体和畜禽动物都会产生严重的毒性伤害：作为一种肝毒素，可以引起肝细胞变性、坏死，损害肝脏；作为一类细胞毒素，微量黄曲霉毒素可以导致细胞培养中的哺乳动物细胞死亡。黄曲霉毒素的致癌性极强，由于接触毒素的途径不同，除了很容易导致肝癌外，还会引起肾、胃、支气管、皮下组织及腺体的癌症。黄曲霉毒素还具有致畸，致突变的危害以及DNA的断裂。它还会引起动物胆管上皮细胞增生和大脑、神经系统、脾、肾病变，对蛋白合成也具有一定的抑制作用。其中又以黄曲霉毒素B1分布范围最广且化学性质最稳定，具有很强的致癌性、致突变性和致畸性，是国际认可的A类致癌物。因此掌握黄曲霉毒素的防治措施，对保障粮油食品质量安全和确保动物性食品安全尤为重要。

传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤一渗滤法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定，以及难以规模化生产等缺点；此外，吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法，生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌及其应用，该菌具有快速高效降解黄曲霉毒素B1的能力，具有实际应用的前景。

本发明实现目的的技术方案如下：

一株降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌，其特征在于：保藏编号为：CGMCCNo.11805，分类命名为：腐皮镰孢Fusariumsolani，保藏日期：2015年12月03日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述发酵液与黄曲霉毒素B1反应5分钟后对黄曲霉毒素B1的降解率为75.34％。

降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌作为饲料防霉剂的应用。

降解黄曲霉毒素B1的镰孢属菌作为生物降解菌剂或生物降解无菌制剂的应用。

本发明的优点和积极效果是：

本发明公开一株镰孢属菌(Fusariumsp.)WCQ3361，其菌种保藏号为CGMCCNo.11805，通过实验发现，其发酵液与黄曲霉毒素B1反应5分钟后对黄曲霉毒素B1的降解率为75.34％，反应24小时对黄曲霉毒素B1降解率可达到94.4％，本该菌株有很好的降解黄曲霉毒素B1的能力，具有应用到食品及饲料行业去除黄曲霉毒素的前景。

附图说明

图1为本发明镰孢属WCQ3361在NA培养基上的菌落形态；其中图1a为菌落正面，图1b为菌落反面；

图2为本发明高效液相色谱法检测镰孢属WCQ3361对黄曲霉毒素B1的降解能力a发酵液处理60分钟b未经发酵液处理的对照组；

图3为本发明不同处理时间对镰孢属WCQ3361发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响；

图4为本发明温度对镰孢属WCQ3361发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响；

图5为本发明pH值对镰孢属WCQ3361发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响；

图6为本发明不同金属离子对发酵液上清降解黄曲霉毒素B1能力的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明提供的镰孢属WCQ3361菌株可高效降解黄曲霉毒素B1，该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。

本发明从发霉花生样本中筛选能够降解香豆素的菌株；二次筛选能够降解黄曲霉毒素B1的菌株，采用初筛培养基(M9+0.1％的香豆素)分离的多株能够在香豆素为唯一碳源和能源的培养基中生长的菌株，再用这些菌株分别接种复筛培养基(NB培养基+终浓度为100μg/L的黄曲霉毒素B1)，选择到1株降解黄曲霉毒素B1的菌株，通过形态学，以及ITS核酸序列分析，确定该菌株是镰孢属菌株，其保藏编号为：CGMCCNo.11805。其ITS核酸序列为：

TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTTCTACCTGATTCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCGCTCTCCAGTTGCGAGGTGTTAGCTACTACGCAATGGAAGCTGCGGCGGGACCGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTTGTGCCCGCAGGGGGCTTCCGCCGATCCCCAACGCCAGGCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTACCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGACGCCAGAGTCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATTTATTTGCTTGTTTACTCAGAAGAAACATTATAGAAACAGAGTTAGGGGGTCCTCTGGCGGGGGCGGCCCGTGTTACGGGGCCGTCTGTTCCCGCCGAGGCAACGTTATAGGTATGTTCACAGGGTTGATGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGA

以下分具体实施例来分别论述各个部分：

实施例1

菌株的筛选分离

1、样品采集

2013年6月，在超净工作台中，将采集的发霉花生样品磨碎放在无菌生理盐水中震荡15min制备菌悬液，取菌悬液在肉汤培养基中30℃220rpm富集培养4h。取发酵液离心，收集菌体转接到50ml初筛的培养基里，30℃220rpm培养7天，按5％的接菌量取培养液2.5ml离心，收集菌体，菌体转接到初筛培养基中，共转接3次。

2、菌株的分离

取300ul有生长迹象的菌悬液涂布初筛固体培养基平板上，30℃条件下培养7d，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株在初筛固体培养基平板划线纯化3代，挑选三代都能稳定生长的菌株的单克隆，再次接种到50ml初筛培养基里，转接3次，选取有明显生长迹象的菌株(命名为镰孢属菌WCQ3361)。保存在终浓度为20％的甘油里。

3、镰孢属菌WCQ3361的形态特征

镰孢属菌WCQ3361菌株在NA培养基上30℃培养7d后，直径为82mm一87mm，菌落表面白色、光滑；几乎无气生菌丝；边缘整齐，无特殊气味，菌落背面柠檬黄色(图1)。

4、培养基及培养条件

(1)初筛培养基KH₂PO₄，0.25g；MgSO₄·7H₂O，0.25g；(NH₄)₂SO₄，0.5g；CaCl₂·2H₂O，0.005g；FeCl₃·H₂O，0.003g，固体培养基加琼脂20g，水1升，调pH到7。分装到锥形瓶，加塞包扎后121℃灭菌20分钟，稍冷却后加0.1％(W/V)香豆素。30℃，220rpm培养7d。

(2)肉汤培养基蛋白胨10g；牛肉膏3g；NaCl5g；加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后121℃灭菌20分钟。30℃，220rpm培养4h。

(3)NB培养基酵母提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖6g，NaCl10g，加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后115℃灭菌20分钟。按1％的接种量接种在5mlNB培养基的试管里，30℃220rpm培养24h，按5％的接种量接种到100ml培养基中，培养48h。

4)NA培养基为NB培养基加20g琼脂，用接种环划线，30℃培养。

实施例2

不同处理时间对镰孢属WCQ3361发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响

1、试验方法

(1)黄曲霉毒素B1的配制

将1mg黄曲霉毒素B1溶解在10ml色谱纯甲醇中获得浓度为0.1mg/ml的黄曲霉毒素B1储存液，再取1ml储存液用99ml超纯水稀释成1000ug/L的黄曲霉毒素B1使用液。使用终浓度为100ug/L。

(2)菌种培养

将初筛得到的镰孢属菌WCQ3361菌种按1％的接种量接种在5mlNB培养基的试管里，30℃220rpm培养24h，按5％的接种量接种到100mlNB培养基中，培养48h。

(3)镰孢属菌WCQ3361对黄曲霉毒素B1降解效果的检测

取4.5ml发酵液加入50ml棕色青霉素小瓶中，加500ul浓度为1000ug/L的黄曲霉毒素B1(终浓度为100ug/L)，30℃220rpm分别处理1，2，5，10，20，40，60min和24h。NB培养基作对照。处理液10000rpm离心5min，取一定体积的上清用超纯水稀释3倍，然后用定性滤纸过滤，使用免疫亲和柱对实验组和对照组样品的黄曲霉毒素B1进行净化提取(方法参照免疫亲和柱的使用说明书)。提取液在60℃烘箱中烘干。

将烘干的样品衍生化，先加入200ul的正己烷，再加50ul三氟乙酸，激烈震荡30s，40℃衍生5min，加入1.95ml乙腈和水混合物(乙腈：水＝1：9)，激烈震荡30s，静止分层10min，取下层溶液，10000rpm离心5min，然后过0.22um的膜，HPLC检测黄曲霉毒素B1的含量。

HPLC检测条件为：流动相水：甲醇：乙腈＝70：17：17的混合物；流速0.6ml/min；色谱柱C18(250mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；柱温：30℃；进样量25μl。

黄曲霉毒素B1降解率(％)＝(对照组黄曲霉毒素B1含量—实验组黄曲霉毒素B1含量)/对照组黄曲霉毒素B1含量×100。

2、试验结果

实验结果表明，镰孢属菌WCQ3361的发酵液在30℃，220rpm避光处理黄曲霉毒素B1理1min时对黄曲霉毒素B1的降解率为69.75％，60min时的降解率为80.98％(图2)，24h的降解率为94.4％(图3)。结果表明，镰孢属菌WCQ3361的发酵液上清对黄曲霉毒素B1的降解速率非常快，比以往报道的菌株的降解速度快。

实施例3

不同温度、pH值和金属离子条件对黄曲霉毒素B1降解能力的影响

(一)不同温度下发酵液上清对黄曲霉毒素B1的降解效果

1、试验方法

将发酵上清分别在0，10，20，30，40，50，60，70，80和90℃水浴锅放置2min，然后加入黄曲霉毒素B1(终浓度为100ug/l)，反应20min，检测上清对黄曲霉毒素B1的降解率。

2、试验结果

结果表明，从0℃到90℃，黄曲霉毒素B1的降解率在81％到87％之间(图4)，温度对降解效果的影响不大。这说明，除了蛋白，可能还有别的因素影响降解效果。

(二)不同pH值下发酵液上清对黄曲霉毒素B1的降解效果

1、试验方法

用2M的HCl将发酵液上清的pH值调到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，把NB培养基调到相应的pH值作为对照，加入黄曲霉毒素B1，30℃下反应20min，检测对黄曲霉毒素B1的降解率。

2、试验结果

在pH值为7.0时，降解率最高，为82.68％，在pH为4.0时降解率最低，为6.53％(图5)。

(三)不同金属离子对发酵液上清降解黄曲霉毒素B1影响

把发酵液上清的pH值调到7.0，分别加入1M的LiCl，CaCl₂，MgSO₄，ZnCl₂，CuSO₄，NiSO₄和FeCl₃溶液，使金属离子的终浓度为10mM，加入黄曲霉毒素B1，30℃下反应20min。在发酵液上清中加入等体积的无菌去离子水作为对照。检测对黄曲霉毒素B1的降解率。

2、试验结果

跟对照组降解率82.23％相比较，加入Cu²⁺，Mg²⁺和Li⁺降解效果增强，降解率分别为93.64％，89.88％和84.48％。然而，Ni²⁺和Fe³⁺对降解效果有明显的抑制作用，降解率分别为18.39％和60.32％。加入Zn²⁺以后，发酵上清对黄曲霉毒素B1的降解作用消失，降解率为0(图6)。