黄曲霉毒素B1降解菌的分离鉴定及其降解特性

摘要

黄曲霉毒素是黄曲霉等真菌产生的具有强毒、致癌的次级代谢产物,常常造成农产品和食品的严重污染。黄曲霉毒素污染不仅对人类和动物的健康造成极大的危害,而且带来巨大的经济损失,是食品安全中一个广为关注的问题。在防控真菌毒素中,生物降解,尤其微生物的作用一直受到重视,人们希望借此开发一种安全实用、对食品营养价值无明显影响的去毒方法。本文以黄曲霉毒素B1(AFB1)降解菌的分离鉴定为目的,从降解活性菌株筛选,降解作用与吸附结合作用的区分,pH干扰的排除,活性菌株的鉴定,以及活性菌的降解特性等方面进行了研究,主要结果如下:
　　 1.以AFB1结构类似物香豆素为唯一碳源,进行了AFBl降解菌的筛选。能利用香豆素的菌株进而与AFB1标准品(2.5μg/mL)作用,以AFB1去除率为指标进行复筛,从而得到可以去除毒素的菌株。利用这一方法,从不同生境的样品中初筛到10株可在以香豆素为唯一碳源的培养基上生长良好的细菌,复筛发现这些菌均具有良好的降解毒素的活性,其中从金毛羚牛粪便中筛选出的菌株F4降解活性最好。F4菌的培养液在37℃与AFB1作用72h,毒素去除达到90.03％。同时建立了HPLC测定培养液中AFB1的方法。采用二氯甲烷提取,反相C18柱为分离柱,在362nm下进行检测。结果培养液中的AFB1得到很好的分离,AFB1在0.01μg/mL～20.00μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为y=67.3368x-8.5095(R2=0.9997),AFBl的平均回收率为99.17%,RSD为2.39%。结果表明,所建方法简便准确可靠,能用于培养液中AFB1的定量检测。
　　 2.在AFB1降解菌筛选中,pH的干扰以及吸附结合作用产生的假阳性常常影响结果的准确。研究采用了可靠的检测方法,对降解与吸附结合作用进行了区分。由于菌株培养过程中培养基pH会升高,高pH可引起毒素的破坏而影响判定结果,因而通过添加0.1%的KH2PO4、调低初始pH为6.5对培养基进行改良,结果表明,菌株在改良培养基中培养时,pH升高的情况得到了有效控制,从而排除了pH的干扰;通过比较细胞灭活对AFB1去除的影响,分析菌株细胞水洗脱、有机溶剂萃取后AFB1的变化等方法,发现热处理可导致细胞丧失去毒活性,对反应后的活细胞,经反复水洗或者二氯甲烷萃取,都几乎检测不到AFB1,从而有效地排除了生物吸附结合的干扰,区分了降解作用和可逆的吸附作用,确定分离菌株F4和F7具有高效降解AFBl活性。
　　 3.根据形态染色、生理生化特性,以及16SrRNA序列同源性分析,对降解活性最好的菌株F4进行了鉴定。通过PCR特异性扩增和测序获得菌株F4的16SrRNA序列(1498bp),然后进行系统发育分析。结果表明,F4与施氏假单胞菌的16SrRNA(AccessionNo.JN712254)同源性达到99%,结合形态染色、生理生化特征,初步鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)。
　　 4.对F4菌株的降解特性和影响条件进行了研究。首先考察了细胞浓度、pH、温度、金属离子等对F4降解活性的影响。结果表明,F4降解毒素活性物质主要存在于菌细胞,在72h时,F4对AFB1的降解率达到最高,F4的降解活性与细胞浓度呈正相关,pH和温度对其降解水平有着显著的影响,Mg2+对AFB1降解有增强作用,降解率增加7.68%,Cu2+抑制降解活性,降解率下降51.1%,提示活性物质可能是一种胞内酶;同时通过单因素试验分析了F4降解毒素的影响条件,结果表明,当降解温度为35℃,pH为7.0,Mg2+浓度为1.00mM时,F4细胞对AFBl的降解率可达到最高。在单因素试验的基础上,以F4细胞对AFB1降解率为响应值,选取降解温度、pH和Mg2+浓度这三个影响显著的因素,采用响应面试验进行优化,得到最佳降解条件为:温度35.49℃、pH为7.12、Mg2+浓度为1.07mM,若在此降解条件下,F4细胞对AFBl的降解率理论值可达97.34%。