一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法

摘要

本发明公开了一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法。本发明提供了抑制含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质在制备促进含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复产品中的应用。本发明的实验证明，本发明筛选到抑制绵羊Lig4基因表达的siRNA，通过siRNA抑制绵羊Lig4基因表达,抑制绵羊胚胎成纤维细胞的NHEJ修复途径从而刺激细胞内HR修复途径，提高了细胞采用HR修复的频率，为提高绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率和研究绵羊基因组精确编辑提供基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同 源重组修复频率的方法。

背景技术

利用人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease,EEN)，如锌指酶(Zincfinger nucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effectornucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspaced shortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated9(Cas9))，定点切割基 因组，产生特定位点基因组双链断裂(Double-strandbrakes,DSBs)或缺克(Nicks)， 促进精确编辑哺乳动物基因组的研究。

细胞主要通过非同源末端连接途径(Non-homologousendjoining,NHEJ)修复 DSBs，产生基因敲除表型。共同转染EEN和单链寡核苷酸，或同源序列的供体模板， 通过依赖同源模板修复途径，如微同源臂介导连接(Microhomology-mediatedend joining,MMEJ)和同源重组(Homologousrecombination,HR)，精确地将外源目的基 因敲入细胞基因组，实现基因编辑。即使采用高效的CRISPR/Cas9系统产生基因组的 DSBs，细胞选择NHEJ修复事件的发生概率超过90％，利用同源模板的修复概率低于10％。 说明多数细胞中，NHEJ远远超过依赖同源模板修复事件的发生概率。

抑制NHEJ途径，促使细胞采用HR修复途径，能够提高HR修复频率。用EEN定 点断裂果蝇细胞基因组，RNA干扰(RNAinhibite,RNAi)瞬时抑制Lig4基因(DNA Ligase4,Lig4)翻译，PCR扩增短的左右同源臂(80和60nt)供体模板，在药物筛 选的细胞中，同源重组效率达50％。EEN处理Lig4-/-突变体的果蝇胚胎、拟南芥，与 野生型比较，同源重组效率显著提高。调控抑制线虫(Caenorhabditiselegans)体细 胞中的Lig4蛋白因子，从而抑制NHEJ，使有机体修复DSBs途径转向MMEJ。Bmku70 蛋白是NHEJ的必须因子，敲除Bmku70基因的家蚕胚胎，显微注射CRISPR/Cas9系统 质粒和供体模板，与野生型家蚕胚胎比较，HR效率更高。SCR7 (5,6-bis(benzylideneamino)-2-mercapto-pyrimidin-4-ol)特异性同人类Lig4 蛋白的DNA结合域(DNAbindingdomain,DBD)结合，阻断了Lig4与DNA结合，抑 制NHEJ修复途径，提高HR修复频率4-5倍。

Lig4敲除的果蝇能够正常生存，但小鼠Lig4基因敲除表现为胚胎致死，至今对 哺乳动物Lig4基因敲除的研究较少。哺乳动物细胞修复DSBs的3条主要途径：NHEJ、 MMEJ和HR，呈现互补竞争关系，抑制NHEJ将刺激细胞选用HR修复途径。

Gorbunova实验室定量研究NHEJ和HR修复途径，获得细胞老龄化状态不同，对 基因组DSBs修复结果不同；人类体细胞修复DSBs，主要采用NHEJ途径，而且在细胞 周期各个阶段都可以使用NHEJ；HR修复主要发生在S期。

基因打靶技术以同源重组为基础，是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段， 促进了生物学研究。正常哺乳动物细胞发生同源重组概率极低，造成基因打靶效率极 低(10^-6)。

发明内容

本发明的一个目的是提供抑制Lig4基因表达和/或活性的物质的用途。

本发明提供了抑制Lig4基因表达和/或活性的物质在制备促进离体绵羊胚胎成纤 维细胞在基因编辑时进行同源重组修复产品中的应用。

上述应用中，所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊 胚胎成纤维细胞中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复；

或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚 胎成纤维细胞基因组上。

所述特定位点剪切是通过I-SceI酶切实现。

上述应用中，所述抑制Lig4基因表达的物质为用于干扰离体绵羊胚胎成纤维细胞 中Lig4基因表达的siRNA。

上述应用中，所述siRNA的核苷酸序列为序列表中序列3或序列4。

本发明另一个目的是一种使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组 修复频率提高的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细 胞中Lig4基因表达，实现离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频 率提高。

上述方法中，所述抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达 为将用于抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质导入所述进行基因编 辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中。

上述方法中，所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊 胚胎成纤维细胞中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复；

或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚 胎成纤维细胞基因组上。

上述方法中，所述抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质为用于干 扰离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的siRNA；

所述siRNA的核苷酸序列具体为序列表中序列3或序列4。

上述方法中，所述使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频 率提高为抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的细胞同源 重组修复频率高于进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞的同源重组修复频率。

上述外源DNA分子为HR质粒。

本发明的实验证明，本发明筛选到抑制绵羊Lig4基因表达的siRNA，通过siRNA 抑制绵羊Lig4基因表达,抑制绵羊胚胎成纤维细胞的NHEJ修复途径从而刺激细胞内 HR修复途径，提高了细胞采用HR修复的频率，为提高绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶 效率和研究绵羊基因组精确编辑提供基础。

附图说明

图1为针对绵羊Lig4基因设计的siRNA位点示意图。

图2为分析HR修复途径的报告基因结构(a)和断裂DNA粘性末端(b)图。

图3为绵羊Lig4基因CDS序列PCR扩增结果。

图4为pMD18T-ShLig4菌体PCR检测。

图5为siRNA影响绵羊Lig4基因表达的实时荧光定量PCR结果。

图6为siRNA干扰绵羊Lig4基因表达的Westernblot图。

图7为HR修复载体重连荧光成像结果。

图8为HR修复载体重连流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Lig4基因的核苷酸序列为序列1，编码蛋白的氨基酸序列为序列2。

部分材料如下：pcDNA3.1⁺载体(Invitrogen),pMD18-T(TaKaRa)，HR质粒 Gorbunova实验室惠赠，pDsRed2-N1(Clontech)，pEGFP-N1(Clontech)，stbl3菌种 (Invitrogen)，电转仪(AmaxNucleofectorⅡ)，流式细胞仪(BDFACSAriaⅢ)，绵 羊胚胎成纤维细胞由本实验室原代培养保存。

部分试剂如下：RealBand10KB(0.25-10kb)DNALadder(CatNO.B600031-0500) 上海生工；DL2000DNAMarker(CatNO.3427A，TaKaRa)。TaqDNAPolymerase(Cat NO.ET101-02)，小量质粒提取试剂盒(CatNO.DP103-02，天根生化科技有限公司)。 PrimerSTARDNAPolymerase(CatNO.R045，Takara)，胶回收试剂盒(CatNO.D2500-02， OMEGA)；限制性内切酶(ThermoFisher)；Lig4单克隆抗体((CatNO.GTX100100， GeneTex)；EasyScriptAll-in-oneFirst–StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCR (CatNO.AT314北京全式金生物技术有限公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(Cat NO.B639271，上海生工)。

Trizol(CatNO.15596-026，Invitrogen)；哺乳动物蛋白抽提试剂(Cat NO.CW0889)、BCA蛋白定量试剂盒(CatNO.CW0014)、蛋白酶抑制剂混合物(Cat NO.CW2200)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(CatNO.CW0022)、速泳SDS-PAGE电泳缓冲液 (10×)(CatNO.CW2566)、蛋白示踪上样缓冲液(5×)(CatNO.CW0027A)、山羊抗 兔IgGHRP(CatNO.CW0103)、抗GAPDH兔多克隆抗体(CatNO.CW0101)、WesternBlot 封闭液Ⅰ(BSA)(CatNO.CW0054)、Western抗体稀释液(CatNO.CW2340)、高灵敏度 化学发光检测试剂盒(CatNO.CW0049B)、蛋白印迹膜再生液(CatNO.CW0056A)购自康 为世纪；15-150kDa双色预染蛋白Marker(CatNO.C610011)购自上海生工；耗材购 自上海生工。

实验室用DEPC处理的水配制电转液。SolutionⅠ(10ml)：2gATP-Na₂，1.2g MgCl₂*6H₂O；SolutionⅡ(500ml)：6gKH₂PO₄，0.6gNaHCO₃，0.2gC₆H₁₂O₆。Solution Ⅰ，使用0.2μm滤器过滤除菌，-20℃保存；SolutionⅡ用NaOH调节pH值7.2，0.2 μm滤器过滤除菌，4℃保存；用时将solutionⅠ和solutionⅡ按照1:50体积比混合。

细胞培养皿、离心管(Nunc)；DMEM高糖培养液(Gibco)；胎牛血清(BI， LOT1407738)；胰酶替代物TrypLE^TMExpress(1X)(12604-021，Gibco)。

实施例1、干扰绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的siRNA的筛选

一、真核表达质粒pcDNA3.1-Shlig4的构建

1、引物设计

根据Genbank中预测的绵羊Lig4基因序列(XM_004012236)和GAPDH基因序列 (NM_001289746.1)设计引物，由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1为引物名称及序列

下划线为限制性酶切位点BamHI和XbaI，黑体为保护性碱基。

2、pcDNA3.1-Shlig4重组质粒的构建

根据哺乳动物Lig4基因的cDNA序列不含内含子，用引物Shlig4F/Shlig4R，直 接以绵羊基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到2736bp与预期大小相符的PCR产物， 即为绵羊Lig4基因的cDNA(图3，其中，1：Lig4；2：阴性对照；M.Maker)。

将PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳。按照OMEGADNA胶回收纯化试剂盒说明书进 行胶回收的操作。回收纯化的PCR产物与pMD18-T载体16℃过夜连接，连接产物转化 Stbl3感受态细胞并接种于Amp抗性的LB平板，用引物ShLig4RTF3/ShLig4RTR3对克 隆进行PCR检测，得到250bp的目的条带的阳性克隆(图4，其中，1-7：菌体PCR； 8：阴性对照；M：DL2000)。挑取阳性克隆提取质粒命名为pMD18T-shlig4送上海生 工测序。

以pMD18T-Shlig4为模板，用引物PC3.1lig4F/PC3.1lig4RPCR扩增Lig4基因。 PCR产物胶回收纯化。纯化的PCR产物和pcDNA3.1⁺经BamHI和XbaI双酶切，切胶回 收纯化目的片段，T4连接酶16℃过夜连接，转化后接种Amp抗性的LB平板，获得真 核表达质粒pcDNA3.1-Shlig4，上海生工测序。

经过测序，pcDNA3.1-Shlig4为将序列表中序列1所示的DNA片段插入pcDNA3.1⁺载体(Invitrogen)的BamHI和XbaI酶切位点间得到的载体。

二、干扰绵羊Lig4基因表达的siRNA设计

根据绵羊Lig4基因测序结果，由上海吉玛公司设计合成4个位点的干扰序列。合 成序列见表2，作用位点见图1。

表2绵羊Lig4基因的siRNA序列设计

三、绵羊胚胎成纤维细胞培养

绵羊成纤维细胞原代培养选择妊娠1月龄胎羊，取肌肉组织剪切成小块，按0.5cm 间距均匀种植于培养皿，待组织小块贴壁,加入培养液(DMEM原液+15％血清+1％双抗)， 置于37℃，5％CO₂培养箱内培养。3-4d换液1次，待原代细胞汇合成片，占培养皿的 80-90％时，进行传代培养；4-6h换液，待细胞长到90％以上汇合后消化处理，加入适 量完全培养液悬浮细胞后1:3扩大培养。细胞消化采用Gibco胰酶替代物TrypLE，得 到离体绵羊胚胎成纤维细胞。

四、最佳的Lig4基因siRNA的筛选

1、电转染

分别将4种siRNA、质粒pcDNA3.1-Shlig4和质粒pDSRed2-N1电转染至离体绵 羊胚胎成纤维细胞中，具体如下：

离体绵羊胚胎成纤维细胞生长至培养皿的80％时，消化收集1.8×10⁶个细胞， 100μL电转液悬浮(S1：S2＝1：50)，分别加入上述二合成的相应的4种siRNA、质粒 pcDNA3.1-Shlig4和质粒pDSRed2-N1(Clontech)。将电转杯放置于电转槽中，运行 CZ-167电转程序，室温静置10min，混匀后铺于6cm细胞培养皿中，37℃、5％CO₂培 养箱中培养，9h细胞完全贴壁后，更换1次细胞培养液，72h收集细胞，得到转染阴 性对照siRNA细胞、转染Lig4-siRNA-49细胞、转染Lig4-siRNA-1132细胞、转染 Lig4-siRNA-1827细胞和转染Lig4-siRNA-2629细胞、转染pcDNA3.1-Shlig4细胞和 转染pDSRed2-N1细胞。

2、绵羊Lig4基因表达情况定量PCR检测

用Trizol法分别提取转染阴性对照siRNA细胞、转染Lig4-siRNA-49细胞、转 染Lig4-siRNA-1132细胞、转染Lig4-siRNA-1827细胞、转染Lig4-siRNA-2629细胞、 转染pcDNA3.1-Shlig4细胞、转染pDSRed2-N1细胞、空白离体绵羊胚胎成纤维细胞 电转和不做任何处理的正常离体绵羊胚胎成纤维细胞的总RNA，反转录得到cDNA。

上述cDNA的制备采用下述反应体系进行：总RNA1μg，5×TransScript All-in-oneSuperMixforqPCR5μL，gRNARemover1μL，用RNase-freeWater补 加至20μL。同时用5×TransScriptAll-in-oneNo-RTcontrolSuperMix5μL做 一管阴性对照。轻轻混匀，42℃15min，85℃5s，反应结束后cDNA保存于-20℃。

选用GAPDH为内参基因，分别采用ShLig4RTF3/ShLig4RTR3和GAPDHF/GAPDHR引 物对上述4种转染不同siRNA的细胞和转染pcDNA3.1-Shlig4的细胞的cDNA进行PCR 扩增，根据实时荧光定量PCR试剂盒(CatNO.B639271，上海生工)说明操作。Real-time PCR反应体系的配制(20μL)：2×qPCRMix10μL，上下游引物各0.4μL，模板cDNA 1μL，去离子水8.2μL。Real-timePCR反应程序：95℃5min；95℃5s，60℃20s，72℃ 20s，；在72℃20s处收集荧光信号，收集信号的方式为single，共45个循环；95℃ 5s，65℃15s，95℃0s；在95℃0s时收集荧光信号，收集信号的方式为continuous； 最后40℃30s。

荧光定量PCR数据分析根据Ct法(Qr＝2^-ΔΔCt)，确定不同siRNA电转染后对绵羊 胚胎成纤维细胞Lig4基因mRNA表达量的影响。

扩增曲线和溶解曲线见图5，A：扩增曲线；B：溶解曲线；C：siRNA影响绵羊 Lig4基因表达的实时荧光定量PCR比较分析柱状图；Lig4：转染pcDNA3.1-Shlig4 细胞；Red：转染pDSRed2-N1细胞；sc：转染阴性对照siRNA细胞；Si-4：转染 Lig4-siRNA-2629细胞；Si-3：转染Lig4-siRNA-1827细胞；Si-2：转染Lig4-siRNA-1132 细胞；Si-1：转染Lig4-siRNA-49细胞；KC：空白离体绵羊胚胎成纤维细胞电转；cell： 不做任何处理的正常离体绵羊胚胎成纤维细胞；结果显示扩增曲线良好,溶解曲线各自 都只有一个单峰无非特异性扩增。以不做任何处理的同批次绵羊胚胎成纤维细胞Lig4 基因表达水平为1，Real-timePCR结果显示空白离体绵羊胚胎成纤维细胞电转(KC) 和转染pDSRed2-N1细胞、转染阴性对照siRNA细胞中Lig4基因的表达量都略高于正 常离体绵羊胚胎成纤维细胞；转染Lig4-siRNA-2629细胞、转染Lig4-siRNA-1827细 胞、转染Lig4-siRNA-1132细胞、转染Lig4-siRNA-49细胞中的Lig4基因经SiRNA 干扰后Lig4基因mRNA的表达量明显低于正常细胞，其中Lig4-siRNA-1132和 Lig4-siRNA-2629干扰效果较理想。说明Lig4-siRNA-1132和Lig4-siRNA-2629能有 效的抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因mRNA的表达。

3、Westernblot实验

对转染pcDNA3.1-Shlig4细胞、转染pDSRed2-N1细胞、转染阴性对照siRNA细 胞、转染Lig4-siRNA-2629细胞、转染Lig4-siRNA-1132细胞、空白离体绵羊胚胎成 纤维细胞电转和不做任何处理的正常离体绵羊胚胎成纤维细胞采用康为世纪哺乳动物 蛋白抽提试剂(CatNO.CW0889)提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(CatNO.CW0014)测定 蛋白浓度，将蛋白浓度调一致后变性，SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，5％的BSA溶 液4℃过夜封闭，TBST洗膜后加入1:1000稀释的Lig4单克隆抗体(GeneTex)，室温 孵育4h；TBST洗膜三次每次10min，加入1:5000稀释的山羊抗兔二抗，室温孵育1.5h； TBST洗膜三次每次15min，加入一定量的化学发光剂，室温孵育3min，然后曝光定影。

将曝光后的膜取出，加入适量的再生液。室温孵育1h，TBST清洗5min×3次。BSA 过夜4℃过夜封闭，继而再进行内参抗体的孵育。步骤与Lig4相同，抗GAPDH兔多克 隆抗体(CatNO.CW0101)按1:2500稀释，山羊抗兔二抗1:5000稀释。

结果如图6所示，Lig4：转染pcDNA3.1-Shlig4细胞；Red：转染pDSRed2-N1 细胞；sc：转染阴性对照siRNA细胞；Si-4：Lig4-siRNA-2629；Si-2：Lig4-siRNA-1132； KC：空白细胞电转；cell：不做任何处理的细胞；针对绵羊Lig4基因设计的siRNA (Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132)，电转染绵羊成纤维细胞后，Lig4蛋白表 达量明显低于其他实验处理的细胞样品。说明Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132 能够有效抑制绵羊Lig4基因表达。电转质粒pDSRed2-N1、阴性对照siRNA、空白电转 细胞Lig4蛋白表达都略高于正常细胞，与Real-timePCR结果一致。过表达Lig4基 因mRNA表达量很高而蛋白表达量只是略高于正常细胞，可能原因为细胞选择性的翻译 结果。

因此最佳的Lig4基因siRNA为Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132。

实施例2、提高绵羊胚胎成纤维细胞基因组DNA同源重组修复频率

Lig4基因siRNA在提高离体绵羊胚胎成纤维细胞内HR修复效率，具体如下：

由于绵羊原代成纤维细胞传代能力有限，建立稳定的克隆基本不可行。为了定量 测定DNA末端连接效率和保真性，采用质粒重连测试法(plasmidrejoiningassay)。

Gorbunova实验室惠赠的HR质粒，使用GFP(GreenFluorescentProtein)作为 重构报告基因。该报告系统含有2个突变的GFP-Pem1拷贝。在第一个GFP-Pem1基因 片段中，GFP的第一部分外显子中含有22bp碱基长度的删除，并且插入两个反向对称 的I-SceI酶识别位点。第二个GFP-Pem1基因片段缺少启动子、ATG起始密码子和第 二部分GFP的外显子。当I-SceI位点断裂后，产生不互补的粘性末端DSBs。在细胞 内，断裂的HR报告系统，在同源重组修复作用下，利用相连的供体同源GFP模版在断 裂位点发生同源重组，恢复GFP表达(图2)，具体如下：

1、基因编辑

HR质粒(记载在：SeluanovA,MaoZ,GorbunovaV.AnalysisofDNADouble-strand Break(DSB)RepairinMammalianCells.JVisExp,2010,8:(43)和MaoZ,BozzellaM, SeluanovA,GorbunovaV.DNArepairbynonhomologousendjoiningandhomologous recombinationduringcellcycleinhumancells.CellCycle.2008,7(18):2902-2906)用 I-SceI酶线性化，切胶回收，得到特定位点DNA双链断裂的线性化HR载体。

2、HR质粒重连修复

通过如下4组电转方案实现HR质粒重连修复：

首先将待转染的DNA和siRNA调整到适当浓度：线性化HR载体调整到1μg/μL， pDSRed2-N1质粒调整到0.1μg/μL，siRNA稀释至20uM浓度。

HR+Red：100μL电转液悬浮1.6╳10⁶个绵羊胚胎成纤维细胞，在这液体中，添加 2.0μL线性化HR载体(在反应体系的浓2.0μg/100μL)、1μLpDSRed2-N1质粒(在 反应体系的浓0.1μg/100μL)和1μL水，轻轻混匀。

Lig4-siRNA-1132+HR+Red：100μL电转液悬浮1.6╳10⁶个绵羊胚胎成纤维细胞， 在这液体中，添加2.0μL线性化HR载体(2.0μg/100μL)、1μLpDSRed2-N1质粒 (0.1μg/100μL)和1μ的20uMLig4-siRNA-1132(终浓度200nM)，轻轻混匀。

Lig4-siRNA-2629+HR+Red：100μL电转液悬浮1.6╳10⁶个绵羊胚胎成纤维细胞， 在这液体中，添加2.0μL线性化HR载体(2.0μg/100μL)、1μLpDSRed2-N1质粒 (0.1μg/100μL)和1μ的20uMLig4-siRNA-2629(终浓度200nM)，轻轻混匀。

阴性对照SiRNA+HR+Red：100μL电转液悬浮1.6╳10⁶个绵羊胚胎成纤维细胞， 在这液体中，添加2.0μL线性化HR载体(2.0μg/100μL)、1μLpDSRed2-N1质粒 (0.1μg/100μL)和1μ的20uM阴性对照SiRNA(终浓度200nM)，轻轻混匀。

上述pDSRed2-N1表达红色荧光蛋白RFP(RedFluorescentProtein)，共转染 pDSRed2-N1，是为了确定电转载体DNA进入细胞的转染效率；线性化的HR载体电转进 入细胞，通过同源重组途径修复后，将发绿色荧光(GFP)；线性化的HR载体和质粒 pDSRed2-N1转入细胞，在同一个细胞内表达GFP和RFP，在绿色荧光光源下呈现粉色。

将上述各组采用CZ-167程序电转染，每个实验处理3个平行样。使用荧光显微镜 监测成纤维细胞GFP和RFP表达。

绵羊胚胎成纤维细胞电转线性化的HR质粒和pDSRed2-N1质粒后36h，即可观察 到红色荧光细胞。电转染细胞后，培养至72h，两种荧光都能观测到表达。

Lig4-siRNA-1132+HR+Red组电转染细胞培养72h，荧光显微镜结果如图7，A自 然光源；B绿色荧光光源，粉色细胞是GFP和RFP共表达细胞呈现的颜色；C红色荧光 光源；观察到发绿色荧光的细胞(见图7B)，说明线性化的HR载体，在绵羊成纤维细 胞内可以通过HR修复途径，实现重连。

各组电转液电转染细胞培养72h，收集细胞，重悬在0.5ml的PBS(NaCl137mmol/L， KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，pH7.2～7.4)中，流式细胞仪 分析(BDFACSAriaⅢ，FACSDivaVersion6.1.3)，FITC通道检测绿色荧光的表达情 况，PE通道检测红色荧光。每份样品细胞计数10000个，重复3份平行样。

HR修复频率(同源重组效率)＝(绿色荧光细胞百分比+红绿荧光细胞百分比)/(红 色荧光细胞百分比+红绿荧光细胞百分比)。

流式细胞仪检测结果如图8所示，A：空白细胞(离体绵羊胚胎成纤维细胞)；B： GFP单阳性(转染pEGFP-N1质粒(Clontech)的离体绵羊胚胎成纤维细胞)；C：RFP 单阳性(转染pDSRed2-N1质粒的离体绵羊胚胎成纤维细胞)；D：GFP+RFP (Lig4-siRNA-1132+HR+Red细胞)；E：各组电转液电转染细胞HR修复载体重连流式 细胞仪检测柱状图，KC：HR+Red；Si-2：Lig4-siRNA-1132+HR+Red；Si-4： Lig4-siRNA-2629+HR+Red；SC：阴性对照SiRNA+HR+Red；可以看出， Lig4-siRNA-1132+HR+Red组和Lig4-siRNA-2629+HR+Red组与阴性对照SiRNA+HR+Red 对照组之间差异显著，与KC对照组相比，Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132瞬间 干扰绵羊Lig4基因，HR修复频率提高3-4倍。