简单、灵敏检测核酸外切酶III活性的探针及其应用

摘要

本发明公开了一种简单、灵敏检测核酸外切酶III活性的探针及其应用，该探针是从5ˊ端到3ˊ端由3～6个重复的CG碱基序列构成的DNA，且3ˊ端标记荧光基团。本发明探针能自杂交成为双链DNA，G碱基与荧光基团之间发生光电子诱导转移，使探针荧光被熄灭。当检测体系中含有核酸外切酶III时，它能沿3ˊ→5ˊ方向逐步催化水解双链DNA生成单核苷酸，使荧光基团与DNA分离而游离在溶液中，荧光基团的荧光得以恢复，通过检测体系的荧光强度即可实现核酸外切酶III活性的定量检测。采用本发明探针检测核酸外切酶III活性的方法简单、快捷、灵敏，且具有很好的特异性，检出限可达到5×10-4U/mL。本发明探针还可用于核酸外切酶III抑制剂的筛选。

说明书

技术领域

本发明属于酶活性的检测技术领域，具体涉及一种简单、灵敏度检测核酸外 切酶III活性的探针，以及该探针在核酸外切酶III活性检测和抑制剂筛选中的应 用。

背景技术

核酸外切酶III属于DNA水解酶，能够沿双链DNA的3'→5'方向逐步催化去 除单核苷酸。许多重要的生物过程都与核酸外切酶III的活性有关。例如，保证DNA 复制的准确性、促进基因重组的顺利进行、修复双链DNA的损坏等。同时，核酸 外切酶III也被广泛地应用于信号放大检测技术中，以实现对目标分析物的高灵敏 度检测。因此，对核酸外切酶III活性的检测不仅有助于疾病的诊断治疗及药物的 研制开发，而且有利于将核酸外切酶III更好地应用到生物分析检测中。

传统的检测核酸外切酶III活性的方法是基于放射性同位素标记的DNA探针并 结合凝胶电泳的方法。然而，这些检测技术通常是不连续的，成本高，操作繁琐且 耗时，还需要严格的安全措施防止曝光过量。近年来，人们相继报道了利用荧光法 检测核酸外切酶III的活性来替代传统的检测方法。例如，Zhao等报道了一种利用 双标记分子信标荧光法快速检测核酸外切酶III的活性(Analyst,2014,139, 1081-1087)。Min等基于氧化石墨烯和单标记核酸探针构建了一种荧光生物传感器 用于核酸外切酶III的活性检测及抑制剂的筛选(Analyst,2012,137,2024–2026)。 Leung等提出了一种基于G-四聚体无标记荧光法检测核酸外切酶III的活性 (Methods,2013,64,218-223)。Su等设计的分子信标利用3'端富含的G碱基与相 对的5'端标的荧光素相互作用来对核酸外切酶III进行实时检测，检出限为0.04U/mL (Anal.Chem.,2012,84,5059–5065)。然而上述报道的这些方法都存在一些缺点， 如反应时间过长，需要对核酸探针进行荧光基团以及猝灭基团的双标记或者需要外 加猝灭材料，灵敏度低、选择性差等，大大地增加了实验体系的复杂性以及成本， 从而限制了检测方法的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有检测核酸外切酶III活性的方法存在 的问题，提供一种基于光诱导电子转移荧光法简单、灵敏检测核酸外切酶III活性 及的探针，以及该探针在核酸外切酶III活性检测和抑制剂筛选中的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：该探针是从5'端到3'端由3～6个重复 的CG碱基序列构成的DNA，优选从5'端到3'端由4个重复的CG碱基序列构成的 DNA，且3'端标记荧光基团。

上述荧光基团为6-羧基荧光素、羧基四甲基罗丹明、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧 基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料、 7-氨基-4-甲基香豆素、二乙胺基香豆素、萘并荧光素中的任意一种。

本发明探针在检测核酸外切酶III活性中的应用，具体检测方法由下述步骤组 成：

1、将探针溶解于含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的pH值为7.4的Tris-HCl 缓冲溶液中，使Tris-HCl缓冲溶液中探针的浓度为1x10^-4mol/L，然后将其在90℃ 保温10分钟，再自然降温至室温并孵育30分钟，得到杂交后的探针。

2、用含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液 将杂交后的探针稀释至浓度为0.1～10μmol/L，然后加入不同活性的核酸外切酶III， 在37℃下孵育10～50分钟，用荧光光谱仪检测不同活性下核酸外切酶III对应的 荧光强度，绘制荧光强度随核酸外切酶III活性变化的标准曲线。

3、按照步骤2的方法检测待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即 可确定待测样品中核酸外切酶III的活性。

上述步骤2中，优选用Tris-HCl缓冲溶液将杂交后的探针稀释至浓度为 0.2μmol/L，然后加入不同活性的核酸外切酶III，在37℃下孵育40分钟，用荧光 光谱仪检测不同活性下核酸外切酶III对应的荧光强度，绘制荧光强度随核酸外切 酶III活性变化的标准曲线。

本发明探针在核酸外切酶III抑制剂筛选中的应用，具体检测方法为：向60μL 浓度为0.2μmol/L杂交后的探针中加入30μL活性为5U/mL核酸外切酶III和30μL 不同的抑制剂，在37℃下孵育40分钟，其中核酸外切酶III和抑制剂均用含有5 mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液配制成 溶液；然后用荧光光谱仪检测不同抑制剂对应体系的荧光强度，荧光强度越小，说 明抑制剂对核酸外切酶III的抑制效果越强。

本发明利用核酸外切酶III能沿双链DNA的3'→5'方向逐步催化去除单核苷酸， 但是对单链DNA或者单核苷酸不起作用的原理，设计合成了一种结构简单的探针， 该探针在缓冲溶液中能自组装成为双链DNA，G碱基与荧光基团之间发生光电子 诱导转移，使荧光被熄灭，当检测体系中含有核酸外切酶III时，核酸外切酶III沿 着探针的3'端作用，使荧光基团和DNA分离开游离在溶液中，荧光基团的荧光得 以恢复，通过检测体系的荧光强度即可实现核酸外切酶III活性的定量检测。采用 本发明探针检测核酸外切酶III活性的方法简单、快捷、选择性好、灵敏度高，检 出限可达到5×10^-4U/mL。本发明探针还可用于核酸外切酶III抑制剂的筛选。

附图说明

图1是不同活性核酸外切酶III对应体系的荧光发射光谱。

图2是活性为5×10^-4～1×10^-1U/mL的核酸外切酶III对应体系的荧光强度变化 曲线。

图3是活性为1×10^-1～5U/mL的核酸外切酶III对应体系的荧光强度变化曲线。

图4是不同浓度金精三羧酸对核酸外切酶III活性的影响。

图5是基于光诱导电子转移机理检测核酸外切酶III的原理验证图。

图6是杂交后的探针长度对检测体系的影响。

图7是杂交后的探针浓度对检测体系的影响。

图8是杂交后的探针和核酸外切酶III作用时间对检测体系的影响。

图9是杂交后的探针对不同酶的选择性检测结果。

图10是杂交后的探针对细胞裂解缓冲液(a)、海拉细胞裂解液(b)、海拉细 胞裂解液与抑制剂ATA(c)的检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限 于这些实施例。

实施例1

本实施例中检测核酸外切酶III活性的探针是碱基序列为5'-CGCGCGCG-3'的 DNA，且3'端用6-羧基荧光素(FAM)标记，由生工生物工程有限公司合成。

上述探针在检测核酸外切酶III活性中的应用，检测方法由下述步骤组成：

1、将探针溶解于含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4 的Tris-HCl缓冲溶液中，使Tris-HCl缓冲溶液中探针的浓度为1x10^-4mol/L，然后将 其在90℃保温10分钟，再自然降温至室温并孵育30分钟，得到杂交后的探针。

2、用含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4的Tris-HCl 缓冲溶液将杂交后的探针稀释至浓度为0.2μmol/L；向60μL浓度为0.2μmol/L杂 交后的探针中分别加入60μL活性为5×10^-4、1×10^-3、2×10^-3、5×10^-3、1×10^-2、2×10^-2、 5×10^-2、1×10^-1、2×10^-1、5×10^-1、1、2、5U/mL核酸外切酶III(购自宝生物工程(大 连)有限公司，用含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4的 Tris-HCl缓冲溶液配制成溶液)，在37℃下孵育40分钟，用FL-4600型荧光分光 光度计在最大激发波长为490nm、发射波长为518nm处检测不同活性下核酸外切 酶III对应的荧光强度(激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm)，结果见图1，并 绘制荧光强度随核酸外切酶III活性变化的标准曲线，结果见图2～3。

如图1所示，随着核酸外切酶III的活性逐渐增大，体系的荧光强度逐渐增强； 由图2～3可见，在5×10^-4～5U/mL活性范围内，体系的荧光强度与核酸外切酶III 的活性呈线性关系，其中核酸外切酶III活性为5×10^-4～1×10^-1U/mL时，荧光强度 与核酸外切酶III活性变化的线性方程为F＝76.76+6322.75C，核酸外切酶III活性为 1×10^-1～5U/mL时，荧光强度与核酸外切酶III活性变化的线性方程为 F＝694.16+59.75C，式中F为体系的荧光强度，C为核酸外切酶III活性，相关系数 R分别为0.9975与0.9994，由相关系数可见，荧光强度与核酸外切酶III活性的线 性关系很好。

3、按照步骤2的方法检测待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即 可确定待测样品中核酸外切酶III的活性。

实施例2

实施例1的探针在核酸外切酶III抑制剂筛选中的应用，具体方法如下：

向60μL浓度为0.2μmol/L杂交后的探针中分别加入30μL活性为5U/mL核酸 外切酶III(购自宝生物工程(大连)有限公司)和30μL浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0、20.0mmol/L金精三羧酸(ATA)，在37℃下孵育40分钟，其中核酸外 切酶III和ATA均用含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4 的Tris-HCl缓冲溶液配制成溶液。其他步骤与实施例1相同，结果见图4。从图4 中可以看出，在固定核酸外切酶III活性情况下，随着ATA浓度的加大，体系的荧 光强度逐渐降低，这说明随着抑制剂ATA的浓度越来越大，核酸外切酶III活性逐 渐降低。当ATA的浓度为1.08μmol/L时，体系的荧光强度降低一半，抑制效率达 到50％。该结果表明本发明方法能够应用于核酸外切酶III抑制剂的筛选。

为了确定本发明的最佳技术方案，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体 实验情况如下：

1、基于光诱导电子转移机理检测核酸外切酶III的原理验证

如图5所示，当没有核酸外切酶III时(曲线a)，富G序列可以代替传统的熄 灭基团与3'端标记的荧光基团发生光电子诱导转移效应，从而导致荧光基团的大部 分荧光被猝灭。当有核酸外切酶III存在时(曲线b，核酸外切酶III活性为5U/mL)， 核酸外切酶III能沿杂交后的探针的3'→5'方向逐步催化水解成单核苷酸，使荧光分 子和DNA分离开游离在溶液中，荧光基团的荧光得以恢复。而当加入高温失活的 核酸外切酶III后(曲线c)，荧光信号值与没有核酸外切酶III的结果几乎一致，证 明了实验结果的可靠性。

2、确定杂交后的探针长度

分别设计合成碱基序列为5'-CGCGCG-3'(记为6bp，其TM温度为20.0℃)、 5'-CGCGCGCG-3'(记为8bp，其TM温度为40.8℃)、5'-CGCGCGCGCG-3'(记为 10bp，其TM温度为53.3℃)、5'-CGCGCGCGCGCG-3'(记为12bp，其TM温度为 61.6℃)、5'-CGCGCGCGCGCGCG-3'(记为14bp，其TM温度为67.6℃)的DNA， 且3'端用FAM标记，作为探针。按照实施例1的方法采用上述探针检测活性为 0.1U/mL的核酸外切酶III。从图6中可以看出，探针长度为4个重复的CG碱基 序列时，信噪比最佳，再结合探针的TM温度，本发明最佳选择探针从5'端到3'端 由4个重复的CG碱基序列构成的DNA。

3、确定杂交后的探针浓度

用含有5mmol/LMg²⁺和50mmol/LNa⁺的20mmol/LpH值为7.4的Tris-HCl 缓冲溶液分别将杂交后的探针稀释至浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0μmol/L，按照 实施例1的方法检测活性为0.1U/mL的核酸外切酶III，结果如图7所示。由图7 可见，当杂交后的探针浓度为0.2μmol/L时，F/F₀值最大。因此，本发明最佳选择 将杂交后的探针稀释至浓度为0.2μmol/L进行核酸外切酶III活性的检测。

4、确定探针与核酸外切酶III作用时间

采用实施例1的探针，在较低的核酸外切酶III(0.1U/mL)活性下，研究时间 的变化对检测体系的荧光强度的影响，结果见图8。实验结果表明，随着反应时间 的增加，检测体系的荧光强度逐渐增强并在大约40分钟左右体系的荧光强度基本 上不再发生变化。因此，本发明选择核酸外切酶III的作用时间为40分钟。另外从 图8中我们可以看出，反应在10分钟后信噪比就达到了将近6倍，说明了该反应 体系的时效性很强，很大程度地缩短了检测时间。

5、选择性

为了考察本发明探针的选择性，发明人按照实施例1的方法分别对核酸外切酶 III(ExoIII)、核酸外切酶I(ExoI)、脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、尿嘧啶-DNA 糖基化酶(UDG)、T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)进行检测，酶的活性均为0.05U/mL。 如图9所示，核酸外切酶III能够明显地降低体系的荧光强度，而其他的酶对体系 的荧光强度基本上没有影响。由此可见，本发明探针和检测方法具有很好的选择性， 不受其他酶的干扰。

为了验证本发明方法在实际血样中的应用效果，发明人采用实施例1的探针对 人血清进行了核酸外切酶III标准加入回收实验，结果见表1。同时对发明人对细胞 裂解缓冲液、海拉细胞裂解液、海拉细胞裂解液与抑制剂ATA分别进行了检测， 结果见图10。

表1在血样中检测核酸外切酶III活性

由表1可见，核酸外切酶III的回收率为91％～105％，相对标准偏差RSD＜1％ (n＝3)，进一步验证了该方法的抗干扰能力很强。

由图10可见，由于细胞裂解缓冲液中不含核酸外切酶III酶，大部分荧光被猝 灭(曲线a)，当加入1μL海拉细胞裂解液时(曲线b)，荧光基团的荧光得以恢复。 而当同时加入海拉细胞裂解液以及抑制剂ATA后(曲线c)，荧光信号值与空白组 几乎一致，证明了海拉细胞内存在一定含量的核酸外切酶III。进一步说明了本发明 检测体系的实用性。