高活性纤维二糖水解酶的制备方法及高活性纤维二糖水解酶

摘要

本发明的课题在于提供一种高活性的纤维二糖水解酶。通过将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸，可以提高纤维二糖水解酶的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物炼制(biorefinery)的糖化酶。特别是涉及提高了活性的纤维二糖水解酶的制备方法以及具有高活性的纤维二糖水解酶。

背景技术

通过基因重组技术，能够进行各种各样的蛋白质改性。针对酶也进行了提高活性、增加表达量等增强酶活性的尝试。采取如下手法作为提高酶活性的手法：改变氨基酸，向酶与底物结合的活性中心的氨基酸导入变异，从中选择高活性的酶。

酶的底物结合部位在大多数情况下被比作钥匙-锁状。另一方面，人们已知在对纤维素等高分子底物起作用的酶当中，虽然仅限于极少部分的酶，但它们为具有高分子底物嵌入的隧道状或沟状的相对较长的底物结合部位的酶。

从端部切断纤维素链的酶、即外切葡聚糖酶的反应产物是纤维二糖，也被称为纤维二糖水解酶。纤维二糖水解酶的活性中心形成如上所述的隧道状，通过酶反应而被切断的纤维二糖从隧道的相反一侧出来，因此，酶反应持续进行，而纤维二糖水解酶不会从纤维素链脱离。

至今为止一直在进行提高纤维二糖水解酶的酶活性的尝试，并已经报道了几种变异体。例如，篮状菌(Talaromyces)相关的变异体(参照美国专利第8790894号说明书)、来源于革菌(Phanerochaete)的纤维二糖水解酶的变异体相关的变异体(参照日本专利公开公报特开2010-046034号公报)等。

发明内容

然而，在生物炼制领域中需要一种更高效的酶，而在现有技术中活性提高的效果并不充分。因此，有必要制备一种活性更高的纤维二糖水解酶变异体。

更进一步，像纤维二糖水解酶那样，在保持高分子底物的同时进行催化反应的进行性酶(processiveenzyme)在大范围上存在的部位构成底物结合部位，因此，还大量存在其效果没有得到研究的氨基酸。因此，本发明的课题在于对未被研究的氨基酸部位的置换效果进行调查，获取一种具备较高活性的纤维二糖水解酶。

本发明的制备提高了活性的纤维二糖水解酶的方法的特征在于：将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸。

使用作为确定影响蛋白质功能的部位的一方法的丙氨酸扫描(Alanine-scanning)进行解析后发现：通过将作为由序列号1所示的纤维二糖水解酶的第62位氨基酸的天门冬酰胺置换为丙氨酸，能够获得一种具备高活性的纤维二糖水解酶。该氨基酸残基位于纤维二糖水解酶的隧道结构内。

因此，可以推测只要是与由序列号1所示的纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶，通过将与该位置对应的位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸，同样能够获得高活性的纤维二糖水解酶。

另外，本发明的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于具备下述变异：将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸。

将序列号1所示的序列的第62位的天门冬酰胺置换为丙氨酸后的纤维二糖水解酶具有高活性。因此，通过将第62位的天门冬酰胺或者对应于该位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸后的变异体、或者除了包括该置换还进一步组合已知酶活性增强的氨基酸置换，能够获得活性更高的纤维二糖水解酶。

本发明的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于，其序列由序列号2所示。由序列号2所示的纤维二糖水解酶与野生型酶相比具有12倍的比活。

附图说明

图1为示意性地表示纤维二糖水解酶的立体结构以及表示各氨基酸残基(aminoacidresidue)位置的图。

图2为表示利用丙氨酸扫描(alaninescanning)获得的纤维二糖水解酶变异体相对野生型的相对活性比的图。

图3为表示通过置换了从N末端起第62位的氨基酸后相对野生型的相对活性比的图。

具体实施方式

人们已知纤维二糖水解酶的晶体结构。纤维二糖水解酶与作为底物的纤维素相互作用的部位受长环(loop)包围，因而被称为隧道结构。与纤维素结合并发生分解反应的活性中心位于隧道结构内部。所以，可以认为通过获得隧道结构内的氨基酸具有变异的酶，就能够获得高活性变异体。

然而，由于隧道结构跨越了大范围，要对与底物结合并影响活性的氨基酸都进行解析是比较困难的。因此，基于立体结构，选择预测存在于隧道结构内、并且对相对作为底物的纤维素的移动构成障碍从而影响活性的可能性较高的氨基酸，通过丙氨酸扫描进行解析。首先，为了导入变异，分离纤维二糖水解酶基因，构建通过米曲霉(Aspergillusoryzae)表达的载体。

(1)构建通过米曲霉表达纤维二糖水解酶的载体(vector)(提取纤维顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)的基因组DNA)将纤维顶孢霉的H1菌株(FERMBP-11508，以下简称“H1菌株”)接种到PDB琼脂培养基(在PDA培养基(BDDifco公司制，PDAbroth)中添加了1.5％(质量/体积)的琼脂糖(agarose)的平板培养基)上，在30℃下培养一周。将得到的菌体以每个琼脂直径5mm为单位进行切取，并接种于PDA培养基中，以30℃下、130rpm进行摇瓶培养(shakingculture)。以15000rpm对培养物进行10分钟离心分离处理，由此回收菌体。更进一步，通过PDA培养基重复清洗回收的菌体两次，从而获取菌体试样。

在装入有该菌体的2mL容量的塑料试管中加入研磨珠，利用台式珠磨粉碎机(Shakemaster，生物科学社制)实施90秒的粉碎处理三次，将菌体试样磨成粉末状后，使用Nucleon(Amersham公司制)提取DNA。

(纤维顶孢霉的野生型纤维二糖水解酶的DNA克隆)

将获得的基因组作为模板，使用序列号3、4(参照下述表1)所示的引物(primer)1、2，通过PCR扩增编码野生型的纤维二糖水解酶的序列。使用KOD-plus(东洋纺公司制备)作为DNA聚合酶(DNApolymerase)，PCR通过以下方式进行，以94℃、2分钟进行1个循环后，以96℃、20秒，接着60℃、30秒，进一步72℃、5分钟进行30个循环。得到的PCR产物利用QIA快速PCR产物纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit，QIAGEN公司制备)进行提纯。得到的纤维顶孢霉的野生型纤维二糖水解酶的氨基酸序列示于序列号1。

(pBR-enoAP-agdAT-niaD的制备)

在作为大肠杆菌质粒(E.coliplasmid)的pBR322中整合来源于米曲霉Aspergillusoryzae的硝酸还原酶基因niaD、来源于米曲霉的agdA基因的终止区(terminatorregion)以及来源于米曲霉的enoA基因的启动区(promoterregion)，制成载体pBR-enoAP-agdAT-niaD。通过表达硝酸还原酶基因niaD，能够选择导入了使得即使在硝酸存在的情况下米曲霉也能够增殖的质粒(plasmid)的菌。以下简述制备方法。

首先，构建整合了来源于米曲霉Aspergillusoryzae的硝酸还原酶基因niaD基因的质粒。通过独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)获取米曲霉AspergillusoryzaeRIB40菌株(NBRC号：100959，以下称为“RIB40菌株”)。以RIB40菌株的基因组DNA为模板，使用序列号5、6所示的引物3、4，通过PCR对硝酸还原酶基因niaD的DNA进行扩增。

通过AvaI及NdeI对扩增后的niaD的DNA进行消化，提纯后，将其插入到pBR322的AvaI、NdeI位点，构建pBR-niaD。

接着，来源于米曲霉的agdA基因的终止区整合到pBR-niaD中。

以RIB40菌株的基因组DNA为模板，使用序列号7、8所示的引物5、6，通过PCR对来源于米曲霉的agdA基因的终止区(以下有时还称为“agdA终止子”)的DNA进行扩增。

使用限制酶SalI及AvaI消化得到的PCR扩增产物，并将其插入到pBR-niaD的SalI、AvaI位点，得到pBR-agdAT-niaD质粒。

接着，将来源于米曲霉的enoA基因的启动区整合到所得到的pBR-agdAT-niaD中。

以RIB40菌株的基因组DNA为模板，使用序列号9、10所示的引物7、8，进行PCR，对来源于米曲霉的enoA基因的启动区(以下有时还称为“enoA启动子”)的DNA进行扩增。

使用限制酶NheI及SalI消化得到的PCR扩增产物，并将其插入到pBR-agdAT-niaD的NheI、SalI位点，得到pBR-enoAP-agdAT-agdAT-niaD质粒。

[表1]

引物编号碱基序列5’→3’序列号备注1tcctccaagt tacccatgtc tgccttgaac tctttc3纤维二糖水解酶

2cgcttcgtcg accccctaca aacattgaga gtagtaaggg4纤维二糖水解酶3atgctcggga gctttggatt tcctacgtct tc5niaD4atgcatatgt cgagagtgtt gtgtgggtca acg6niaD5atggtcgacg aagcgtaaca ggatagccta gac7agdA终止子6atgcccgaga gtaacccatt cccggttctc tag8agdA终止子7atggctagca gatctcgcgg cagggttgac9enoA启动子8atggtcgacc ccgggtaact tggaggacgg aagaaaagag10enoA启动子

(野生型纤维二糖水解酶DNA向pBR-enoAP-agdAT-niaD的整合)

使用限制酶SmaI消化pBR-enoAP-agdAT-niaD，获得pBR-enoAP-agdAT-niaD的SmaI处理片段。

使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(Clontech公司制)将编码野生型纤维二糖水解酶的序列克隆到该SmaI处理片段上，获得pBR-enoAP-CBH-agdAT-niaD(CBH米曲霉表达用载体)

(变异型纤维二糖水解酶DNA向pBR-enoAP-agdAT-niaD的整合)

对于变异型纤维二糖水解酶，通过PCR制备纤维二糖水解酶基因的从5’一侧到变异位点以及从变异位点到基因3’一侧的两个片段。通过将所得到的两个片段的DNA整合到pBR-enoAP-agdAT-niaD中来进行构建。此时，由于包含变异位点的引物被设计成能够进行退火(annealing)，变异型纤维二糖水解酶基因除了在整合到pBR-enoAP-agdAT-niaD中时包含变异位点之外，具有从5’一侧到3’一侧与野生型纤维二糖水解酶相同的氨基酸序列，并处于相连状态。

实施例

(实施例1)

(丙氨酸置换变异体的制作)

以纤维顶孢霉的纤维二糖水解酶的立体结构为基础，将位于具备由序列号1所示的氨基酸序列的、来源于顶孢霉属(Acremonium)的纤维二糖水解酶的隧道结构内的30处的氨基酸置换为丙氨酸，解析其活性，选择酶活性提高的位点。在30处的置换中，有6处与野生型纤维二糖水解酶相比活性有所提高。

通过丙氨酸置换，活性略有提高的有：序列号1所示的氨基酸的第203位的赖氨酸(lysine)(K)、第62位的天门冬酰胺(asparagine)(N)、第125位的天门冬酰胺、第201位的天门冬氨酸(D)、第289位的精氨酸(arginine)(R)以及第281位的天门冬氨酸(各变异体根据置换了的氨基酸及其位置有时还分别表示成K203A、N062A、N125A、D201A、R289A、D281A)。

图1中示出了通过PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)获取的纤维顶孢霉的纤维二糖水解酶的立体结构以及因丙氨酸置换而使得活性提高的上述氨基酸的位置。在隧道结构的整个长度上具有通过丙氨酸置换提高活性的位点。

针对上述6个变异体，将制作时用到的引物表示到下表2中。使用所述纤维二糖水解酶的克隆中用到的引物1与引物9～14，以及引物15～20与纤维二糖水解酶的克隆中用到的引物2分别作为各个引物组，其余的以与野生型纤维二糖水解酶的基因组DNA的扩增相同的方式进行PCR。

[表2]

引物编号碱基序列5’→3’序列号备注9gatgaaggcc aagtcacgag ggcattgaga11K203A10acgccaggcg gcatctaacg taatggcacc12N062A11tccgacggcg gaaccggtaa cgaagttcag13N125A12cttcaaggca cgagggcatt gagagtcaca14D201A13accaagggcg taagggttga agtcacatcc15R289A14acatccggca gggtcgcagg taccggcgta16D281A

15gacttggcct tcatcgctgg tcaggccaac17K203A16gatgccgcct ggcgttgggt ccatggtgtc18N062A17ggttccgccg tcggatctcg tacttacctg19N125A18cctcgtgcct tgaagttcat cgctggtcag20D201A19ccttacgccc ttggtgtcac tgacttctac21R289A20gaccctgccg gatgtgactt caacccttac22D281A

(导入了野生型及变异型纤维二糖水解酶米曲霉表达用载体的米曲霉转化体的制作)

通过特定的方法PEG-钙法(Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99～104(1989年))，使用整合了上述野生型纤维二糖水解酶的pBR-enoAP-agdAT-niaD质粒或者导入了变异的质粒，对300棵米曲霉AspergillusoryzaeniaD菌株(从独立行政法人酒类综合研究所获取的niaD缺陷型菌株)进行转化。通过对用察氏(Czapek–Dox)培养基(其中，糊精(dextrin)3％(质量/体积)；磷酸氢二钾0.1％(质量/体积)；硫酸镁0.05％(质量/体积)；硫酸铁0.001％(质量/体积)；硝酸钠0.3％(质量/体积))选择能够进行增殖的菌株，获得转化体(野生型及变异型纤维二糖水解酶米曲霉转化体)。

(纤维二糖水解酶的制备)

使制作的纤维二糖水解酶米曲霉转化株在察氏培养基中形成孢子，并用灭菌水回收孢子。在装入500mL容量锥形瓶中的100mL的PD液体培养基(其中，糊精2％(质量/体积)；多聚蛋白胨(polypeptone)1％(质量/体积)；酪蛋白氨基酸(casaminoacid)0.1％(质量/体积)；磷酸氢二钾0.5％(质量/体积)；硫酸镁0.05％(质量/体积)；硝酸钠0.1％(质量/体积))中进行接种，使得最终孢子浓度成为1×10⁴/mL。在30℃下进行液体培养三天，使培养基中分泌表达纤维二糖水解酶或具有氨基酸变异的纤维二糖水解酶。并将培养后的该培养液作为酶试样。该酶试样通过SDS-PAGE解析进行确认，并进行蛋白质定量。

(纤维素分解活性的测定)

使用微晶纤维素(默克公司(MerckKGaA)制备)作为反应底物。另外，根据用200mM醋酸缓冲液(aceticacidbuffersolution)适当稀释10mM(mmol/L)葡萄糖溶液配制而成的四点稀释组(4-pointdilutionseries，0.5～5.0mM)的测定值，制成标准曲线。

首先，在1.5mL容量的塑料试管中加入40μL的200mM醋酸缓冲液(pH5.5)和50μL悬浊于200mM醋酸缓冲液的4％(质量/体积)微晶纤维素悬浊液，充分混合后，调整到50℃。

接着，将10μL野生型或各变异型(K203A、N062A、N125A、D201A、R289A、D281A)纤维二糖水解酶水溶液添加到各试管中，开始酶反应。在反应开始经过一个小时后，添加混合100μL的DNSA溶液(其中，氢氧化钠1.6％(质量/体积)；3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylicacid)0.5％(质量/体积)；四水合酒石酸钠钾(Potassiumsodiumtartratetetrahydrate)30％(质量/体积))，从而停止反应。在反应停止后，进行离心分离(15,000×g，5分钟)，在100℃下，煮沸上清液(supernatant)5分钟，然后在冰中冷却。然后，从各试管中分取100μL的反应液，并用100μL的蒸馏水稀释，再测定稀释后的溶液在540nm的吸光度(A₅₄₀)。采用添加20mM醋酸缓冲液来取代酶试样并进行相同处理的试样作为空白对照(blank)。根据A₅₄₀的测定值和标准曲线计算出葡萄糖浓度，该浓度除以通过蛋白质定量获得的酶浓度，算得酶单位重量的纤维素分解活性值。结果示于图2。

图2中示出了与野生型(WT)相比活性提高了的变异体K203A、N062A、N125A、D201A、R289A、D281A的结果。特别是将第62位的天门冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)的变异体N062A相对野生型的纤维二糖水解酶具有14倍的比活(specificactivity)。其与现有技术中公开的纤维二糖水解酶变异体相比，也是显著高的活性。

(实施例2)

由于将第62位的天门冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)的变异体N062A与野生型的纤维二糖水解酶相比活性提高，将第62位的氨基酸置换为疏水性、酸性、碱性等性质不同的氨基酸，并测定了其活性。

制作中用到的引物示于下表3中。使用所述纤维二糖水解酶的克隆中用到的引物1与引物21～27、以及引物28～34与纤维二糖水解酶的克隆中用到的引物2分别作为各个引物组，其余的以与野生型纤维二糖水解酶的基因组DNA的扩增相同的方式进行PCR。

[表3]

引物编号碱基序列5’→3’序列号备注21acgccaccag gcatctaacg taatggcacc23N062W22acgccagacg gcatctaacg taatggcacc24N062V23acgccaggag gcatctaacg taatggcacc25N062S24acgccactgg gcatctaacg taatggcacc26N062Q25acgccactcg gcatctaacg taatggcacc27N062E26acgccacttg gcatctaacg taatggcacc28N062K27acgccaatgg gcatctaacg taatggcacc29N062H28gatgcctggt ggcgttgggt ccatggtgtc30N062W29gatgccgtct ggcgttgggt ccatggtgtc31N062V30gatgcctcct ggcgttgggt ccatggtgtc32N062S31gatgcccagt ggcgttgggt ccatggtgtc33N062Q32gatgccgagt ggcgttgggt ccatggtgtc34N062E33gatgccaagt ggcgttgggt ccatggtgtc35N062K34gatgcccatt ggcgttgggt ccatggtgtc36N062H

在构建质粒后，以与实施例1相同的方式得到纤维二糖水解酶米曲霉转化株，并得到变异体酶，测定玉米秸秆(cornstover)分解活性。

(玉米秸秆分解活性的测定)

在将作为木质纤维素类生物质的稻杆细微粉碎后的物质中，以质量比成为1:10的方式混合2.5％(质量/质量)的硫酸水溶液，在150℃的温度下维持10分钟，进行糖化预处理后，使用氢氧化钠水溶液将pH值调节到5.8，在50℃下干燥一天。然后，将用榔头细微粉碎后的物质作为活性测定的反应底物使用。

活性测定通过以下方式进行：在1.5mL容量的塑料试管中加入80μL的200mM醋酸缓冲液(pH5.5)和100μL悬浊于200mM醋酸缓冲液的4％(质量/体积)玉米秸秆悬浊液，充分混合后，调整到50℃。

接着，添加20μL的野生型或各变异型纤维二糖水解酶水溶液，开始酶反应，并在反应开始经过一小时后，在15,000×g、4℃下进行5分钟离心分离处理。将获得的上清液移至新的1.5mL容量的塑料试管，在95℃下热处理5分钟后，在15,000×g、4℃下进行5分钟离心分离处理。将获得的上清液移至新的1.5mL体积的塑料试管后，用0.2μm(13mm盘式)的过滤器过滤。将0.2mL的滤液移至小瓶(vial)中，进行HPLC测定，对纤维二糖进行检测。使用和光纯药公司制的纤维二糖作为标准物质，进行糖浓度的评价。HPLC测定中使用Waters2695(Waters公司制造)作为分离器(separator)，使用Waters2414(Waters公司制造)作为RI检测器，使用Bio-radHPX-87H(Bio-Rad公司制造)作为分析柱(Column)。使用超纯水作为洗脱剂，并按照以下条件进行测定：流速为0.6mL/分钟；分析柱温度为80℃；检测器温度为40℃。测定结果示于图3。

与野生型(天门冬酰胺(N))相比，所发现的活性有所提高的是丙氨酸(A)、谷氨酰胺(glutamine，Q)及组氨酸(histidine，H)。在丙氨酸的情况下，使用玉米秸秆代替底物测定糖化时，与野生型(N)相比具有12倍以上的比活。

而置换为下述各种性质的氨基酸时则没有超过丙氨酸置换所获得的活性提高程度的氨基酸：疏水性氨基酸(色氨酸(tryptophan)(W)、缬氨酸(valine，V))、中性氨基酸(丝氨酸(serine，S)、谷氨酰胺(Q))、酸性氨基酸(谷氨酸(glutamicacid，E))、碱性氨基酸(basicaminoacid)(赖氨酸(K)、组氨酸(H))。

可以推测通过丙氨酸置换而使得活性提高的理由是，隧道结构内的纤维素移动时的空间位阻被消除。除了将第62位的天门冬酰胺置换为丙氨酸之外，所发现的在本发明中提高活性的其他变异、例如通过将第203位的赖氨酸或第289位的精氨酸同时置换为丙氨酸，有望获得具有更高活性的变异体。

如实施例1及实施例2所示，将记载于序列号2的第62位的天门冬酰胺置换为丙氨酸的纤维二糖水解酶变异体与野生型纤维二糖水解酶相比具有较高的活性。

纤维二糖水解酶是被分类于糖苷水解酶(glycosidehydrolases)GH7家族的酶。在属于GH7的酶中，位于隧道结构的氨基酸跨越种类而被很好地保存。实际上，在里氏木霉(Trichodermareesei)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)中，在对应于序列号1的第62位的位置的氨基酸为天门冬酰胺。所以，不仅是由序列号1所示的纤维二糖水解酶，通过将在同源的氨基酸序列中处于该位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸，也有望获得提高了活性的酶。

另外，隧道结构是跨越种类而被保存，因此通过同时导入所报道的纤维二糖水解酶活性得到提高的其他氨基酸变异，能够期待活性的进一步提高。